基于多组学数据分析PUF家族基因在肝癌中的表达及其临床意义.pdf

宁夏医科大学学报4缘卷肝癌是常见的原发性肝癌，占所有原发性肝癌的 75%耀85%，在全球癌症相关死亡原因中位列第 41-2。肝癌的发生、浸润和转移涉及多种癌基因、抑癌基因及生长因子，而转录调控是肿瘤细胞代谢和增殖等生物学行为的关键3-4。RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）在转录调控中有非常重要的作用，PUF 家族蛋白又称Pumilio RNA 结合家族蛋白（主要包括 PUM1、PUM2 和 PUM3），是高度保守的 RNA 结合域，主要参与基因负性调控和特异性识别碱基，参与干细胞分裂增殖、细胞周期、DNA 修复和细胞凋亡等过程，其功能障碍会导致神经退行性变、癫痫、共济失调、不育和恶性肿瘤5。既往研究6-8已证实，PUM1 在卵巢癌、非小细胞肺癌及淋巴细胞白血病等肿瘤中发挥致癌作用。目前关于 PUM1、PUM2、PUM3 基因在肝癌发生发展中的具体作用并不清楚，因此，本研究基于多组学数据分析PUM1、PUM2、PUM3 基因在肝癌中的表达及其临床意义，以期为 PUF 家族基因的临床应用提供一定的理论依据。1资料与方法1.1数据来源通过 The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库下载肝癌患者临床信息和 RNA 测序数据，去除重复样本后共纳入 371 例肝癌组织基因表达谱样本和 50 例癌旁组织基因表达谱样本。所有的表达数据都通过对数转换进行归一化处理。根据 Z-score 标准化的中值，将纳入研究的患者分为高 PUMs 表达组和低 PUMs 表达组，分析PUM1、PUM2、PUM3 基因表达与患者临床病理特征的相关性。人类蛋白质图谱（https：/www.pro原teinatlas.org/）可以使用各种组学技术（包括免疫组织化学法、蛋白质组学、转录组学和系统生物学）来定位细胞、组织和器官中的蛋白质表达情况9-11。本研究从该数据库下载免疫组织化学图像来比较肝癌组织中 PUMs 的蛋白质表达水平，并深入评估其蛋白质表达情况。String（https：/cn.string-db.org/）是已知和预测的蛋白质-蛋白质相文章编号：1674-6309（2023）07-0668-08论著收稿日期：2022-06-12基金项目：国家自然科学基金项目（81960533）作者简介：唐超峰（1987），男，主治医师，研究方向为肝胆胰腺外科疾病。通信作者：卜阳（1976），男，教授，主任医师，博士研究生导师，研究方向为肝癌复发转移的基础与临床。E-mail：基于多组学数据分析 PUF 家族基因在肝癌中的表达及其临床意义唐超峰1，柳科军1，陈本栋1，卜阳2（1.宁夏医科大学总医院肝胆外科，银川750004；2.宁夏回族自治区人民医院肝胆外科，银川750002）摘要：目的探讨 PUF 家族基因（PUM1、PUM2、PUM3）作为肝癌的潜在预后标志物及其可能的分子调控机制。方法TCGA 数据库分析 PUM1、PUM2、PUM3在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中的表达及差异；Kaplan-Meier 曲线分析 PUM1、PUM2、PUM3表达与肿瘤患者预后；cBioPortal 数据库分析 PUM1、PUM2、PUM3在肝癌中的突变情况；String 网站及 Cytoscape 软件构建 PUM1、PUM2、PUM3共表达基因的蛋白互作网络；GO/KEGG 对 PUM1、PUM2、PUM3共表达基因进行功能富集分析；TIMER 2.0 数据库分析 PUM1、PUM2、PUM3与肿瘤免疫细胞浸润的相关性。结果PUM1、PUM2、PUM3 在肝癌组织的表达高于癌旁组织及正常肝组织（P均约0.001）；PUM1、PUM2、PUM3 阳性蛋白表达主要集中于细胞核或细胞质；PUM1 表达与患者年龄、BMI 及组织学分级相关（P均约0.05）；PUM2 表达与患者性别、年龄及病理分期相关（P均约0.05）；PUM3 表达与肿瘤 T 分期及病理分期相关（P均约0.05）；PUM1、PUM2、PUM3 高表达的肝癌患者预后差（P约0.05）；PUMs 共表达基因主要富集于 RNA 剪切、P53 类介质对信号转导的正向调节作用、剪接体组装、转录因子复合体、钙粘蛋白（E-cadherin）结合、P53 结合位点及细胞周期等通路。同时 PUM1、PUM2、PUM3表达与辅助性 T 细胞、中枢记忆性T 细胞、辅助性 T 细胞 2 及嗜酸性粒细胞浸润水平呈正相关关系。结论PUM1、PUM2、PUM3 在肝癌发生发展过程中发挥重要作用，可作为潜在的分子治疗靶点和预后评价标志物。关键词：肝细胞癌；PUF家族基因；预后；免疫浸润；生物信息学中图分类号：R735.7文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.07.004第 45 卷7 期2023 年 7 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University668窑窑7期*P0.001。图 1PUF 家族基因在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中表达差异苑6543276543员园86426543苑6543远5432*正常肝组织正常肝组织正常肝组织肝癌组织肝癌组织肝癌组织肝癌组织肝癌组织肝癌组织癌旁组织癌旁组织癌旁组织唐超峰，等.基于多组学数据分析 PUF 家族基因在肝癌中的表达及其临床意义互作用网络的在线数据库12，本研究联合 Cy原toscape 软件绘制 PUMs 蛋白与前 20 互作蛋白的网络图。cBioPortal for Cancer Genomics（https：/www.cbioportal.org/）是一个开放访问的开源资源，用于交互式探索多个癌症基因组数据集13。利用cBioPortal 基 于 TCGA Pan-Cancer Atlas 分 析PUMs 基因在肝癌中的突变特征。1.2GO/KEGG 富集分析通过 String 数据库得到的 PUMs 相关基因（Spearman 相关系数逸0.9，孕60 岁110（29.6）83（22.4）*106（28.6）*87（23.5）95（25.7）98（26.5）BMI/（kg m-2）2580（23.9）*97（29.0）*0.03187（26.0）90（26.9）0.53386（25.7）91（27.2）0.5412591（27.2）*67（20.0）*84（25.1）74（22.1）83（24.8）75（22.4）AFP/（ng mL-1）400114（41.0）*99（35.6）*0.121118（42.4）95（34.2）0.167108（38.8）105（37.8）0.61740027（9.7）*38（13.7）*29（10.4）36（12.9）30（10.8）35（12.6）Child 分级A 级123（51.5）*94（39.3）*0.636124（51.9）93（38.9）0.710116（48.5）101（42.3）0.429B 级10（4.2）*11（4.6）*12（5.0）9（3.8）9（3.8）12（5.0）C 级1（0.4）*0（0.0）*0（0.0）1（0.4）1（0.4）0（0.0）T 分期T199（26.9）*82（22.3）*0.34799（26.9）82（22.3）0.082103（28）78（21.2）0.045T244（12）*50（13.6）*48（13.0）46（12.5）39（10.6）55（14.9）T335（9.5）*45（12.2）*30（8.2）50（13.6）34（9.2）46（12.5）T46（1.6）*7（1.9）*6（1.6）7（1.9）7（1.9）6（1.6）组织学分级G136（9.8）*19（5.2）*0.00232（8.7）23（6.3）0.50632（8.7）23（6.3）0.060G297（26.5）*80（21.9）*90（24.6）87（23.8）97（26.5）80（21.9）G346（12.6）*76（20.8）*56（15.3）66（18.0）50（13.7）72（19.7）G45（1.4）*7（1.9）*6（1.6）6（1.6）5（1.4）7（1.9）病理分期期91（26.2）*80（23.1）*0.12496（27.7）75（21.6）0.00397（28.0）74（21.3）0.012期42（12.1）*44（12.7）*46（13.3）40（11.5）36（10.4）50（14.4）期34（9.8）*51（14.7）*29（8.4）56（16.1）34（9.8）51（14.7）期4（1.2）*1（0.3）*4（1.2）1（0.3）4（1.2）1（0.3）表 1PUF 家族基因表达水平与肝癌患者临床病理特征的关系 例（%）唐超峰，等.基于多组学数据分析 PUF 家族基因在肝癌中的表达及其临床意义*为缺失处理策略（不统一处理变量缺失）。671窑窑宁夏医科大学学报4缘卷其靶点 RNA 转录失调，而这些靶点 RNA 编码肿瘤细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期过程中调控因子，进而介导肿瘤恶性进展过程。因此，在癌症背景下对 PUMs 蛋白进行研究，能够在未来为肿瘤个体化综合治疗提供新的分子治疗靶点。PUM1 蛋白在哺乳动物中具有重要作用，参与细胞周期、DNA 修复和细胞更新等生理过程。PUM1 在许多不同类型的癌症中促进细胞生长、侵袭和转移，并抑制细胞凋亡20。Guan 等6发现，卵巢癌中的 PUM1 水平显著高于正常组织，下调A.PUMs 共表达基因的蛋白-蛋白相互作用网络；B.GO/KEGG 功能富集分析；C.PUMs 基因突变。图 4肝癌中 PUMs 的共表达基因蛋白-蛋白相互作用及其遗传改变、GO/KEGG 功能富集A.PUM1；B.PUM2；C.PUM3。图 5肝癌中 PUF 家族基因表达与免疫细胞浸润的相关性ABCRNA splicingnuclear transportRNA localizationRNA transportmRNA transportmethylationsignal transduction by P53 class mediatorcatalytic activity，acting on RNAcell adhesion molecule bindingcadherin bindingRas GTPase bindingtranscription coactivator activitymethyltransferase activityP53 bindingp.adjust0.010 00.007 50.005 00.002 50.030.020.01p.adjustCountsCounts406080100204060nuclear specknuclear envelopespliceosomal complextranscription factor complexnuclear membranecell-substrate junctionspindleSpliceosomeRNA transportAmyotrophic lateral sclcrosisRibosome biogenesis in eukaryotesEndocytosismRNA surveillance pathwayUbiquitin mediated proteolysisCell cycleGeneRatioGeneRatio0.040.060.080.100.120.140.020.040.060.080.10Structural Variant（unknown significance）Missense Mutation（unknown significance）Splice Mutation（unknown significance）Truncating Mutation（unknown significance）AmplificationDeep DeletionmRNA HighNo alterationsmRNA LowBCABT helper cellsTcmEosinophilsTh2 cellsTFHaDCNK CD56bright cellsNK cellsMacrophagesTh17 cellsTemTh1 cellsMast cellsCD8 T cellsiDCNK CD56dim cellsB cellsNeutrophilsT cellsTgdTRegDCCytotoxic cellspDCT helper cellsTcmTh2 cellsEosinophilsTFHTh17 cellsaDCNK cellsTemMacrophagesTh1 cellsNK CD56bright cellsMast cellsCD8 T cellsiDCB cellsTgdNK CD56dim cellsT cellsTRegNeutrophilsCytotoxic cellsDCpDCT helper cellsTh2 cellsTcmMacrophagesTFHaDCTh1 cellsEosinophilsiDCNK CD56bright cellsTemNK CD56dim cellsCD8 T cellsNeutrophilsT cellsNK cellsB cellsMast cellsTRegTgdCytotoxic cellspDCTh17 cellsDCCorrelation-0.4-0.20.00.20.4Correlation-0.4-0.20.00.20.4Correlation-0.2-0.10.00.10.20.3CorrelationP value*P0.05*P0.010.750.500.250.000.10.20.30.4CorrelationP value*P0.05*P0.010.750.500.250.000.10.20.30.4CorrelationP value*P0.05*P0.010.60.40.20.10.2672窑窑7期PUM1 表达介导 STAT3、BCL2、MMP2 和 VEGFA的表达水平下调，PUM1 在体外诱导卵巢癌细胞生长、迁移和侵袭。在胰腺癌中，PUM1 mRNA 表达水平与胰腺癌的预后和肿瘤的发生相关，PUM1可作为胰腺癌的潜在诊断指标；此外，PUM1 的DNA 甲基化水平影响其在胰腺癌中的致癌作用，PUM1 能通过改变免疫细胞浸润来抑制免疫微环境，从而影响胰腺癌的免疫治疗反应20。在前列腺癌中，PUM1 呈高表达水平，沉默 PUM1 表达能够抑制肿瘤细胞增殖和细胞周期阻滞，揭示了PUM1 的过表达通过抑制负细胞周期调节因子CDKN1B 的表达来促进肿瘤恶性进展的新机制21。同时，与正常结肠细胞系相比，PUM1 mRNA 在原发性和转移性结肠癌细胞系中呈高表达水平，PUM1 高表达能够促进肿瘤增殖、侵袭和转移，验证了 PUM1 在维持癌症干细胞中的作用22。并且 PUM1 在西妥昔单抗耐药结肠癌细胞系中表达上调，PUM1 靶向正反馈调节 DDX5 表达，并在西妥昔单抗耐药机制中扮演重要角色23。体内外实验研究表明，下调 PUM1 表达介导 PERK/eIF2/ATF4 信号通路抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭、转移、上皮间质转化（EMT）和促进细胞凋亡，证实敲降 PUM1 能够提高胰腺癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的敏感性，充分表明 PUM1可能成为提高胰腺癌细胞对化疗敏感性的新靶点24，与既往研究一致。本研究佐证了 PUM1 参与了肝癌的发生发展过程，具体机制可能是PUM1 的高表达促进了肝癌细胞增殖且介导免疫细胞浸润，从而促进了肝癌恶性进展并降低了患者的总体存活率。PUM2 全长约 80 kb，由 20 个外显子构成，位于染色体 2p24.1 上，其转录形成 985 个氨基酸构成的 PUM2 蛋白，常见于大脑、心脏、肝脏、肾脏等组织的细胞质中，能够通过抑制细胞周期基因的表达来促进干细胞增殖25-26。Zhang 等27研究表明，PUM2 在乳腺癌组织中的表达明显升高，与乳腺癌患者的总生存期和无复发生存期呈负相关，体外实验表明，PUM2 可以通过与 miR-376a 竞争性结合 NRP1-3 UTR 来促进乳腺癌细胞“干性”。在卵巢癌中，PUM2 的表达水平在顺铂耐药卵巢癌细胞和患者组织中上调，靶向敲低 PUM2 表达能够逆转小干扰 RNA-USP46 诱导的顺铂耐药性，提示 PUM2 参与卵巢癌顺铂耐药的过程28。同时，PUM2 在胶母细胞瘤癌组织及细胞系中表达升高，敲低 PUM2 表达能够显著抑制肿瘤细胞增殖和迁移29。PUM2 在结直肠癌中的高表达，靶向敲低 PUM2 表达，显著抑制结肠癌细胞增殖和细胞周期 G1/S 阻滞，揭示了 PUM2在肿瘤恶性进展中的作用及其作为治疗靶点的潜力30。本研究表明，肝癌中 PUM2 表达水平升高，且同患者不良预后密切相关。但是 PUM2 在骨肉瘤组织中的表达降低，PUM2 通过与 miRNA分竞争性结合 STARD13 3 UTR 来抑制。骨肉瘤恶性进展31。由此可见，肿瘤中 PUM2 的表达及作用具有一定的异质性。因此，探索 PUM2 在正常组织中转录调控机制及其在不同类型癌症中的失调至关重要，可能为未来的治疗提供新的候选目标。PUM3 结构域呈 L 形，其通过和磷酸骨架的相互作用与 RNA/DNA 结合，PUM3 在原始生殖细胞核中定位，沉默 PUM3 表达介导生殖细胞中P53 过度活化，揭示了 PUM3 在生殖细胞发育过程中的重要作用32。然而，关于 PUM3 在肿瘤进展中的作用知之甚少。PUM3 表达与宫颈癌患者的总生存期相关，敲低 PUM3 表达能够显著抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移33。Chodary 等34利用生物信息学分析表明，PUM3 基因能够作为结直肠癌的预后/诊断生物标志物。采用免疫组织化学研究表明，在 玉、域、芋 和 郁 期乳腺癌标本中，PUM3 的表达水平明显高于导管原位癌，PUM3 过表达能够促进乳腺癌的发生发展，其机制可能与调节其下游靶点 mRNA 表达相关35。本研究表明，肝癌组织中 PUM3 过表达，且其表达水平在患者肿瘤 T 分期及病理分期中差异有统计学意义，PUM3 高表达的肝癌患者预后不良，为PUM3 在肿瘤恶性进展中的重要作用提供了一定的理论依据。此外，在肝癌中，本研究分析了PUM1、PUM2、PUM3 表达与免疫细胞浸润的关系，结果显示 PUM1、PUM2、PUM3 表达与辅助性T 细胞、中枢记忆性 T 细胞、辅助性 T 细胞 2 及嗜酸性粒细胞浸润水平呈正相关，但 PUM1、PUM2、PUM3 与肿瘤浸润免疫细胞的直接关系仍需组织样本及细胞实验进一步研究。综上所述，PUF 家族基因参与调控 mRNA 在人体各种组织中的翻译过程，其相关基因表达在癌症中受到干扰，导致其靶点 mRNA 表达失调，进而介导肿瘤相关恶性进展过程。本研究结果表明，PUM1、PUM2、PUM3 过表达是肝癌恶性进展过程中的关键分子特征，提示 PUM1、PUM2、PUM3 可能是肝癌药物治疗的潜在靶点。唐超峰，等.基于多组学数据分析 PUF 家族基因在肝癌中的表达及其临床意义673窑窑宁夏医科大学学报4缘卷参考文献：1Gordan JD，Kennedy EB，Abou-Alfa GK，et al.Sys原temic therapy for advanced hepatocellular carcinoma：ASCO guideline J.J Clin Oncol，2020，38（36）：4317-4345.2 Llovet JM，Kelley RK，Villanueva A，et al.Hepatocel原lular carcinoma J.Nat Rev Dis Primers，2021，7：6.3 Hanahan D.Hallmarks of cancer：new dimensions J.Cancer Discov，2022，12（1）：31-46.4 Laham-Karam N，Pinto GP，Poso A，et al.Transcrip原tion and translation inhibitors in cancer treatment J.Front Chem，2020，8：276.5 Goldstrohm AC，Hall TMT，McKenney KM.Post-tran原scriptional regulatory functions of mammalian 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AutonomousRegion，Yinchuan750002，China）Abstract：ObjectiveTo explore PUF family genes（PUM1、PUM2、PUM3）as potential prognostic markers forhepatocellular carcinoma（HCC）and their possible molecular regulatory mechanisms.MethodsTheexpression of PUM1、PUM2、PUM3 in normal liver tissue，precancerous tissues，and HCC tissues were ana-lyzed using the TCGA database.Kaplan-Meier curves were used to analysis the association of PUM1、PUM2、PUM3 expression with the prognosis of HCC patients.The cBioPortal database was used to study the PUM1、PUM2、PUM3 mutation in HCC.The protein interaction layout was created by Cytoscape software and String.All the co-expressed with PUM1、PUM2、PUM3 in HCC were subjected to enrichment analysis of GO functionsand KEGG pathways.The tumor immune estimation resource（TIMER）database was used for differentialanalysis of PUM1、PUM2、PUM3 and immune infiltrates in HCC.ResultsThe expression of PUM1、PUM2、PUM3 in HCC tissue was statistically significantly higher than that in paraneoplastic tissue and normalliver tissue（P all0.001）.PUM1、PUM2、PUM3 proteins expression were mainly found in the cytoplasm andnucleus.PUM1 expression was significantly correlated with patient age，BMI and histological grade（Pall0.05）.PUM2 expression was correlated with patient gender，age and pathological stage（P all0.05）.PUM3expression was correlated with tumor T stage and pathological stage（P all0.05）.High PUM1、PUM2、PUM3