高中生物-专题五-DNA和蛋白质技术-新人教版选修1.ppt

一、一、DNADNA粗提取和鉴定原理粗提取和鉴定原理定义：定义：定义：定义：是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNADNADNA片段的技术。能以极少量的片段的技术。能以极少量的片段的技术。能以极少量的片段的技术。能以极少量的DNADNADNADNA为为为为模板，在几小时内复制出上百万份的模板，在几小时内复制出上百万份的模板，在几小时内复制出上百万份的模板，在几小时内复制出上百万份的DNADNADNADNA拷贝。拷贝。拷贝。拷贝。1 1、PCRPCR仪仪.设备及用具设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器。的仪器。二二.PCR.PCR的实验操作的实验操作2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液液体，体，其上的一次性吸液枪头其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。用一次更换一次。1.1.准备准备2.2.移液移液.实验操作步骤实验操作步骤按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。试剂摆放在实验桌上。用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。往微量离心管里面加入各种试剂。混合后盖严微量离心管口的盖子，混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。用手指轻轻弹击管壁。3.3.混合混合过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上,离心离心约约10s10s。4.4.离心离心离心目的：使反应液体集中在离心管底部，离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。提高反应效果。将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循仪的循环程序。环程序。5.5.反应反应循环数循环数循环数循环数变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸延伸第一次第一次第一次第一次94949494，10min10min10min10min30303030次次次次94949494，30s30s30s30s55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min最后一次最后一次最后一次最后一次94949494，1min1min1min1min55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1minPCRPCR一般经历一般经历三十多次三十多次循环，每次循环可以分循环，每次循环可以分为三个基本步骤为三个基本步骤变性、复性和延伸变性、复性和延伸.PCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的等因素的污染而造成干扰实验，污染而造成干扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意做到：6.6.注意事项注意事项隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头.理论上理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算三三.课题成果评价课题成果评价1.1.一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为2 2n n2.a2.a条条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为a2a2n n.实验中实验中DNADNA含量的测定含量的测定1.1.原理原理 可以通过计算可以通过计算DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与收峰，峰值的大小与DNADNA的含量有关。的含量有关。2.2.过程过程.稀释稀释 2uLPCR2uLPCR反应液，加入反应液，加入98uL98uL蒸馏水，即蒸馏水，即将样品进行将样品进行5050倍稀释倍稀释.对照调零对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm260nm处，将处，将紫外分光光度计的读数调节至零。紫外分光光度计的读数调节至零。取取DNADNA稀释液稀释液100uL100uL至比色杯中，测定至比色杯中，测定260nm260nm处处的光吸收值的光吸收值.计算计算.计算计算DNADNA含量含量(g g)50(260nm50(260nm的读数的读数)稀释倍数稀释倍数5050：1 1 g g/ml/ml的的DNADNA在厚度为在厚度为1cm1cm比色杯中的吸比色杯中的吸光值为光值为0.020.02光光吸吸收收波长波长nmnm2602602402402202202802800.10.10.20.2比色杯比色杯1.1.蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种类不同种类的蛋白质。的蛋白质。一、一、基础知识基础知识 （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。1.1.作用作用:2.2.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制:通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不同同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。3 3 3 3.在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液磷酸缓冲液,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠 如何证明色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？如何证明色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？（三）（三）电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这下，这些基团会带上正电或负电。些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离分子的分离。3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 1、在测定蛋白质分子量时常用、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸十二烷基硫酸钠（钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,NN,N-亚甲基双丙亚甲基双丙烯酰胺在烯酰胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。2.2.原理：原理：SDSSDSSDSSDS能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成。由几条肽链组成的蛋白质复合体在的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会的作用下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链解聚成单条肽链解聚成单条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDSSDS能与各能与各种蛋白质形成种蛋白质形成蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质SDSSDSSDSSDS复合物复合物复合物复合物，SDSSDS所带负电荷所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量原有的电荷量原有的电荷量原有的电荷量。因而掩。因而掩盖了盖了不同种蛋白质间的电荷差别不同种蛋白质间的电荷差别不同种蛋白质间的电荷差别不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。全取决于分子的大小。3.SDS3.SDS作用机理作用机理:用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋测定蛋白质的分子量时，可选用一组白质的分子量时，可选用一组已知分子量已知分子量的标准蛋白的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的量的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，可以测定，可以测定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分子量、市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。售。二、实验操作二、实验操作样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤血血血血液液液液血浆血浆血浆血浆水水水水 分分分分固体物质：固体物质：固体物质：固体物质：血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细血细血细 胞胞胞胞白细胞白细胞白细胞白细胞血小板血小板血小板血小板红细胞红细胞红细胞红细胞（最多）（最多）（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白（90909090）两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNADNADNA，用猪、牛、羊的红细胞提，用猪、牛、羊的红细胞提，用猪、牛、羊的红细胞提，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？取血红蛋白的原因是什么？取血红蛋白的原因是什么？取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNADNADNA，便于进行，便于进行，便于进行，便于进行DNADNADNADNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁四个亚铁四个亚铁四个亚铁血血红素基团红素基团红素基团红素基团每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素亚铁血红素基团，基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧一分子氧或一分子二氧化碳，或一分子二氧化碳，血红蛋白血红蛋白因含有因含有血红素血红素而呈而呈红色。红色。血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：