溶瘤病毒产品药学研究与评价技术指导原则试行.pdf

溶瘤病毒产品药学研究与评价 技术指导原则（试行）国家药品监督管理局药品审评中心2023 年 02）11/35目录一、前言.4二、适用范围.4三、一般原则.5四、风险评估和控制.7五、生产用物料.91.起始原材料.91.1 病毒种子.91.2 质粒 DNA.131.3 生产/包装细胞.132.其他生产用物料.16六、生产工艺.171.工艺研究与开发.171.1 原液生产工艺.181.2 制剂生产工艺.191.3 工艺过程控制.202.工艺验证.21七、质量研究和质量标准.221.质量研究.221.1 鉴别和结构分析.221.2 生物学活性.231.3 含量.242/351.4 纯度、杂质和污染物.241.5 其他特性.272.质量标准.282.1 检验项目.282.2 标准限度.292.3 分析方法.292.4 标准品/对照品.30八、外源病毒因子检测和控制.30九、稳定性研究.32十、包装及密封容器系统.33十一、名词解释.34十二、参考文献.343/35一、刖百近年来，溶瘤病毒作为肿瘤免疫治疗领域的一类产品受 到广泛关注，其主要通过裂解肿瘤细胞和激活机体自身免疫 来发挥作用。随着技术不断发展和研究不断深入，溶瘤病毒 产品对肿瘤细胞的选择性和有效性不断提高，对正常细胞的 影响进一步降低，产品的安全性进一步提高。随之，溶瘤病 毒产品类型增加迅速，不同类型产品从基因设计、生产工艺、质量控制等方面均可能存在差异。为规范和指导这类产品的 研究、开发和评价，制定本指导原则。本指导原则基于当前的技术发展和科学认知，针对溶瘤 病毒产品药学研究提出建议和一般性技术要求，具体品种的 适用性应遵循具体问题具体分析的原则。产品研发过程中亦 可根据产品研发实际情况，采用其他更适合或有效的方法,但是必须符合药物研发的规律，并提供科学合理的依据。本指导原则主要针对产品申报上市阶段的药学研究制 定，产品临床试验阶段的药学研究可根据各阶段的研发特点 和研究目的，参考本指导原则开展与阶段相适应的研究。二、适用范围本指导原则中溶瘤病毒产品包括野生的、减毒的或经过 基因修饰的具有复制能力的病毒产品，其可选择性地感染肿 瘤细胞和/或选择性地在肿瘤细胞中复制以裂解肿瘤细胞，也可同时表达外源基因以提高相应功能，还可通过刺激机体 4/35产生免疫反应达到治疗目的的一类产品。三、一般原则溶瘤病毒产品的研发和申报应符合现行药品管理相关 法律法规的要求，用于人体的溶瘤病毒产品的生产应符合 药品生产质量管理规范（简称GMP）的基本原则和相关 要求。同时，溶瘤病毒产品的研发、生产、使用和废弃处理 应符合生物安全相关法律法规的要求。1.一般要求溶瘤病毒一般是具有复制能力的活病毒，在基因设计、生产工艺、质量研究和控制、贮存和运输，以及临床使用等 方面均面临诸多挑战，因而应结合药物开发阶段开展相应的 研究。为了确保安全性，应从生产用物料、生产工艺过程控 制和/或终产品等各个阶段严格控制外源因子污染的风险。应 关注和充分评估病毒多次传代后基因序列和/或氨基酸序列 突变的风险，并采用合理的方法和手段进行监测，确保产品 全生命周期的安全性。由于溶瘤病毒产品活性成分特殊，还 应关注生产过程中污染和/或交叉污染风险的评估和控制，以 及产品生产、储存和临床使用过程中对人员、动植物、微生 物及环境潜在风险的评估和控制。2.不同研发阶段的考虑溶瘤病毒产品的研发应遵循药物研发的一般规律，在整 个研发周期内应采取循序渐进、逐步完善的策略。5/35临床试验阶段，重点关注与药物安全性相关的问题，确 保临床试验用药物的安全性。一般情况下，临床试验用药物 的质量应不劣于非临床研究用药物质量。另外，结合产品特 点，还需关注以下方面，如病毒本身的安全性，应从其来源、构建/筛选、传代历史和检定，以及必要的稳定性研究等方面 综合考虑；外源因子是溶瘤病毒产品尤为关注的控制项目之 一，应从病毒构建/筛选、起始原材料（如病毒种子、生产/包 装细胞）、生产过程中可能使用的动物/人源材料、生产过程 控制和/或终产品等方面综合考虑，避免外源因子污染；同时，还需对临床试验用药物生产工艺进行初步确认，建立初步的 中间体控制项目和标准；开展相关质量研究，进行必要的方 法确认，建立适用于临床的质量标准，保证临床样品的质量；开展初步的稳定性研究，稳定性研究应能支持临床试验开展,并对包装及密封容器进行适用性评估。临床试验期间，以不增加临床受试者安全性风险为前提,适时推进工艺优化和质量研究，使前期药学研发数据能够支 持后期临床试验开展。随着对产品质量属性和生产工艺认识 的不断深入，以及临床试验数据与产品质量属性相关性分析 的不断积累，应逐步确认工艺步骤和关键工艺参数、关键质 量属性，建立生产过程控制项目和可接受标准，完善质量研 究和质量标准。原则上，建议在确证性临床之前确认生产工 艺和处方、生产场地、关键生产用物料来源、产品质量标准 6/35等，生产工艺应基本稳定，工艺规模和控制与商业化生产相 当，应尽可能避免在确证性临床阶段或确证性临床试验后发 生可能影响产品安全性和有效性的重大药学变更。上市申报阶段，基于产品特性、生产工艺和质量属性的 深入研究和数据积累，确定产品的关键质量属性和关键工艺 参数，完成全面的工艺验证，确定商业化生产工艺和处方。质量标准中应明确检验项目、分析方法和标准限度，分析方 法应进行全面的验证，标准限度的制定要有依据。稳定性研 究和包装及密封容器系统相容性研究应采用代表性样品开 展，研究内容和数据应完整、全面。四、风险评估和控制溶瘤病毒产品类型较多，基因设计、生物学特性和作用 机制情况复杂，使用到的生产/包装细胞类型多样，生产工艺 和质量研究也各有不同，因此，对于不同类型的溶瘤病毒产 品，可基于质量风险特征制定相应的控制措施。溶瘤病毒产品质量相关风险一般包括以下方面：1.生产用物料方面(1)对病毒传染性、致病性和毒力等研究和认识不足，缺乏相应的风险控制而引入的风险。(2)病毒基因修饰和/或多次传代导致病毒发生基因突 变的风险，以及病毒基因插入细胞基因组致癌的风险。(3)对细胞基质认知不够充分、检定项目不全面以及肿 7/35瘤细胞、宿主细胞DNA和宿主蛋白质残留的风险。(4)生产过程中添加的生产用原材料，尤其是动物/人 源材料外源因子控制不全面的风险(5)新型辅料人体使用安全性、免疫原性的风险。2.生产工艺方面(1)生产工艺相关操作对病毒理化特性、生物学活性等 产生不良影响的风险。(2)生产过程中污染/交叉污染的风险。3.质量研究方面(1)质量研究项目不全面引入的风险。(2)分子变体、非完整包装病毒(如非包膜病毒颗粒、空壳病毒颗粒等)、错误包装病毒颗粒、无活性病毒颗粒、病 毒颗粒聚集体、生物学活性等分析方法受限或变异性较大引 入的风险。基于以上质量相关风险，应制定相应的风险控制策略。例如，针对生产用物料的风险应进行全面的研究和风险评估,对生产工艺进行充分研究和验证，结合不同病毒特点开展全 面的质量研究和质量控制，并对质量控制方法进行全面验证,开展全面的稳定性研究和包装容器相容性研究，采用多种方 式来降低环境和人员风险，如设定合理的废弃物处理手段，在适当的生物防护条件下进行产品的处理等。8/35五、生产用物料本指导原则中生产用物料主要指用于生产溶瘤病毒产 品的物质或材料，包括起始原材料（如病毒种子、生产/包装 细胞），生产过程中使用或添加的原材料（如培养基及其添加 成分、纯化试剂等）、辅料、以及生产用耗材（如培养袋、储 液袋、移液管路、滤膜等）等。生产用物料直接关系到产品 的安全性和有效性，需要建立良好、规范的质量管理体系，并参照中国药典等相关要求进行风险评估和质量控制。1.起始原材料1.1 病毒种子1.1.1 病毒选择的一般考虑病毒选择一般应基于临床应用目的、安全性（病毒研究 历史、流行病数据、分子结构、既往使用经验和体内安全性 数据、病毒载体设计成熟程度和研究基础等）、体内作用机制、生物学特性（致病性、宿主范围、嗜肿瘤特性）以及生产工 艺规模的可放大性等进行充分的考虑。如果使用当前认知尚 不充分的病毒进行开发时，需要全面评估安全性风险并制定 相应的控制策略。目前常用于溶瘤病毒产品开发的病毒来源 包括野生病毒、减毒病毒和基因修饰病毒。当采用野生病毒或减毒病毒进行产品开发时，病毒的来 源、筛选、减毒操作和传代历史情况应明确，并需要对病毒 结构和作用机制、病毒宿主范围和对人体致病性，以及病毒9/35传代稳定性等进行研究和风险评估。另外，减毒病毒还应结 合其减毒操作以及减毒目标开展毒力评价试验。当采用基因修饰技术进行产品开发时，初始病毒的来源、培养情况(如适用)、传代历史(如适用)、初始病毒的遗传 信息等情况应明确。基因修饰过程中，工具的选用与设计、操作过程、筛选方法等需要进行适当的研究并结合筛选结果 说明其合理性。需要关注的是，研究结果需要说明是否达到 基因修饰的预期目的，如基因的沉默或表达等；基因修饰后，病毒在感染活性、复制特性、毒力和致病性等方面是否产生 非预期作用的风险，是否满足溶瘤病毒产品开发的质量要求。1.1.2 病毒基因修饰设计的一般考虑病毒基因修饰一般以降低对正常细胞杀伤性、增强肿瘤 细胞靶向性、优化肿瘤微环境等提高安全性和有效性为目的。常见的基因修饰包括(但不仅限于)以下方面：(1)突变在正常细胞中复制比较关键的病毒编码基因。(2)插入肿瘤特异性启动子以控制病毒早期基因表达。(3)改变病毒的组织趋向性或病毒进入细胞的方式。(4)病毒基因组中插入外源基因等。(5)病毒外壳蛋白的改造和修饰以降低病毒本身的免 疫原性和抗原性。相应的，针对病毒基因修饰，一般需关注(但不仅限于)以下方面:10/35(1)删除或突变病毒中与安全性相关的致病基因，如神 经毒性基因、潜在致癌风险基因等。(2)减少生产用载体与包装细胞的同源序列，减少包装 质粒之间的同源序列；减少生产用载体与人体易感病毒或内 源性病毒的同源序列，以降低回复突变或同源重组产生的风 险。(3)开展基因修饰后病毒遗传稳定性研究，特别关注经 修饰后的基因稳定性，评估序列突变引入的潜在安全性风险 或对有效性的影响。(5)研究基因修饰后病毒的生长特性、对肿瘤细胞选择 性和感染特性、细胞内的复制能力，以及神经毒性(如适用)等方面的变化。1.1.3 病毒种子批的建立和检定为了确保产品质量的一致性和稳定性，生产用病毒需采 用种子批系统管理。在病毒种子批建立过程中，需采用合理 的筛选技术进行病毒的单克隆筛选。病毒种子批建立过程中 可能使用到的原材料如初始病毒、质粒DNA和包装细胞等 需进行适当的研究和质量控制。病毒种子批建立后，需开展相应的检定。检定项目应符 合中国药典或其他通行技术指导原则的相关规定，并根 据病毒种子自身特点设定相应的检定项目。检定项目一般包 括鉴别(基因序列、血清型、电镜形态等)、病毒滴度、外源 11/35因子（细菌、真菌、支原体、分枝杆菌（如适用）、病毒等）、初始病毒（或野生型病毒）、功能性检测（如肿瘤选择性、病 毒复制能力、裂解/杀伤肿瘤细胞能力等）、抗病毒药物敏感 性（如适用）、目的蛋白鉴定和功能检测（如适用）、病毒物 理特性（如适用）等。病毒种子批保存容器、冻存剂和冷冻保存条件等需经过 研究确认。种子批的层级（二级或三级种子批）和数量应满 足生产的要求。1.1.4 病毒种子批的稳定性为了确保病毒在传代过程中的遗传稳定性和生物学特 性等的稳定性，病毒种子批应开展规范的传代稳定性研究。传代研究条件应符合实际生产条件或具有代表性，研究项目 建议涵盖全基因组测序并关注特定基因序列分析、产品质量（如病毒滴度、裂解/杀伤肿瘤细胞能力等）、目的蛋白鉴别 和功能检测（如适用）、初始病毒（或野生型病毒）等。根据 传代稳定性研究结果合理拟定病毒种子批的限传代次，并在 实际生产过程中加以限定。需要关注的是，某些病毒在多次 传代后易发生基因序列甚至氨基酸突变，因此建议加强病毒 分子变体的研究。一般情况下，应对主种子和生产限传代次 病毒进行全基因组分析，关注多次传代后病毒在基因序列和/或氨基酸序列上变化。可采用灵敏的、可量化的检测方法识 别病毒全基因组中的所有突变，尤其关注改造区域或编码区 12/35域基因突变情况，充分评估突变对产品安全性和有效性的影 响。另外，为了确保病毒种子批在贮存过程中的稳定性，需 要规范开展贮存稳定性研究。1.2 质粒DNA质粒DNA可用于制备病毒种子，也可通过瞬时转染方 式生产溶瘤病毒。根据研究确认各类质粒DNA的来源、序 列信息、主要元件及功能等。通常情况下，制备病毒种子的质粒DNA在构建过程中 一次性使用，一般不需要建立细菌种子批，因而，需要对质 粒DNA序列的完整性和准确性进行确认，同时避免操作过 程中外源因子污染的风险。重组构建的病毒种子需进行单克 隆筛选、建库及检定等，具体可参考前文。瞬时转染方式用于生产溶瘤病毒产品的质粒DNA,一般 需要建立细菌种子批进行生产，其具体要求可参考体内基 因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）。1.3 生产/包装细胞1.3.1 生产/包装细胞选择的一般考虑本指导原则的生产/包装细胞是指培养病毒时所使用的 细胞，一般包括病毒种子构建过程中使用的细胞基质和生产 病毒使用的细胞基质，两种细胞基质可能相同也可能不同。原则上，生产/包装细胞的选择和使用应满足来源清晰、历史13/35培养过程清楚、风险可控及经过全面检定的要求，以确保其 适用性和安全性。选择细胞基质可以考虑(但不仅限于)以 下方面：(1)细胞的种属及组织来源。(2)细胞对病毒的敏感性以及能稳定生产病毒的能力。(3)细胞的特性及全面检定的可行性。(4)生产工艺的便利性和可行性。(5)下游纯化工艺能够去除风险因素的可能性和达到 的安全水平以及使用经验等。目前溶瘤病毒产品开发中可能适用的生产/包装细胞类 型较多，如正常细胞群连续传代建立的细胞系/株(如Vero)、肿瘤细胞系/株(如Hela、A549等)、携带致瘤基因的传代细 胞系/株(如HEK293)等。原则上，应避免使用含有内源性 病毒的细胞基质，如确因病毒生产需要，应提供充分的安全 性评估研究数据。如适用，还需结合内源性病毒与溶瘤病毒 在理化特性方面的差异，在生产工艺中设置病毒去除/灭活单 元，并在产品或收获液阶段建立敏感的检测此类内源性病毒 的方法。由于肿瘤细胞或携带肿瘤基因的细胞系成瘤或致瘤 风险较高，建议谨慎选用。如使用具有成瘤性细胞，需要结 合临床风险获益、给药途径和生产工艺对杂质(如活细胞残 留、致瘤基因片段残留等)去除能力等评估使用的必要性、合理性和安全性。一般不建议使用具有致瘤性的细胞。对于 14/35新型细胞基质和新建细胞株/系，建议参考中国药典的相 关要求评估其相关的安全性风险（如成瘤或致瘤等），并开展 相应的研究。如果根据生产需要，对细胞基质进行了基因修饰（如赋 予病毒蛋白、允许病毒复制或包装等），应考虑基因修饰的必 要性和修饰方法的适用性，修饰过程不应增加额外的安全性 风险，修饰基因的选择应尽量避免或降低病毒包装过程发生 重组的风险。1.3.2 生产/包装细胞的建库和检定为了保证产品质量的稳定性，生产/包装细胞需建库管理。细胞库的制备和检定应符合中国药典“生物制品生产检定 用动物细胞制备及质量控制”和ICH Q5D等相关要求。检定 项目一般包括：鉴别、细胞数量和活率、成瘤性和/或致瘤性（如适用）、外源因子等。经基因修饰建立的稳定传代细胞系/株，除上述检定项目 外，还应对基因修饰的结果，如基因序列、修饰位点、拷贝 数、表达水平等进行研究确认。1.3.3 生产/包装细胞的稳定性为了确保生产/包装细胞在传代过程中可以稳定地生产 出预期质量的溶瘤病毒，生产/包装细胞应开展规范的传代稳 定性研究。传代稳定性研究条件应代表或模拟商业化生产工 艺，其研究项目一般应包括如鉴别、外源因子、细胞生长特 15/35性、生产病毒能力和病毒产品质量等。新建细胞系的传代稳 定性研究还需关注随着细胞传代代次增加成瘤性和/或致瘤 性风险。经基因修饰建立的细胞系/株的传代稳定性研究还需 关注传代过程中基因修饰部分的稳定性，如基因序列、拷贝 数、蛋白表达稳定性。根据传代稳定性研究结果制定合理的 限传代次，并在实际生产过程中加以限定。另外，需开展规范的细胞库贮存稳定性研究，制定合理 的贮存稳定性考察方案，关注在长期贮存过程中细胞活率、细胞生长特性、生产病毒能力等的变化。根据研究结果确定 细胞库的贮存条件，细胞库在拟定的贮存条件下可满足生产 需求。2.其他生产用物料其他生产用物料系指除前述起始原材料外，在生产中使 用的原材料，如培养基、细胞培养和生产中的添加成分、纯 化试剂、辅料和生产过程中使用的关键耗材。其他生产用物料的质量应符合其预期用途，其选用需要 考虑其来源、组成、用途和质量控制情况等。应对可能影响 产品质量的原材料在最终产品或工艺最适阶段中的残留情 况进行研究和风险评估，必要时，设定合理的限度进行监控。原则上，生产过程中应尽可能避免使用动物/人源材料（如牛血清、胰蛋白酶等）或可能对产品产生非预期影响的 原材料（如酶、抗体、细胞因子、血清、抗生素、裂解剂、16/35病毒稳定剂等），研究中应充分评估其使用的必要性、合理性 和安全性，明确使用阶段及用量，并说明其预期用途，根据 供应商检测报告和安全性评估拟定合理的企业内控标准。如 某些关键原材料的检测标准是微生物限度，建议使用前进行 除菌过滤以进一步确保安全性。对于牛血清、动物胰蛋白酶 等，如有可能，建议尽量以成分明确的血清替代物或重组来 源制品（如重组胰蛋白酶）替代。如经研究认为必须使用，应对其来源（如使用的动物是否来源于非疫区）、生产工艺（如是否采用y射线辐照）、质量标准（如是否开展全面的外 源因子检测）、TSE/BSE风险等进行充分评估，并建立企业 内控标准。另外，生产过程中不得使用青霉素等区内酰胺类 抗生素、链霉素，以及其它如澳乙锭等有毒试剂。辅料相关要求请见“六、生产工艺”项下“122辅料”部分。生产过程中使用的关键耗材，如一次性生物反应器、移 液管路、一次性配液袋/储液袋、一次性除菌过滤器/过滤膜包 等，应具有稳定的物理或化学特性，与直接接触的溶液、中 间产物有较好的相容性。结合耗材的材质、使用阶段、供应 商检测报告和生物相容性研究等因素综合评估使用耗材和 容器的安全性。六、生产工艺1.工艺研究与开发生产工艺开发系基于对产品已有的认知、研究基础和风 17/35险评估，以及工艺参数与产品关键质量属性的相关性，逐步 建立工艺步骤和关键工艺参数。工艺开发过程中常伴随工艺优化和调整，应充分评估这 些变更对产品质量的影响，开展相应的可比性研究，可参考 ICHQ5E等相关指导原则的要求。早期临床试验阶段，由于 生产工艺尚在完善，批次数量较少，可比性研究可根据有限 批次的研究结果进行比较，需关注变更对产品相关质量属性 如安全性（如杂质残留等）、滴度、纯度、生物学活性等的影 响。随着研发进程不断推进和对产品生产工艺、质量属性认 知的不断深入，可比性研究应更加全面，一般可能包括工艺 性能（工艺参数和过程控制）、放行检测、扩展特性和稳定性 研究等。由于目前认知有限，某些分析方法变异性可能较大,关键质量属性与临床有效性相关性尚不清楚或难以建立等 因素，使得药学可比性存在较大的不确定性，建议对研究中 观察到的质量差异进行充分评估。当现有认知或平台经验无 法预测质量属性的差异对产品安全性和/或有效性的影响时,应考虑进一步开展非临床和/或临床的桥接研究。1.1 原液生产工艺目前常见的原液生产工艺包括细胞培养、病毒感染、病 毒收获和病毒纯化等一系列操作过程。研究中需结合病毒和 生产用细胞的特性采用适宜的培养方式，同时还应考虑病毒 质量的可控性、工艺的可放大性、技术的成熟程度、工艺操 18/35作的便利性等进行设计和制定原液生产工艺。结合充分的工艺研究和开发，确定细胞培养和收获工艺 相关参数，如培养时间、培养温度、细胞密度、病毒感染复 数（MOD或质粒转染比例（如适用）、病毒收获条件等，并 拟定合理的工艺参数范围。一般情况下，为确保产品质量批 间一致性，病毒接种培养时，同一工作种子批需要根据研究 并按照一定范围的MOI接种培养。纯化工艺需充分考虑病毒 理化特性、病毒活性以及杂质去除效果等进行开发与研究，根据研究结果，确定工艺步骤和工艺参数。1.2 制剂生产工艺1.2.1 制剂处方研究结合质量研究和稳定性研究对辅料类型、用量等进行筛 选，研究过程中建议关注病毒滴度、纯度、生物学活性、不 溶性微粒、可见异物等质量属性的变化，如制剂类型为冻干 剂，还需研究冷冻干燥和复溶后样品外观、pH值、水分等质 量属性的变化。溶瘤病毒产品常见低温冷冻条件下保存，因 而制剂处方中一般含有冷冻保护剂、冻干保护剂等功能性辅 料，建议在处方筛选研究中充分开展冷冻保护剂和冻干保护 剂的种类、加入量的研究。在确保产品稳定的前提下，尽可 能选择组分明确、质量可控、安全性风险较小的辅料。1.2.2 辅料制剂辅料质量应满足其预期功能，并符合中国药典 19/35通则“生物制品生产用原材料及辅料的质量控制”的相关要求。辅料的选择和用量应基于充分的制剂处方筛选研究和 开发，处方中应尽可能避免使用动物/人源辅料，如必须使用，应开展充分的研究以证明其使用的必要性、安全性和合理性。处方中如果使用新型辅料，需进行充分的生产工艺、质量、稳定性等研究，做好供应商审核等，制定相应的质量标准/内 控标准，并参照新药用辅料非临床安全性评价指导原则 进行相关的研究。1.2.3 制剂工艺研究制剂生产工艺一般指从纯化原液或配制原液（如适用）到最终制剂的过程。制剂工艺研究中应考虑配制、除菌过滤（如适用）、灌装、冻干（如适用）等操作步骤，结合工艺开 发和研究，制定合理的工艺步骤和参数范围。由于溶瘤病毒 是具有复制能力的活病毒，为降低其在生产过程中的传播风 险，建议尽可能采用密闭灌装方式。另外，制剂生产规模建 议与原液生产规模相匹配，尽量避免采用不同批次原液混合 后进行半成品或成品制备的情况。在某些情况下，限于病毒 的物理性质，工艺步骤中无法进行除菌过滤操作，则应加强 生产用原材料的质量控制和加强生产工艺过程控制，以及制 定相应措施等，控制污染风险。1.3 工艺过程控制为确保工艺过程的重现性和产品质量的批间一致性，强20/35化生产过程中的风险排查，应制定合理的工艺过程控制项目 和可接受标准。工艺过程控制项目应结合工艺特点和产品特 点综合考虑确定，如，细胞传代次数、细胞密度、细胞活率、病毒滴度、纯度和杂质、生物学活性等。另外，工艺过程控 制中还应关注微生物安全相关项目的检测和控制，建议在生 产工艺的合适阶段进行微生物限度或无菌、细菌内毒素、外 源病毒因子和支原体等安全性项目的监控。某些工艺过程控 制项目需采用快速检测方法，则需进行充分的研究与验证,并建议与中国药典方法进行比较研究（如适用）。2.工艺验证工艺验证的目的是证明已经确定的生产工艺能否按照 拟定的工艺步骤和参数持续稳定的生产出符合预期标准的 产品。一般情况下，商业化生产工艺确定后，应在上市申请 前采用代表性商业化生产工艺和规模进行规范的工艺验证,并在上市申请时提供完整的工艺验证报告。验证研究的批次 数量应结合工艺复杂程度，工艺可变性水平，前期工艺研究 的充分性和数据积累水平，以及对生产工艺的认知水平等综 合考虑，一般不少于三批，如有其他特殊情况，建议提前与 监管机构开展沟通交流。验证研究的结果应能证明工艺的稳 健性、可控性，以及过程控制项目和验收标准设定的合理性。此外，验证研究可能还包括（但不限于）培养基/缓冲液制备 和放置条件验证、层析填料使用寿命验证、除菌过滤验证、21/35无菌工艺模拟验证、关键原材料灭菌性能验证等。如生产工 艺过程中涉及到中间体暂存，需提供支持其暂存条件和时间 的验证数据。七、质量研究和质量标准产品研发过程中需对产品的质量进行全面、系统、深入 的研究，制定出科学、合理、可行的质量标准，并不断地修 订和完善，确保其安全、有效。1.质量研究质量研究需选择代表性工艺批次（如非临床研究批次、临床研究批次和/或商业化工艺批次等）以及适当生产阶段的 样品（如起始原材料、工艺中间体、原液、制剂等）作为研 究对象，采用物理化学、生物学和免疫学等一系列分析方法 进行研究。研究项目需全面充分，尽可能涵盖所有可能与产 品安全性、有效性相关的质量项目，一般包括鉴别和结构分 析，生物学活性，含量，纯度、杂质和污染物，以及其他特 性等。1.1 鉴别和结构分析建议采用多种技术手段和方法对病毒基因组、病毒形态 和结构等进行鉴别。基因组水平可采用测序、限制性内切酶、PCR等方法对病毒基因组、目的基因或调控基因特定序列进 行确认。一般情况下，限制性内切酶法和PCR等方法仅能对 某些特征性序列进行确认，无法获得全基因组序列中的其他 22/35非预期突变的信息，因而建议采用代表性生产工艺的若干批 次进行全基因组测序。如在测序中发现基因序列或位点的突 变，应对突变原因进行分析，开展分子变体对产品安全性和 有效性影响的评估，也可基于文献报道和/或根据其对蛋白质 相互作用或功能潜在影响的模型进行评估。病毒形态和结构的鉴别一般在颗粒完整性和蛋白质水 平进行分析，通常可采用电镜法对病毒颗粒结构、颗粒大小 分布等进行分析。蛋白质鉴别可采用蛋白电泳、免疫印迹、免疫中和试验（血清型鉴别）等进行分析。1.2 生物学活性根据产品的作用机制、生物学特性和基因修饰目的等建 立可反映体内作用机制的生物学活性指标。如果产品设计有 多种功能，建议分别建立相应的活性检测方法，根据活性与 产品作用机制的相关性，确定一项或多项适宜的活性检测方 法作为质量放行检测项目。生物学活性可采用体外法检测溶 瘤病毒产品对代表性易感肿瘤细胞的毒性/裂解作用和/或其 在细胞中的复制能力等，或采用动物/人体肿瘤细胞原代培养 物进行检测。在某些情况下，当体外实验并不能完全反映溶 瘤病毒产品的体内效应时，可考虑采用动物体内检测方法进 行检测。在有些溶瘤病毒产品中，生物学活性检测还需要结 合转基因表达水平和生物学特性进行定量和定性分析。生物 学活性分析中，需要建立和使用适当的标准品，用于标定待 23/35测样品的相对效价或计算待测样品的IC50值。1.3 含量溶瘤病毒产品可通过物理滴度（如病毒总颗粒数、基因 组拷贝数、结构蛋白含量等）、感染性滴度等检测确定病毒含 量。物理滴度可通过物理、生物物理等方法来测定颗粒的物 理数量，或测量病毒颗粒内已知分子量和拷贝数的某种代表 性的结构蛋白来评估病毒颗粒数。感染性滴度可采用噬斑形 成单位（PFU）、半数组织/细胞培养感染剂量（TCID50/CCID50）等基于细胞的体外检测方法，感染性滴 度检测用细胞的选择应考虑病毒载体的宿主范围和组织嗜 性，选择敏感且合适的细胞系/株，检测用细胞需进行建库管 理，并按照中国药典相关要求对细胞库进行全面检定。另外，建议进行物理滴度与感染性滴度的比值的研究和监测,可以研究并了解产品质量批间一致性和工艺稳健性，同时可 以监控杂质含量情况。1.4 纯度、杂质和污染物由于病毒结构复杂、传代过程中易发生变异及生物学特 性的改变，且对于不同病毒的表征研究手段也比较有限，难 以用单一的纯度指标进行衡量，因而，产品纯度和杂质的研 究需结合病毒结构特点、生产工艺特点等选择适宜的分析方 法和检测项目，并拟定合理的标准限度。1.4.1 产品相关杂质/物质24/35产品相关杂质/物质一般指生产中产生的与产品相关的 非预期产物，一般包括分子变体、非完整包装病毒（如非包 膜病毒颗粒、空壳病毒颗粒等）、错误包装病毒颗粒、无活性 病毒颗粒、病毒颗粒聚集体等。一般情况下，可能影响到产 品安全性和/或有效性的物质归类为工艺相关杂质，建议采用 适宜的方法进行残留量检测，并进行安全性评估，必要时考 虑纳入质量标准；研究数据表明对产品安全性和/或有效性无 影响的物质归类为工艺相关物质，需要在合适的阶段进行监 测，以确保批间一致性。目前大多数溶瘤病毒已经经过基因修饰后删除或插入 了部分基因序列，或者已经经过减毒操作，以提高其选择性 并降低其毒性。在病毒包装或生产过程中，这些病毒可能会 通过重组或回复突变形成初始病毒（或野生型病毒）等，另 外，病毒在多次传代或生产过程中可能会发生基因序列和/或 氨基酸序列突变，这些非预期的分子变体可能会改变产品复 制选择性、溶瘤特性，也可能会影响产品对肿瘤细胞的杀伤 功能以及影响插入基因表达水平和生物学特性等，因而需要 对这种非预期的分子变体进行研究和控制。鼓励采用适宜的、先进的分析方法进行分子变体的研究和检测，并结合非临床 和/或临床数据拟定合理的标准限度。在病毒生产过程中，可能会由于病毒包装不完整或错误 包装产生非完整包装病毒、错误包装病毒、无活性病毒颗粒 25/35等产品相关杂质，建议结合颗粒大小、生物学特性及理化特 性等差异，选择不同原理的分析方法进行研究，如高效液相 色谱法、透射电镜法、流式细胞仪法、酶联免疫法、分析超 速离心法、紫外分光度计法、PCR法等。结合残留量的检测 结果，制定合理的质量控制策略。病毒颗粒易发生聚集形成聚集体，可能存在潜在的安全 性风险，鼓励采用先进、可量化的方法进行检测，并结合聚 集体对产品体外生物学活性和体内效应的影响综合评估风 险，必要时进行质量控制。1.4.2 工艺相关杂质工艺相关杂质主要来源于生产工艺本身，主要包括起始 原材料来源（如细胞碎片、宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白等）、生产用原材料来源（如培养试剂、纯化试剂等）和设备/耗材 来源的杂质。研究中需对潜在的工艺相关杂质进行鉴定、评 估，并进行定性和/或定量分析，结合工艺相关杂质残留水平 进行安全性评估。由于宿主细胞DNA残留可能影响产品安全性，因而一 般要求对其残留量进行检测和控制。生产中若使用了肿瘤细 胞系（如Hela细胞），或携带致癌基因、病毒改造序列的细 胞（如HEK293T）,需开展更有针对性的研究，如对宿主细 胞DNA残留量和片段大小进行控制，建议尽量将残留DNA 控制在10ng/剂以内，将DNA残留片段大小控制在200bp以 26/35下。对于已知的、具有潜在安全性风险的特定转化序列，如 293T细胞中的E1A、SV40大T抗原序列,HeLa细胞的E6、E7基因序列等，应进行相应的残留量检测和控制。生产工艺过程中使用的细胞培养添加物，如牛血清、核 酸酶、（重组）胰蛋白酶、TritonX-100细胞因子等，应检测 残留量并进行安全性评估。设备/耗材来源的杂质如可浸出物和可提取物、色谱填料 脱落物等应结合杂质类型、残留水平等进行相应的安全性评 估，关注其对产品安全性和有效性的影响。以上工艺相关杂质的可接受水平和标准限度，需要结合 非临床和/或临床数据或研究经验及业界与监管共识等合理 制定。1.4.3 污染物污染物指生产过程中引入的微生物（如细菌、真菌、支 原体、外源病毒因子等）或其他相关组分（如细菌内毒素等）。生产过程中需采取措施避免引入污染物并对其进行相应的 控制，建议采用放行检测，同时辅以过程监控的策略。1.5 其他特性结合产品类型及不同剂型开展研究，可能包括外观、颜 色、澄清度、可见异物、不溶性微粒、pH值、渗透压摩尔浓 度、装量/装量差异、水分（如适用）、辅料含量等。27/352.质量标准质量标准一般根据产品的质量研究而确定，质量研究中 需要确定关键质量属性，一般情况下，关键质量属性应纳入 质量标准。由于不同产品生产工艺不同，需结合工艺特点针 对不同阶段样品制定适用的质量标准。质量标准一般包括原 液（如有）、半成品（如有）和成品质量标准。质量标准主要由检验项目、标准限度和分析方法三方面 组成。在全面、有针对性的质量研究基础上，充分考虑产品 的安全性和有效性，以及生产、流通、使用各个环节的影响，确定控制产品质量的检验项目和标准限度，制定出合理、可 行的、并能反映产品特征和质量变化情况的质量标准，有效 地控制产品质量和批间质量的一致性。2.1 检验项目质量标准的检验项目应在充分的质量研究基础上，根据 产品特点、质量属性与工艺相关性、稳定性研究和安全性评 估等综合确定。一般包括鉴别、纯度和杂质、含量、生物学 活性、污染物和一般检项等。鉴别试验需结合产品特点选择相对特异性的方法。纯度和杂质的检测建议采用不同原理的方法。生物学活性应能反映药物的体内预期作用机制和疗效 或具有相关性。一般检项需根据制剂处方和剂型等制定适宜的项目，除28/35中国药典规定的常规项目外，还应考虑增加功能性辅料 含量检测，冻干制剂中水分检测等。经研究确定为关键质量属性，但是未纳入质量标准的检 验项目，应有充分的理由、验证研究的支持和/或合理的质量 控制措施。2.2 标准限度质量标准的标准限度确定通常基于安全性和有效性的 考虑，一般需结合产品特点、临床试验暴露情况、各个阶段 样品（特别是临床试验批次）检测数据、分析方法变异性、稳定性研究情况等综合制定，标准限度的制定应有充分的依 据。2.3 分析方法质量标准的分析方法是产品质量控制的基础，为确保采 用的分析方法适合于相应的检测要求，应进行方法学研究选 择适宜的方法，并进行充分的验证。如适用且经研究后，分 析方法优先选择中国药典规定的方法，选用药典以外的 分析方法，需证明替代方法相比药典方法具有等效性或更优 越。分析方法可随着产品研究进展逐渐完善，在确证性临床 试验开展前建议完成方法学的确认或全面验证，以保证确证 性临床试验用样品的质量与商业化生产产品保持一致。临床 试验期间如发生分析方法的优化或变更，应对方法差异进行 分析和论证，并对变更前后的方法进行比较，以证明两种方 29/35法具有等效性。2.4 标准品/对照品为确保检测结果的可靠性和准确性，一般需建立标准品/对照品。建议根据不同研发阶段的质控要求，采用代表性样 品建立标准品/对照品，做好不同阶段对照品/标准品的质量 桥接研究。溶瘤病毒产品中使用标准品/对照品一般用于鉴别、理化和生物学活性测定。标准品/对照品的建立和制备可参照 中国药典“生物制品国家标准物质制备和标定”的相关要 求，并开展全面的质量研究、标定和稳定性研究。八、外源病毒因子检测和控制溶瘤病毒产品生产中可能存在病毒污染的风险，由于溶 瘤病毒具有复制能力，因而外源病毒因子检测和控制存在一 定挑战，常见的控制策略包括：1.生产用物料的控制细胞库、病毒种子批以及生产过程中使用的生产用原材 料需进行外源病毒因子的全面检测和控制。细胞库的外源病毒因子检测可参考中国药典和ICH Q5D相关要求，结合细胞来源、传代或改造历史、建库过程 中使用原材料情况等进行风险评估后确定，一般包含非特异 性病毒、逆转录病毒、细胞种属特异性病毒、牛源性病毒（如 使用牛血清）、猪源性病毒（如使用动物来源胰蛋白酶）、及 其他潜在外源病毒等。30/35病毒种子批的外源病毒因子检测可通过加入中和抗体 消除溶瘤病毒对检测结果的影响，中和抗体的选用应避免抗 血清中存在中和潜在外源病毒因子的抗体，使用的中和抗体 量应为完全中和溶瘤病毒的最低使用量，并且检测样品的浓 度应合理且有研究依据，避免检测样品被过度稀释造成检测 灵敏度降低的风险。如因中和抗体不能充分中和溶瘤病毒，检测结果受到干扰时，可在病毒种子生产中设置对照细胞，对照细胞的外源病毒因子检测应符合现行中国药典的要 求。另外，也可考虑增加聚合酶链反应（PCR）、深度基因测 序技术等敏感检测技术排除特异性的外源病毒因子污染的 风险。生产过程中使用的动物/人源材料应结合原材料来源进 行特异性病毒检测，如人源性病毒、牛源性病毒、猪源性病 毒等，病毒检测种类应全面，检测方法应满足要求。另外，还需要加强这类原材料的供应商审计，建立规范的质量管理 体系，并结合供应商检测标准和风险评估建立企业内控标准。2.生产过程中的检测与控制选择生产过程中最适阶段的样品（如未处理的培养收获 液）进行外源病毒因子的检测和控制，开展相应研究以说明 生产过程中检测阶段制定的合理性。检测方法方面，具体要求见“第八部分1.起始原材料和 生产用原材料的控制31/35以上可能是针对这类产品外源病毒因子