学位论文：棉花质核同源与质核异源雄性不育的质核互作效应比较.pdf

分类号 S562 密级公开UDC 633.5博士学位论文棉花质核同源与质核异源雄性不育的质核互作效应比较学科专业 作物学 万方数据棉花质核同源与质核异源雄性不育的质核互作效应比较摘要棉花是世界上最重要的纤维作物，也是重要的产油作物之一。但近年 来，我国种植棉花的比较效益不断下降，棉花产业大幅萎缩。杂种优势利 用是提高植棉效益的有效途径，创制细胞质雄性不育(Cyto plasmic Male Sterility,CMS)系是利用杂种优势的基础。但目前棉花杂种优势的利用以哈 克尼西棉细胞质来源的CMS系为主，细胞质来源单一，且因其细胞质供体 为二倍体种，而细胞核供体为四倍体种，质核互作严重不协调，负效应显 著。只有选育质核源于同一品种的质核同源CMS系才能最大程度降低质核 互作负效应。但前人尚未创制出质核同源CMS种质，更不明确其发生机理。本研究利用本课题组前期创制的3个质核同源CMS系及其组配的2个质 核异源CMS系，比较研究了二者的花器官形态、败育过程、活性氧(ROS)相关指标代谢、线粒体DNA(mtDNA)序列以及转录组与甲基化组差异，得出以下主要结果：形态观察表明，质核同源与质核异源CMS系的植株和叶片形态无明显 差异，但是质核异源CMS系花柱相对突出，花丝更加短小且花药也较干瘪。败育过程的细胞学观察结果显示，二者的败育类型均为无花粉型，其 败育发生于花粉母细胞减数分裂期至单核早期，且在整个花药发育过程中 绒毡层细胞均不发生降解，但质核异源CMS系的败育相对较早，且未发现 四分体结构。I万方数据ROS代谢相关生理指标表现为，质核异源CMS系的POD、CAT的酶活 性在四分体至成熟花粉粒时期均低于质核同源CMS系，而代谢产物MDA含 量与酶活性表现相反；因保持系中的MDA含量低于不育系，且质核异源 CMS系的MDA在四分体阶段至成熟花粉粒阶段含量高于质核同源CMS系，推测由于质核的异质性导致ROS的大量发生。mtDNA重测序结果表明，虽然每个棉花材料都预测到36个编码蛋白基 因，但rRNA和tRNA个数存在差异，且保持系中tRNA个数均多于不育系。在同质异核系统中，质核异源CMS系单核昔酸多态性(Sing le nucleo tide po lymo rphism,SNP)个数均大于质核同源CMS系，而在 同核异质系统中，质核异源CMS系总SNP个数却小于质核同源CMS系，说 明在CMS质核互作系统中，细胞核基因组对总SNP的贡献大于细胞质。以 保持系线粒体基因组为参考，比较5个CMS系线粒体基因组结构性变异(Structural variatio n,SV)发现，质核异源CMS系较质核同源CMS更为复 杂，说明质核异源互作更易导致mtDNA结构变异。比较8个供试材料线粒体 基因组的共线性发现，质核同源CMS系与保持系共线性程度较高，且有4个 ORF s(o rfll5b o rf341a o rf591a 和 o rf609a)因具备CMS相关基因的特 点而被确定为与CMS相关的关键候选基因，因为质核同源CMS最大程度避 免了不育以外的遗传累赘。全基因甲基化组和转录组联合分析发现，在质核同源CMS系07-113A及 其保持系07-U3B之间共鉴定了 847个差异甲基化区域差异表达基因(DMEGs),且07-113A比07-113B具有更高的甲基化程度。在DMEGs中，高甲基化基因在“淀粉和蔗糖代谢”途径中明显富集。推测转录抑制与 万方数据07-113A的高甲基化有关，由此导致基因表达下调；淀粉及其生物合成中的 糖通量的减少，也很可能导致基因表达的改变，最终导致花粉不育。据此 确定了5个可能与棉花CMS有关的关键基因，其主要参与碳水化合物和能量 代谢、雄配子体发育和细胞程序性死亡等过程。综合以上分析结果，本研究表明，质核同源系统受核质互作效应影响 较小，是研究雄性不育的最佳组合。并且确定了几个可能与棉花CMS有关 的关键基因。该研究为棉花不育分子机制假说提供了一些证据，同时将为 创制质核互作优化的CMS系提供理论依据，并为分析质核同源与质核异源 CMS机理奠定基础。关键词：棉花；质核同源CMS；质核异源CMS；线粒体基因组重测序；DNA 甲基化in万方数据DIFFERENCES OF NUCLEAR-CYTOPLASMIC INTERACTION OF HOMOZYGOUS AND HETEROZYGOUS CYTOPLASM-NUCLEAR BETWEEN COTTON CMS LINESABSTRACTCo tto n is the wo rlds mo st impo rtant fibre cro p and o ne o f the mo st impo rtant o il-pro ducing cro ps.Ho wever,in recent years,the co mparative efficiency o f g ro wing co tto n in China has been declining and the co tto n industry has shrunk sig nificantly.The creatio n o f CMS(cyto plasmic male sterility)lines is the basis fbr explo iting hetero sis,which is an effective way to impro ve the efficiency o f co tto n planting.Ho wever,the current explo itatio n o f co tto n hybrid advantag e is do minated by CMS lines o f cyto plasm o rig inated fro m Haco nic co tto n,the cyto plasm is o f sing le o rig in,and because its cyto plasmic do no r is a diplo id species and its nuclear do no r is a tetrapio id species,the cyto plasm-nuclear interactio ns are severely unharmo nio us,with sig nificant neg ative effects.The o nly way to minimise the neg ative effects o f cyto plasm-nuclear interactio n is to select cyto plasm-nuclear ho mo lo g o us CMS lines that o rig inate fro m the same species.Ho wever,no cyto plasm-nuclear ho mo lo g o us CMS g ermplasm has been created,and the mechanism o f its o ccurrence is no t clear.In this study,we used three cyto plasm ho mo lo g o us CMS lines created by IV万方数据o ur g ro up and two cyto plasm hetero lo g o us CMS lines o f o ur g ro up.We co mparatively studied the flo ral o rg an mo rpho lo g y,abo rtive pro cesses,reactive o xyg en species(ROS)metabo lism,mito cho ndrial DNA(mtDNA)sequences,and transcripto mic and methylo mic differences between the two and came up with the fo llo wing main results:1.Mo rpho lo g ical o bservatio ns sho wed that there was no sig nificant difference in plant and leaf mo rpho lo g y between the cyto plasm ho mo zyg o us and cyto plasm hetero zyg o us CMS lines,but the cyto plasm hetero zyg o us CMS lines had mo re pro minent styles,sho rter filaments and drier anthers.2.Cyto lo g ical o bservatio ns o f the abo rtio n pro cess sho wed that bo th abo rtio n types were po llen-free,and their abo rtio n o ccurred fro m meio sis to early mo no nuclear stag e,and no deg radatio n o f the cho rio nic felt layer cells o ccurred thro ug ho ut anther develo pment,but the abo rtio n o f the cyto plasm hetero lo g o us CMS line was relatively early,and no tetrad structure was fo und.3.Physio lo g ical indicato rs related to ROS metabo lism sho wed that the enzymatic activities o f POD and CAT were lo wer in the tetrad to mature po llen g rain perio d in the cyto plasm hetero lo g o us CMS lines than in the cyto plasm ho mo lo g o us CMS lines,while the MDA co ntent as the end pro duct o f ROS metabo lism and the enzymatic activities sho wed o ppo site perfo rmance;Since the MDA co ntent in the maintainer lines was lo wer than that in the sterile lines,and the MDA co ntent in the cyto plasm hetero zyg o us CMS lines was hig her at the tetrad stag e to the mature po llen g rain stag e than that in the cyto plasm v万方数据ho mo zyg o us CMS lines,it was speculated that the hig h o ccurrence o f ROS was due to cyto plasm hetero g eneity.4.The mtDNA resequencing results sho wed that altho ug h 36 co ding pro tein g enes were predicted fo r each co tto n material,there were differences in the number o f rRNAs and tRNAs,and the number o f tRNAs was hig her in all the maintainer lines than in the sterile lines.In ho mo g eneo us hetero g eneo us systems,the number o f sing le nucleo tide po lymo rphism(SNP)was larg er than that in cyto plasm ho mo g eneo us CMS lines,while in ho mo g eneo us hetero g eneo us systems,the to tal number o f SNP was smaller than that in cyto plasm ho mo g eneo us CMS lines.It indicates that the co ntributio n o f the nuclear g eno me to the to tal SNP is g reater than that o f the cyto plasm in the CMS cyto plasm-nuclear interactio n system.Co mparing the structural variatio n(SV)o f the g eno mes o f five CMS lines,using the mito cho ndrial g eno mes o f the maintenance lines as a reference,we fo und that the plasmo n-nuclear hetero lo g o us CMS lines were mo re co mplex than the plasmo n-nuclear ho mo lo g o us CMS.This indicates that cyto plasm-nuclear hetero lo g o us interactio ns are mo re likely to lead to structural variatio n in mtDNA.Co mparing the co variance o f the mito cho ndrial g eno mes o f the eig ht test materials,it was fo und that the cyto plasm ho mo lo g o us CMS lines had a hig h deg ree o f co variance with the maintenance lines,and fo ur ORF s(orfl 15b,orf341a,orf591a and orf609d)were identified as key candidates asso ciated with CMS because they po ssessed the characteristics o f CMS-related g enes,because VI万方数据cyto plasm ho mo lo g o us CMS minimized g enetic cumberso meness beyo nd sterility.5.The co mbined who le-g ene methylatio no me and transcripto me analysis revealed that a to tal o f 847 differentially methylated reg io n differentially expressed g enes(DMEGs)were identified between the cyto plasm ho mo lo g o us CMS line 07-113A and its maintenance line 07-113B,and 07-113A had a hig her deg ree o f methylatio n than 07-113B.In DMEGs,hypermethylated g enes were sig nificantly enriched in the starch and sucro se metabo lism pathway.It is hypo thesized that transcriptio nal repressio n is asso ciated with the hypermethylatio n o f 07-113A,which leads to do wn-reg ulatio n o f g ene expressio n.Chang es in starch and the reduced sug ar flux in its bio synthesis are also likely to lead to altered g ene expressio n and ultimately to po llen sterility.Acco rding ly,five key g enes that may be asso ciated with CMS in co tto n were identified,which are mainly invo lved in pro cesses such as carbo hydrate and energ y metabo lism,male g ameto phyte develo pment and pro g rammed cell death.Co mbining the results o f the abo ve analysis,this study sho wed that the system o f ho mo lo g o us cyto plasm and its nucleus were least affected by the nucleo-cyto plasmic interactio n effect and were the best co mbinatio n fo r studying male sterility.And several key g enes that may be related to CMS in co tto n were identified.This study pro vides so me evidence fbr the hypo thesis o f the mo lecular mechanism o f co tto n sterility,and will pro vide a theo retical basis fbr the creatio n o f CMS lines o ptimized fo r cyto plasm-nucleus interactio ns,as vn万方数据well as a basis fo r analyzing the mechanism o f cyto plasm-nucleus ho mo zyg o us and cyto plasm-nucleus hetero zyg o us CMS.KEY WORDS:Co tto n;CMS line with ho mo lo g o us cyto plasm and its nucleus;CMS line with hetero lo g o us cyto plasm and its nucleus;Mito cho ndrial g eno me resequencing;DNA methylatio nvin万方数据目录摘要.IABSTRACT.IV第一章前言.11.1 植物杂种优势利用与雄性不育研究概述.11.1.1 植物杂种优势利用.11.1.2 植物雄性不育的类型及其遗传基础.21.2 植物CMS的发生机理研究进展.41.2.1 CMS发生过程的解剖学与细胞学特征.4122 cMs的发生与活性氧（ROS）代谢异常.51.2.3 CMS的发生与线粒体DNA变异.61.2.4 CMS的发生与嵌合开放阅读框.71.2.5 CMS的发生与基因转录.81.2.6 CMS的发生与DNA甲基化.91.3 棉花杂种优势利用与雄性不育研究进展.101.3.1 前人研究进展.101.3.2 本团队前期研究进展.111.4 本研究拟解决的科学问题及其研究内容.121.4.1 拟解决的科学问题.121.4.2 研究内容.121.5 本研究的目的及意义.13第二章棉花质核同源与质核异源CMS系的细胞学观察.142.1 材料与方法.142.1.1 研究材料.142.1.2 花器官形态特征及育性观察.152.1.3 花粉活力检测.152.1.4 花药形态以及败育特征观察.152.1.5 不同发育时期花药的细胞学特征观察.152.2 结果与分析.162.2.1 质核同源与质核异源CMS系的花器官形态观察特征.162.2.2 质核同源与质核异源CMS系小泡子发育阶段与外部形态的关系.172.2.3 质核同源与质核异源CMS系的石蜡切片比较分析.202.3 小结与讨论.23IX万方数据2.3.1 棉花CMS败育与绒毡层.232.3.2 棉花CMS系小抱子败育时期及其细胞学特征.23第三章棉花质核同源与质核异源CMS系活性氧代谢相关指标比较分析.253.1 材料与方法.253.1.1 研究材料.253.1.2 实验试剂和实验方法.253.2 结果与分析.263.2.1 POD活性分析.263.2.2 CAT活性分析.273.2.3 MDA含量.293.3 小结与讨论.30第四章棉花质核同源与质核异源CMS系对线粒体基因组的效应.314.1 材料与方法.314.1.1 研究材料.314.1.2 实验仪器.314.1.3 棉花mtDNA的提取.314.1.4 棉花mtDNA的测序与组装.314.1.5 棉花mtDNA基因组序列分析.314.1.6 棉花mtDNA的基因预测与功能注释.324.1.7 SNPs的检测与标注.324.1.8 InDeis检测.324.1.9 SV检测.324.1.10 共线性分析.324.2 结果与分析.334.2.1 mtDNA的质量检测.334.2.2 棉花mtDNA测序数据概况.334.2.3 棉花mtDNA的结构分析.344.2.4 SNP检测及注释.39425 InDeis检测及注释.424.2.6 SV检测与分析.434.2.7 线粒体基因组共线性分析.444.2.8 CMS系中的特有的ORF s分析.464.3 小结与讨论.494.3.1 棉花线粒体基因组结构和特点.504.3.2 细胞质雄性不育与ORF.50第五章质核同源CMS系07-U3A与保持系07-113B甲基化组与转录组学联合分析.51x万方数据5.1 材料与方法.525.1.1 植物材料和处理.525.1.2 DNA和RNA的提取、定量和纯化.525.1.3 DNA甲基化文库的构建和数据分析.525.1.4 cDNA文库构建和数据分析.535.1.5 DEG鉴定和基因功能注释分析.535.1.6 通过实时定量PCR对DMG进行验证.535.1.7 GO和KEGG对DMEGs(DEGs asso ciated with DMRs)的富集分析.545.2 结果与分析.555.2.1 棉花基因组DNA和总RNA的质量检测.555.2.2 07-113A和07-113B的全基因组DNA甲基化数据的分析.555.2.3 DNA甲基化模式与差异性基因表达之间的相关性.575.2.4 DMEGs的GO和KEGG富集分析.605.2.5 通过qRT-PCR验证DMEGs.625.3 小结与讨论.655.3.1 植物中DNA甲基化和细胞质雄性不育之间的关系.655.3.2 与雄性不育相关的候选基因.665.3.3 DNA甲基化对棉花CMS系雄性不育性的可能调节机制.67第六章全文总结.686.1 主要研究结果与结论.686.2 棉花CMS系雄性不育的可能分子机制.69第七章展望.707.1 本研究的创新性.707.2 问题与展望.70参考文献.72致谢.85研究生期间科研、发表论文情况.86附录I.87附表1陆地棉CDS区突变类型.87附表2同质异核海岛棉CDS区突变类型.88附表3同核异质海岛棉CDS区突变类型.89附录II.91XI万方数据缩写和中英文对照表Co mpariso n table o f abbreviatio n in Chinese and Eng lish缩写英文全称中文全称Abbreviatio nF ull name in Eng lishF ull name in ChineseCATCatalase过氧化氢酶CMSCyto plasmic male sterility细胞质雄性不育DEGsDifferentially expressed g enes差异表达基因DMEGDEGs asso ciated with DMRs差异甲基化区差异表达基因DMGsDifferentially methylated g enes差异甲基化基因DMRdifferentially methylated reg io n差异甲基化区域GOGene o nto lo g y基因本体KEGGKyo to Encyclo pedia o f Genes and Geno mes京都基因和基因组百科全书MDAMalo ndialdehyde丙二醛MtDNAMito cho ndrial DNA线粒体DNAORFOpen Read F rame开放阅读框PODPero xidase过氧化物酶qRT-PCRQuantitative Real-Time PCR实时荧光定量PCRROSReactive o xyg en species活性氧SNPSing le nucleo tide po lymo rphism单核甘酸多态性SVStructural variatio n基因组结构性变异TCATricarbo xylic Acid Cycle三竣酸循环XII万方数据棉花质核同源与质核异源雄性不宜的质核互作效应比较第一章前言棉花是世界上第一大经济作物。杂种优势利用是提高棉花产量、品质和抗性的有效 途径。由于保持系/恢复系组合后代普遍优于CMS系/恢复系的杂交组合，而二者的差异 在于：CMS系与保持系为同核异质，而保持系为质核同源且雄性可育，说明同一品种的 质核互作是物种长期进化过程中形成的优化配置，创制质核源于同一品种的质核同源 CMS系可能有利于组配出强优势组合，推测由于质核同源CMS系与保持系细胞质差异基 因较少，可将质核互作负效应降至最低；而种间核置换回交所创制的质核异源CMS系与 保持系存在叶绿体和线粒体基因组差异；而品种间质核异源CMS系的质核互作优化程度 因品种基因型而异，也可能会出现质核互作优势。实质上，品种间质核互换会因人工杂 交和自然异交而经常发生，也是杂种优势形成的重要因素。因此，要解决棉花CMS系杂 种优势利用问题必须首先解决CMS所致的质核互作负效应问题。因质核互作是CMS的基 本原理，也是CMS系杂种优势形成的主要遗传因素，因此，分析CMS系的质核互作效应 不仅是作物杂种优势利用研究的重要内容，且能为棉花CMS系的创制提供理论与技术支 撑。1.1 植物杂种优势利用与雄性不育研究概述1.1.1 植物杂种优势利用早在1908年Shull就提出了杂种优势(Hetero sis)一词，当时是用来描述玉米的杂交 种后代相对优于亲本的一种现象。杂种优势现象在生物界中普遍存在，杂种一代会有器 官发达、产量提高、体型增大等特点，在生长速率和代谢功能方面往往比其双亲表现更 强大，或者表现在对恶劣环境的抗逆力的提高。研究表明，杂种优势受亲本遗传本质影 响，在杂交一代优势表现最显著，因此成为研究者们优先的选择材料。杂交二代以及之 后优势逐渐减弱，通常表现在多个层面(Baranwal,VKetaL,2012)。自古以来杂种优势在 中国就有观察和记录。中国人早在2000年前就发现役骡-用母马和公驴交配而获得的杂 种，体力强大，生命力强，耕挽能力优于双亲，是人类历史上注意和利用杂种优势的起 源。在作物上，前人逐渐发现杂种优势是生产实践中具有重大意义的遗传改良手段，在 提高作物产量，增加经济效益、迎合市场需求、确保粮食安全等方面起着非常大的作用(F rank et al.,2018)。1763年，德国学者Ko dkeuer是第一个提出具体证据，表明杂交烟草 的生长优于亲本。1877年达尔文奠定了杂种优势理论，并提出“异花受精对后代有利和 自花受精对后代有害”思想且是第一个报道了自交玉米和异杂交玉米在生长上的差异的 研究者，由此杂种优势理论研究的序幕被拉开，并取得一定的成果(唐军等,2017)o直 1万方数据棉花质核同源与质核异源雄性不宜的质核互作效应比较到1900年重新发现孟德尔定律后，杂种优势的研究和应用才被极大推动。在20世纪世界 上粮食产量有了大规模增产，归功于杂种优势在作物育种上的逐步大量应用（Cheng,S H et al.,2007;Duvick,D N,2001）。植物杂种优势在农业生产上的大面积应用，应追溯到1933 年玉米双交种的出现。20世纪70年代初，在生产中使用了最强的单一杂交玉米的组合，产量增加了约10%,取得了令人印象深刻的进展。1966年，袁隆平提出用雄性不育法生 产杂交水稻，使强效杂交水稻在国内首次使用，中国粮食产量增加（袁隆平,1966）。作为超级稻项目的一部分，袁隆平的团队开发了一系列具有高杂交强度的新品种，使得 培育大型水稻成为可能。研究发现，与近缘亲本系相比，杂交水稻品种优势为产量提高 了 10%20%,有效缓解了国内粮食危机（冼霖和杨蒙,2018）。潘家驹研究发现有些杂 交种表现出适应能力变强、抗逆性提升、光合作用提高，光能利用率增加（潘家驹,1994）。近年来，杂交育种已被广泛用于水稻和玉米（WanetaL,2017;Yi,QetaL,2019）。与玉米和 水稻等大田作物相比，蔬菜中的杂交性状研究和使用相对较晚。日本是世界上第一个启 动杂交蔬菜研究的国家，在日本种植的大多数卷心菜、芽菜和西红柿都是杂交品种。中 国在20世纪50年代、60年代和70年代开始研究杂交种的优越性及其在蔬菜育种中的应 用。从那时起，杂交蔬菜的研究和使用得到了迅速发展。在20世纪80年代，杂交育种的 重点优势是蔬菜作物的杂交种（包括茄科和葫芦科、十字花科植物、以及黎科的菠菜、伞形科的胡萝卜、百合花等）的抗病性以及开发蔬菜新品种（刘洋,2015）。当时，杂交 育种成为蔬菜育种的主要方法，当前至少有80%的蔬菜品种是杂交种。即使在种业最发 达的国家，如荷兰、美国和以色列，主要的商业蔬菜品种也是杂交种。随着各种基因组 分析方法迅速发展，关于杂交作物的研究数据也日益积累。依托于这些大数据分析，人 们对杂种优势的复杂分子机制有了越来越深入的理解，使得基因组学越来越成为一种作 物选育的有效工具，未来，杂种优势的利用对于提高作物产量与品质依然有着十分重大 的意义。1.1.2 植物雄性不育的类型及其遗传基础植物雄性不育（Male Sterility,MS）是指在有性生殖过程中不能产生功能性花粉，表 现为雄性器官功能异常而雌性器官能正常受粉的现象。根据其遗传特征，可将MS分为 CMS和GMS（细胞核雄性不育）。前者表现母性遗传，由线粒体基因与核基因相互作用 形成；后者由细胞核基因调控，表现孟德尔遗传规律。根据花粉形态学和染色观察则可 将其分为典败、染败及圆败等类型。根据其对环境因素的反应机制，可将核不育分为光 敏型、温敏型和光温敏互作型核不育（安晓珍,2010;刘洋,2015;王保明等,2019）。CMS 又可分为两大类，即有花粉型和无花粉型：（1）无花粉型：如果由于一些原因，在植 物的花器官形成过程中，小抱子的发育被推迟，花粉管会逐渐萎缩，它们所包含的小抱 子会变得不育并被吸收，从而形成干瘪的花药并表现为不开裂，花药内没有花粉产生；（2）有花粉型：如果植物的雄性器官发育正常，花粉囊腔内的关键组织发生了异常的 2万方数据棉花质核同源与质核异源雄性不宜的质核互作效应比较程序性死亡，则会导致小抱子发育不良，从而产生活力差且功能缺陷的花粉；另一种情 况则是在植物花发育过程中，由于激素调节异常导致花药不开裂，花粉不能释放，或者 由于基因功能缺陷，导致产生的花粉不能被柱头识别，花粉管不能萌发(Ming-Che,L et al.,2014)；同时，由于CMS是由线粒体基因组决定的，可以被核基因Rf(Resto rer o f fertility)恢复，所以，CMS系与恢复系是研究核质互作的理想材料(Chase,C D,2007;刘 洋,2015)。植物的花粉发育大致分为花粉母细胞时期、四分体时期、单核期、双核期以及成熟 花粉粒时期。在植物花器官的发育过程中，花器官的类型、数目和位置等均受到遗传因 素的严格调控。被子植物的花器官具有典型的四层基本结构，从外至内依次为外皮层、内皮层、中层和最内层的绒毡层，其中雄蕊位于第3层。从雄蕊原基分化形成到成熟的 花粉形成之前，如果这些过程中的任何一个受到影响，就会导致雄性生殖器官或结构的 不正常发育，最终导致雄性不育(丁雅洁和张学琴,2007)o绒毡层细胞中含有为小抱子 的发育提供营养物质的大量细胞器，如线粒体、内质网等，被誉为“中转站”(Beding er et al 1992)O因此，绒毡层细胞在适当的时间降解是保证花粉发育正常的先决条件之一(田惠桥等,1992)o花粉在体内或体外萌发以及花粉管的伸长，离不开碳水化合物为其 提供能量基础，因此参与碳水化合物代谢相关的基因受到干扰时，都有可能引起植物雄 性不育(CKment,Cet al.,1999)。有研究表明，烟草花粉发育需要的碳源受到影响后，烟 草中细胞外蔗糖转化酶基因的功能丧失，导致烟草发育不良(Go etz,M et al.,2001)o关于CMS在分子水平上的研究要追溯到1976年，Leving s和Pring对玉米T型细胞质和 正常细胞质的mtDNA酶切图谱比较发现，两者之间存在明显的差异(Leving s,C S I et al.,1976)O大量的研究表明，mtDNA序列的异常与雄性不育有着密切的关系，如重排、插入、缺失等。近年来的研究表明，细胞质雄性不育突变体的形成与线粒体基因组重排 密切相关。线粒体基因重排常常导致嵌合基因，与其相邻的序列在一起发生突变时，形 成嵌合体，被认为是导致细胞质雄性不育的主要原因。2013年，Luo等人利用含有核糖 体蛋白基因的DNA探针进行No rthern杂交分析，结果发现了一个含有开放阅读框“政325”的一段重排的序列，然后将其与线粒体信号肽融合，结果表明，转化后的后代 是不育的，使用给恢复基因可以恢复生育能力(Luo,Det aL,2013)。在烟草研究中，利 用转基因将小麦的线粒体基因劭力引入烟草，产生了一个雄性不育的烟草品系。通过蛋 白质鉴定，发现对应长度的蛋白在烟草中得到了表达(Herno uld,M et al.,1993;Luo,D et al.,2013)o随着科学技术的不断发展，越来越多的技术手段