免疫细胞功能检测技术课件：细胞免疫学技术.pdf

课件5774免疫细胞功能检测技术第一节淋巴细胞的功能检测一、T细胞功能检测二、B细胞功能检测三、NK细胞活性测定课件5774课件5775第二节吞噬细胞功能检测技术一、中性粒细胞功能检测二、巨噬细胞功能检测第三节免疫细胞功能检测的临床应用思考题 小结课件5775课件5776对淋巴细胞群，中性粒细胞、巨 噬细胞、树突状细胞等功能测定可 以有效评价机体特异性和非特异性 免疫功能。课件5776课件5777第一节 淋巴细胞的功能检测淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外 实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对 抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体 外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂 原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴 细胞分泌产物的测定课件5777课件5778淋巴细胞AT细胞（负责细胞免疫功能）AB细胞（执行体液免疫功能）ANK和K细胞（非特异性免疫作用）课件5778课件5779、T细胞功能的检测AT细胞增殖试验AT细胞分泌功能测定AT细胞介导的细胞毒试验A体内试验课件5779课件5780T淋巴细胞增殖试验1.原理:刺激物淋巴细胞DNA合成母细胞分化课件5780细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松课件5781未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞-未转化的淋巴细胞淋巴母细胞 过渡型细胞大小（直径um）核大小、染色质核仁有丝分裂胞质、着色浆内空泡伪足12 20增大、疏松 清晰、14个 有或无 增多、嗜碱 有或无 有或无12 16增大、疏松 有或无 无增多、嗜碱 有或无 有或无68不增大、密集无无极少、天青色无无课件5781课件57822.淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：PHA-T细胞ConA-T细胞PWM-T、B 细胞LPS-B细胞特异性刺激物：异种抗原同种组织抗原课件5782课件57833.检测方法形态法：刺激物一 淋巴细胞（4-6天厂一 母细胞-同位素法：PHA 麻巴细胞（54h）DNA合成期+3 HTdR掺入收集弱胞检测B射线测定细胞内的3 H-TdR课件5783课件5784(1)形态学检查法转化率=转化的淋巴细胞数转化和未转化的淋巴细数xlOO%图15-1淋巴细胞转化的形态特征示意图课件5784课件5785方法学评价:优点：形态学方法简便易行，普通光 学显微镜便能观察结果，适于基层实验 室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和 准确性较差。课件5785课件5786(2)3 H-TdR掺入法ST试验孔A 570nm均值 一对照孔A 57。.均值A优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性 强，重复性好。A缺点：但需一定设备条件，同时还存在 放射性核素污染问题。课件5786课件5787（二）T细胞分泌功能测定体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺 激后，分泌各种细胞因子，可借助免疫学、细胞 生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含 量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细 胞功能。课件5787课件5788（三）T细胞介导的细胞毒试验1.原理:靶细胞抗原T细胞 一,致敏CTL靶细胞观察杀伤活力课件5788课件57892.方法形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞 同位素法：淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞肿瘤细胞破释放测定丫射线意义：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力课件5789课件5790Noeffector cells=backgroundEffector/targetratio1:1Effector/target ratio 5:1Effector/target ratio 20:1；r Maximal cell lysis +Triton 图15-2 T细胞细胞毒试验示意图课件5790课件5791（四）体内试验A特异性抗原皮肤试验APHA皮肤试验课件5791课件5792二、B细胞功能检测AB细胞增殖能力的试验A溶血空斑试验AB细胞抗体形成功能的检测体内试验课件5792课件5793（一）B细胞增殖能力的试验抗IgM 细菌脂多糖-B细胞增殖SAC的SPA J r形态学3H-TdR掺入法课件5793课件5794（二）1.原理：溶血空斑试验Sheep erythrocytes coated with anti-lg serum课件5794课件57952.方法学：经典溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验课件5795课件57963.临床应用与评价A溶血空斑试验主要用于测定药物和 手术等因素对体液免疫功能的影响 A评价免疫治疗或免疫重建后机体产 生抗体的能力。课件5796课件5797（三）B细胞抗体形成功能的检测酶联免疫斑点法L原理:Antigen-coatedPetri dish7八/WyYYYYYAcyWashingWashing+Ab-producing B cellsEnzyme-linked anti-lg antibodiesGel with chromogenic substratey课件5797课件57982.应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检 测抗体分泌量。A优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量;可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。课件5798课件5799（四）体内试验A体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球苗等。A将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后U2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判 断受检者体内B细胞的功能。课件5799课件5800三、NK细胞活性测定染色计数A形态法酶释法 A荧光法A同位素法化学发光法靶细胞溶解离心取上清 测LDH或AKP离心取沉淀 测活细胞荧光测CPM值常用靶细胞：K562细胞株测发光强度课件5800课件5801第二节吞噬细胞功能检测技术吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。一、中性粒细胞功能检测技术二、巨噬细胞功能检测技术课件5801课件5802吞噬细胞的功能:趋化吞噬胞内杀灭作用课件5802课件5803、中性粒细胞功能的检测细胞趋化功能的检测吞噬和杀菌功能的检测课件5803课件5804(-)细胞运动功能趋化功能检测1.原理:BC课件5804课件58052.方法学：滤膜渗透法（Boyden小室法）琼脂糖平板法ABC课件5805课件5806(二)吞噬和杀菌功能测定1.显微镜检查法:吞噬率)=吞噬细菌的白细胞数 计数的白细胞数*杀菌率)=鬻鬻鬻尊XI。计数的白细胞数课件5806课件58072.溶菌法杀菌率)=(1-作用0、60或90111,菌落数0 min菌落数*3.NBT还原试验课件5807课件5808二、巨噬细胞功能检测（一）炭粒廓清试验正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭 粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。课件5808课件5809(二)吞噬功能检测巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很 强的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒,用斑蠡敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔 渗出液获得鼠巨噬细胞。课件5809课件5810（三）巨噬细胞溶酶体酶的测定1.酸性磷酸酶的测定硝酸铅法偶氮法2.非特异性酯酶的测定 常用a-蔡醋酸法课件5810课件5811（四）细胞毒作用测定用IFN-Y激活小鼠巨噬细胞，观察其对1251-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤活性。课件5811课件5812（五）巨噬细胞促凝血活性测定激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固,为此取已经37预温的正常兔血浆和CaC12混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置37,即时记录血浆凝固时间。课件5812课件5813第三节免疫细胞功能检测的临床应用A反映机体免疫功能状态。A肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预 后监测。A组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能 监测则有利于排斥反应的早期发现，以便 及时采取有效措施。课件5813课件5814思考题1.T细胞功能检测内容有哪些？2.什么是T细胞增殖试验的原理、刺激物及方法学?3.何谓T细胞介导的细胞毒试验的原理和方法学？4.何谓结核菌素皮肤试验？5.B细胞功能检测的方法学有哪些？6.何谓溶血空斑试验的原理和方法学？7.NK细胞活性测定的方法学有哪些？8.中性粒细胞功能检测方法学及相应原理。9.巨噬细胞功能检测方法学及相应原理。10.免疫细胞功能检测的临床应用有哪些？课件5814课件5815小结免疫细胞功能试验包括体内和体外试验。免疫细胞功 能体外试验主要根据免疫细胞的增殖活性、分泌活性 和杀伤活性等特性而进行实验设计。具体免疫细胞功能检测内容包括：淋巴细胞功能检测，包括T细胞增殖试验、T细胞分泌功能测定、T细胞介导的细胞毒试验以及体内试验；B细胞增殖试验、溶 血空斑试验、酶联免疫斑点法以及体内试验；NK细胞 活性检测方法：酶释放法、放射性核素释放法、化学 发光法、流式细胞术法等。吞噬细胞功能检测，方法有趋化功能检测、吞噬和杀菌功能测定等。课件5815