分子生物学课件：组学与医学.pdf

课件3592组学与医学Omics and Medicine课件3592课件3593组学（Omics）。是一种基于组群或集合的认识论:注重事物之间的相互联系，即事物的整体性课件3594DNA 基因组学转录IRNA 转录组学翻译I蛋白质 蛋白质组学 功能I代谢产物代谢组学课件3594后基因组学课件3595GenomeCGTCCAACTGACG TCTACAGGCHAT TTAGCGCTATAAG TATATATAGGCGA AGTCATACCTGTA ATTCGCCAGTAGT TACGTGACAGTCC GGCTATCCACCAT TACCCGGGTAT.,-Transcriptome-Proteome.-44 十DNA sequencingcDNA arrays2D-PAGE?课件3595课件3596基因组学（genomics）基因组（genome）一词是1920年Winkles从gene 和chromosome组成的，用于描述生物的全部基因 和染色体组成的概念1986年美国科学家Thomas Roderick提出了基因组学（Genomics）渥阐明整个基因组的结构、结构与功能的关系以 及基因之间相互作用的科学。课件3596课件3597基因组学包括3个不同的亚领域结构基因组学(structural genomics)功能基因组学(functional genomics)比较基因组学(comparative genomics)基因组学内容亚领域 内 容结构基因组学 整个基因组的遗传制图、物理制图及DNA测序。功能基因组学 认识、分析整个基因组所包含的基因、非基因序列及其功能。比较基因组学 比较不同物种的整个基因组，增强对各个基因组功能及发育相关性的认识。课件3597课件3598结构基因组学的主要任务是基因组作 图和大规模测序结构基因组学(structural genomics)是通过HGP的实施来完成的。HGP的内容就是制作高分辨率的人类遗传 图和物理图，最终完成人类和其它重要模 式生物全部基因组DNA序列测定，因此 HGP属于结构基因组学范畴。课件3598课件35991990年以来，开始了全球性基因组计划（1990）large-scale sequencing on model organisms（August）NIH（National Institutes of Health）begins large-scale sequencing trials on four model organisms：Mycoplasma capricolum（支原体），Escherichia coli（大肠 杆菌）Caenorhabditis elegans（线虫），Saccharomyces cerevisiae（啤酒酵母）and.课件3599课件3600(2001)Draft Sequence of Human Genome PublishedTHE HUMAN GE NOME/1、J The HGP consortium publishes its working draft in Nature(15 February),and Celera publishes its draft in Science(16 February).课件3600课件3601功能基因组学系统探讨基因的活动规律功能基因组学的主要研究内容包括基 因组的表达、基因组注释(genome annotation)基因组表达调控网络及其机 制的研究等。课件3602第一节转录组学Transcriptomics课件3602课件3603、转录组学的概述 转录组（transcriptome）指生命单元（通常是一种细胞）所能转录出来的可直接参与蛋白质翻译的mRNA（编码RNA）总和，而其他所有非编码RNA均可归为RNA组（RNome）O转录组学（transcriptomics）是在整体水平上研究细胞编码基因转录情况及转录调控规律的科学。课件3604转录组的特点转录组是动态可变的，受内外 多种因素的调节揭示不同物种、不同个体、不 同细胞、不同发育阶段及不同 生理病理状态下的基因差异表 达信息课件3604课件3605二、转录组学的研究内容目前，转录组学研究的侧重点涉及基因 转录的区域、转录因子结合位点、染色质修 饰点、DNA甲基化位点等。课件3605课件3606DNA水平转录水平转录后加工中心环节翻译水平启动子、RNA聚合酶、调节蛋白翻译后加工课件3606课件36075结合上游元件-35-10+135转录起始闭合的启动子复合体形成启动子清除开放的启动子复合体形成课件3607课件3608真核RNA聚合酶II在转录因子帮助下,形成转录起始复合物。DNA课件3608课件3609转录活化染色质的组蛋白发生改变DNA(a)Xu 4Q XutjCv、CG 40 4船Nucleosomes(a)组蛋白与DNA组成的核小体；(b)组蛋白的氨基端伸出核小体,形成组蛋白尾巴；(c)四种组蛋白组成的八聚体课件3609课件3610组蛋白的修饰直接影响染色质或核小体的结构化学修饰募集了其他调控基因转录的蛋白质，为其他功能分子与组蛋白结合搭 建了一个平台。这些理论构成了“组蛋白密码”的假说。课件3610课件3611组蛋白修饰对染色质结构与功能的影响课件3611组蛋白氨基酸残基位点修饰类型功 能H3Lys-4甲基化激活H3Lys-9甲基化染色口H3Lys-9甲基化DNA甲基化所必需H3Lys-9乙口化激活H3Ser-10磷酸化激活H3Lys-14乙口化防止Lys-9的甲基化H3Lys-79甲基化端粒沉默H4Arg-3甲基化H4Lys-5乙化装配H4Lys-12乙化装配H4Lys-16乙口化核小体装配H4Lys-16乙口化Fly X激活课件3612CpG口甲基化水平降低ACpG岛(CpG island)：CpG双核昔酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域课件3612课件3613三、转录组的研究方法：微阵列(microarray):基因表达系列分析技术(SAGE)。大规模平行信号测序系统(MPSS)课件3613课件3614(一)微阵列亦DNA芯片(GeneChip)力是大规模基因组表达谱研究的主要技术小其优点是可以同时对大量基因，甚至整个基因组 的基因表达进行对比分析力 用于大规模基因表达谱研究、快速检测基因差异 表达、鉴定致病基因或疾病相关基因课件3614课件3615cDNA芯片(GeneChip)是指将许多特定的cDNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等 对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的 荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出 定性和定量的结果。该技术亦被称作微阵列(microarray)o课件3615课件3616基因芯片的探针500,000 cells on each GeneChlpaarrayHfi.IHIILlIr一Actual strand=25 base pairs课件3616课件3617了基因芯片的杂交实验Tagged RNA fragments flushed over arrayLaser activation of fluorescent tags课件3617红色荧光（Cy3）标记的cDNA片段绿色荧光（Cy5）标记的cDNA片段激光扫描Cy5图像（绿色）重叠图像（黄色）Cy3图像（红色）课件3618计算机读取课件3619(二)SAGE。基因表达系列分析(serial analysis of gene expression,SAGE):原理：cDNA3端特定位置910bp的短序列，每一条都代表转录组中存在的一种mRNA。主要应用：全基因组基因表达分析、寻找差异基 因、发现新基因。课件3619课件3620SAGE的原理SAGE的主要依据有两个:一个910碱基的核昔酸序列标签包含有足够 的信息，能够唯一确认一种转录物。例如，一个9碱基序列能够分辨262144个不同的转 录物，而人类基因组估计仅有约3万个基因，所以 理论上每一个9碱基标签能够代表一种转录物的特征序列。课件3620课件3621。2、如果能将9个碱基的标签集中于一个克隆中进行测序，并将得到的短序列核首酸顺序以连续的数据形式输入计算机中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行分析。课件3621课件3622一常规SAGE方法的操作流程+获得能代表某一转录体特异性信息的标签(tag)约为 9 14bp;连接标签组成的DNA片段,即形成串联体(Concatemer),进行扩增后测序分析，得到代表转录体信息的标签序列;同一标签的重复次数代表该转录体的表达 水平。课件3622课件3623SAGE在生命科学中的应用SAGE是一项快捷、有效的基因表达研究技术1、动物基因组转录图谱的构建可以利用SAGE技术得到的特定的数据信息，将基因 定位在染色体上，根据基因对应的标签丰度，以染色体长 度为横轴，转录水平（标签丰度）为纵轴，绘制转录图谱,这样可以识别单纯序列信息所不能预测的基因。课件3623课件3624:.2、动物基因功能的研究*应用SAGE研究未知基因的功能是其最主要的用途 之一 j根据与未知基因表达图谱一致或相似的已知基因,可以推测该新基因的功能Knoll等用SAG E技术和蛋白质组学同时分析斑马鱼发育完全的卵泡中的基因表达，并与其 它动物卵细胞的基因表达进行比较分析，发现在27486个SAG E标签中有11339个表达水平 不同，而且鼠李糖结合凝集素、B肌动蛋白2和1个转录位点与组蛋白家族类似的3个基 因在哺乳动物卵或未受精蛋中均高度表达，推测这3个基因可能参与了动物精子和胚胎的早 期形成。I课件3624课件36253.动物发病机制的研究：疾病的发生多是由于正常的生理状态下基因表达 发生改变的结果。通过比较分析发病组织细胞和正常组织细胞中基 因表达的变化和差异，可以了解疾病发生、发展 的过程，明确疾病发生的机制课件3625课件3626上海针灸杂志2010年5月第29卷第5期 315文章编号：1005-0957(2010)05-0315-03劭物实胺针刺正常大鼠肺组织SAGE标签数据库的基因分类研究尹磊淼弋徐玉东R王宇工,刘艳艳匕张庆华3,杨永清L2(1.上海中医药大学,上海201203:2.上海市针灸经络研究所,上海200030;3.生物芯片上海国家工程研究中心,上海 201203)【摘要】目的 阐释生理状态卜.针刺对大鼠肺组织基因表达谱的影响。方法 利用正常组和针刺组的大鼠肺组织基因表达 连续分析(SAGE)标签数据库,对差异表达标签进行基因系统分类和分析。结果 正常组和针刺组相比共获得144个差异表达 标签,分属于细胞生物合成过程、细胞脂类代谢过程、物质转运等6个DAVID基因分类。结论 生理状态下针刺基础背景作 用是一个包含蛋白、酶、RNA、脂类等生物大分子合成和代谢以及物质转运的生物过程。【关键词】针刺；基因表达谱；大鼠课件3627)(三)MPSS。大规模平行信号测序系统(massively parallel signature sequencing,MPSS)MPSS是以基因测序为基础的新技术，其方法学基础是 一个标签序列(1020bp)含有能够特异识别转录子的信 息，标签序列与长的连续分子连接在一起，便于克隆和 序列分析。课件3627课件3628基本操作流程：:从生物样品中提取mRNA,将mRNA分子转换成 cDNA通过固相克隆将该cDN A均匀地加载到特制的小分子载体表面，然后在小分子载体上进行大量的PCR扩增O将所有cDNA游离的一端进行精确测序产生16至20个 碱基。每一特定序列在整个生物样品中所占的比例，就代表 了含有该cDNA基因在样品中的相对表达水平。课件3628课件3629MPSS与基因芯片技术相比较，有下列优点：可以避免在cDNA芯片技术中出现的高度同源序列 的交叉杂交，因此可以保证基因的高度特异性。MPSS的高分辨率可以检测很低表达水平的基因；。MPSS技术检测基因不需要预先知道该基因的相关 信息，可以应用于任何生物体的基因表达检测，而 cDNA芯片技术需要将已知基因片段作为探针固定 在片基上课件3629课件3630MPSS在生命科学中的应用MPSS技术是基因表达定性和定量研究的 一种有效工具它能在短时间内检测细胞或组织内全部基,I)因的表达情况，并能通过与已知基因数据库1进行比对，定量显示出基因在细胞或组织内 的表达状况CProteome Research:New Frontiers in Functional Genomics课件3638课件3639。蛋白质组（proteome）9意思是Proteins expressed by a genome（基因组表达的所有蛋白质）小细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的 所有蛋白质即蛋白质组（proteome）课件3640蛋白质组学(proteomics)以蛋白质组为研 究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表 达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用 与联系，并在整体水平上研究蛋白质调控的活动 规律，故又称为全景式蛋白质表达谱(global protein expression profile)分析。课件3641、蛋白质组学研究内容蛋白质组学的研究主要涉及两个方面：一是蛋白质组 表达模式的研究，即结构蛋白质组学（structural proteomics）；二是蛋白质组功能模式的研究，即功能蛋白 质组学（functional proteomics）。（一）蛋白质鉴定是蛋白质组学的基本任务（二）翻译后修饰的鉴定有助于蛋白质功能的阐明（三）蛋白质功能确定是蛋白质组学的根本目的课件3641课件3642生物课件3642课件3643）二、蛋白质组学的研究技术。蛋白质分离技术力凝胶双向电泳、HPLC。蛋白质鉴定技术9 Edman测序、质谱技术。图像分析与生物信息小图像分析软件，数据库。相互作用研究技术小酵母双杂交技术、免疫共沉淀、蛋白质芯片等4 4，4课件3643课件3644蛋白质组研究相关的数据库蛋白序列数据库(SWISS-PROT/TrEMBL；http:www.expasy.ch/)、基因序列数据库(GenBank,EMBL；http:www.ncbi.iilm.iiih.gov/,http:/www.ebi.ac.uk/)、蛋白质模式数据库(Prosite；http:/www.expasy.ch/sprot/prosite.html)、蛋白质二维凝胶电泳数据库、蛋白质三维结构数据库(PDB,http:/www.pdb.bnl.gov/；FSSP,http:/www.embl-ebi.ac.uk),蛋白翻译后修饰数据库(O-GLYCBASE,http:/www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE)义件9 邮2 9 1 收款 工MU)两肋QP0ai*Q-s y1 忖箕彳体 0课件3645蛋白质组数据库 心h到“，助于Jj-2&已主藏938A ExPASy Home pageSite Map Search ExPASy Contact usSearch j Sn-Prot/TrEXBL.Swi ss-ProtProtein knowledgebase.TrEMBLSlXJISwDlul Computer-annotated supplement to Swiss-ProtThe UniProt Knowledgebase consists of:Proteoiics tools回|Ck“JM for IMicrosoft?or)SwiS9-Prot headlines 1500 cited journals(Read引 ExPASy-Svsss-.3 Mtp/xhiru 找；3 UniProtPROSITE课件3645 Swiss-Prot.a curated protein sequence database which strives to provide a high level of annotat ion(such as the description of the function of a protein,its domains structure,post-translational modifications,variants,etc.),a minimal level of redundancy and high level of integrat ion with other databases More details/References/Linking to Swiss-Prot/User anual/Recent changes/Coercial U8”8/Disclaimer.TrEMBL;a computer-annotated supplement of Swiss-Prot that contains all the translations of EMBL nucleotide sequence entries not yet integrated in Swiss-Prot,These databases are developed by the Swiss-Prot groups at SIB and at EBI,UniProt Release 2.7 consi st s of：Swiss-Prot Release 44.7 of 11-Oct-2004：162781 entries(More sati sties)，彳：天河网僚文 裳的文稻瑞士的SWISS.PROT数据库拥有目前世界上最大、种类l=J多的蛋白质组数据课件3646二维凝胶电泳(2-DE)技术、质谱(MS)技术以及 大规模数据处理仍然是蛋白质组学的三大基本支撑技术。蛋白质组学研究的主要技术路线有两条：以2DE分离为核心的研究路线：混合蛋白首先通过2DE 分离，然后进行胶内酶解，再用质谱进行鉴定。以色谱分离为核心的技术路线：混合蛋白先进行酶解，经色谱或多维色谱分离后，对肽段进行串联质谱分析以 实现蛋白的鉴定。课件3647蛋白质组研究的技术路线流程图课件3647课件3648(-)二维电泳是分离蛋白质组的有效方法2-DE是分离蛋白质组最基本的工具，其原理是蛋白质在高压电场作用下先进行等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)电泳，利用蛋白质分 子的等电点不同使蛋白质得以分离；随后进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),按蛋 白质分子量的大小进行分离。课件3649：双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis,2-DE)利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学 特性，分离各种蛋白质的方法9特点:可分离10100 kD分子量的蛋白质:高灵敏度和高分辨率。便于计算机进行图像分析处理:与质谱分析匹配课件3649课件3650双向电泳原理1.第向：变性的等地聚焦点泳，根据蛋 白质的等由点进行分离2.第二向：.S花藁丙烯酰胺电泳，根据蛋白质分子量进行分离双向电泳技术可分离儿千个蛋白点课件3650课件3651一维电泳等电聚焦降渐 一 PIM Ju)三,)IEF胶条置于SDS凝胶上二维电泳SDS-PAGEPl渐降邮非51而斩降蛋白质的二维电泳M课件3652kDa课件3652课件3653：2DE技术的缺点够极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋 白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离小胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实 现自动化课件3653课件3654蛋白质的胶内酶切。包括：感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程Ettan Spot Picker-准确切点Spot coordinates from image analysis are fed to the spot pickerSpot picker uses RMs to locate spots using triangulation课件3654Gel plug excisedF4课件3655Ettan Spot Picker-准确切点切点有效、准确、完全、无污染课件3655Ettan Digester 酶切过程j-j-j j n-j-j 课件3656课件3657（二）质谱技术是蛋白质组鉴定的重要工具1.用肽质量指纹图谱鉴定蛋白质蛋白质经过酶解成肽段后，获得所有肽段的分子质量，形成一个特异的肽质量指纹图谱（PMF）,通过数据库 搜索与比对，便可确定待分析蛋白质分子的性质。2.用串联质谱鉴定蛋白质用PMF方法不能鉴定的蛋白质可通过质谱技术获得该 蛋白质一段或数段多肽的串联质谱（MS/MS）信息并通过 数据库检索来鉴定该蛋白质。(1)样品分离 2DE课件3658挖取蛋白点 肽混合物200 600课件3658?期麟呐S女江80000Q蛋白质的质谱分析课件3659（三）蛋白质相互作用研究是认识蛋 白质功能的重要内容蛋白质-蛋白质相互作用是维持细胞生命活动的 基本方式。研究蛋白质相互作用常用的方法有酵母双杂交、亲和层析、免疫共沉淀、蛋白质交联、荧光共振能 量转移（FRET）等。课件3659课件3660蛋白质相互作用研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选课件3660课件36611.标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱 原理，分析蛋白质体外直接相互作用的方法。标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋 白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结 合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结 合的未知分子。课件3661课件3662标签融合蛋白沉淀实验流程示意图第一步构建标签融合基因并表达标签融合蛋白课件3663第二步制备结合有融合蛋白的琼脂糖珠课件3664第三步融合蛋白-琼脂糖珠与细胞裂解液温育+细胞裂解液课件3664课件3665课件3666第五步用特定缓冲液洗脱琼脂糖珠结合的课件3667第六步SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色 鉴定结合蛋白互作用 白标签融合 蛋白鞋歌IIF能骷I辑课件3667课件36682.酵母双杂交技术的基本原理和用途一八 一*贝BD x)ad|融合蛋白 融合蛋白在酵母细胞内宿主菌表达课件3668课件3669酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用 的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白 质。课件3669课件3670 3.免疫共沉淀。免疫共沉淀耦联质谱技术特点 小 生理条件下蛋白质之间的相互作用 所有蛋白质与靶蛋白的相互作用 力可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用:缺点9灵敏性不高小假阳性力受免疫球蛋白的干扰较大课件3670课件3671.：.研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白f抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共 沉淀力SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物小切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串 联质谱(LC-ESI-MS/MS)分析，得到相应 的肽序列标签9 搜索数据库课件3671课件3672-4.蛋白质芯片(protein chips9 protein array)基本原理小将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行 定性和定量分析。依据的杂交反应原理9抗原抗体反应9配体受体反应小蛋白质蛋白质相互作用课件3672课件3673蛋白质组学的医学应用（一）寻找疾病相关蛋白质（二）发现和鉴别药物新靶点（三）不同生物蛋白质组的比较性研究，可对生 物进化提供参考课件3673课件3674.转录组及蛋白组的概念分别是什么？其研究内容分别包括哪些方面？2.如理利用转录组学及蛋白组学的方法筛选疾 病相关基因？（写出主要的检测指标及其实 验方法的名称）课件3674