学位论文-蛋白-脂质互作对淀粉-脂质-蛋白复合物形成的影响.pdf

研究生学位论文（申请工程硕士学位）蛋白脂质互作对淀粉脂质蛋白复合物形成的 影响THE EFFECT OF PROTEIN-LIPID INTERACTION ON THE FORMATION OF STARCH-LIPID-PROTEIN COMPLEXES摘要淀粉、脂质和蛋白质是食物中的主要宏量营养素，是人体健康不能缺少的重要营 养物质。这三种成分在加工过程中会发生相互作用，从而对食品的质地、风味和营养 等品质特性产生重要影响。淀粉与脂质会形成淀粉-脂质复合物，在适当的条件下会与 蛋白质进一步形成三元淀粉-脂质-蛋白质复合物。尽管蛋白质和脂质也会发生相互作 用，进而可能影响淀粉-脂质-蛋白质三元相互作用及最终产品的品质，但是相关的研 究还未见报道。本课题主要探讨蛋白质和脂质的相互作用及对复合物形成的影响及相 关机制。主要研究内容和结果如下：本研究主要用玉米淀粉，P-乳球蛋白(0LG)和两种脂质通过快速粘度分析仪建 立的体系来探究蛋白与脂质相互作用对V型复合物形成的影响。采用荧光光谱法和傅 里叶红外光谱法来表征月桂酸和单棕桐酸甘油酯两种脂质与供乳球蛋白溶液在RVA 加热期间发生了相互作用。以蛋白与脂质是否预先经过RVA混合处理作为变量，使 用RVA制备复合物，用差示扫描量热仪(DSC)、X-射线衍射仪(XRD)和拉曼(Raman)光谱等来表征复合物的形成数量以及结构有序性。与PLG溶液单独经过RVA处理相比，pLG和月桂酸或单棕桐酸甘油酯共同加热 处理后内源荧光强度和最大吸收波长均有所差异，这表明PLG和月桂酸或单棕桐酸甘 油酯之间发生了相互作用。RVA、DSC和Raman的分析结果表明，两种不同添加顺序的体系中LG含量增 加，形成了更多的二元和三元复合物。当使用的BLG浓度为1-6 mg/mL时，两体系 样品中复合物的量没有显著差异。当该溶液的浓度为8 mg/mL时，LA与pLG溶液先 发生相互作用的样品中复合物的数量显著增加。傅里叶红外变换(FTIR)得到的蛋白二 级结构比例结果也表明，pLG会与LA相互作用，但这种相互作用对三元复合物的形 成没有显著影响。在使用单棕桐酸甘油酯的实验中，pLG溶液浓度0-2mg/mL时随浓度增加，复合 物形成量增加，但2-6mg/mL时，复合物的量不再随浓度变化。添加顺序引起的复合 物差异发生在低蛋白浓度，蛋白与单甘酯先发生相互作用的体系生成了更多复合物,原因可能是脂质分散的更均匀与淀粉接触几率增加，生成了更多二元复合物。总之，pLG溶液与脂质相互作用并不会抑制V型复合物形成，在某些条件下会因 为其乳化作用促进了复合物生成。关键词：淀粉；供乳球蛋白；单棕桐酸甘油酯；月桂酸；相互作用；复合物ABSTRACTStarch,lipids and proteins are main macronutrients in food,and they are essential nutrients for human health.These three components will interact during processing,which will have an important influence on the quality of food,such as texture,flavor and nutrition.There are many factors that affect the formation of complexes.Starch and lipids will form starch-lipid complexes,and under appropriate conditions,they will further form ternary starch-lipid-protein complexes with protein.Although protein and lipid also interact,which may affect the starch-lipid-protein ternary interaction and the quality of the final product,related research has not been reported yet.This topic mainly discusses the interaction between protein and lipid and its influence on the formation of starch-lipid-protein ternary interaction complex and related mechanisms.The main research contents and results are as follows:This study mainly used maize starch,p-lactoglobulin and two kinds of lipids to study the effect of protein-lipid interaction on the formation of V-type complexes.Fluorescence spectroscopy and Fourier infrared spectroscopy were used to characterize the interaction between p-lactoglobulin solution and lauric acid or glyceryl monopalmitate during RVA heating.Two kinds of complexes were prepared by RVA and whether the protein and lipid had been mixed with each other by RVA in advancew as used as a variable.Differential scanning calorimetry(DSC),X-ray diffractometer(XRD),Raman spectroscopy were used to characterize the formation and the structural order of complexes.Compared with the intrinsic fluorescence intensity and maximum absorption wavelength of pLG solutions heat-treated with lauric acid or monopalmityl glycerol,the intrinsic fluorescence intensity and maximum absorption wavelength of pLG solutions after RVA treatment alone were changed,which indicated that pLG and lauric acid or monopalmityl glycerol had an interaction.The results of RVA,DSC and Raman showed that in both systems when the pLG content increased,more binary and ternary complexes formed.When the concentration of pLG solution used was 1-6 mg/mL,there was no significant difference in the amount of complexes in the samples of the two systems.When the concentration of the solution was 8 mg/mL,the number of complexes in the sample where the LA and pLG solution heat-treated first increased significantly.The secondary structure results obtained by Fourier Transform Infrared(FTIR)also showed that pLG interacted with LA,but this interaction had no significant effect on the formation of the ternary complexes.In the experiment of monopalmityl glycerol,there were similar results.When the protein concentration increased to 2 mg/mL,the amount of complexes also increased,but when concentration at 2-6 mg/mL,the amount of complexes did not change with the concentration.The difference in complexes caused by the order of addition occurs at low protein concentration.The system which the protein and monopalmityl glycerol interacted first produced more complexes.This might be because that the lipids were dispersed more uniformly,resulting in more binary complexes.In short,the interaction of PLG solution with lipids does not inhibit the formation of V-type complexes.Under certain conditions,emulsification promotes the formation of complexes.Key wor ds:Starch,p-lactoglobulin,monopalmityl glycerol,lauric acid,interaction,complex目录1 前言.11.1 淀粉的基本组成和结构.11.2 B-乳球蛋白概述.11.3 B-乳球蛋白与脂质的相互作用.21.3.1 斤乳球蛋白与脂质的相互作用概述.21.3.2 0-乳球蛋白与脂质的相互作用的影响因素.31.4 蛋白与脂质的相互作用的分析.41.5 淀粉与脂质、蛋白质形成V型复合物.51.5.1 淀粉-脂质复合物.51.5.2 淀粉-脂质-蛋白质复合物.61.5.3 影响淀粉-脂质复合物和淀粉-脂质-蛋白质复合物形成的因素.91.5.4 复合物的形成对淀粉功能性质的影响.10155 V型复合物的应用.111.6 本课题的研究意义.111.7 本课题的研究内容.122材料与方法.132.1 实验材料及试剂.132.2 实验仪器.132.3 玉米淀粉基本成分含量测定.142.3.1 直链淀粉含量的测定.142.3.2 水分含量测定.142.3.3 脂肪含量测定.142.3.4 蛋白质含量测定.142.4 pLG-LA相互作用表征及V型复合物多尺度结构表征.142.4.1 荧光分光光度法.142.4.2 傅立叶变换红外（FTIR）光谱测算0LG二级结构.152.4.3 RVA制备复合物样品.152.4.4 DSC测定热力学性质.162.4.5 激光共聚焦显微拉曼光谱测定短程有序性.162.4.6 X-射线衍射检测长程有序性.162.5 PLG-MPG相互作用表征及V型复合物多尺度结构表征.162.5.1 内源性荧光检测.162.5.2 FTIR测定PLG的二级结构比例.162.5.3 RVA制备V型复合物样品.172.5.4 DSC测定样品热力学性质.172.5.5 LCM-Raman检测样品的短程有序性.172.5.6 X-射线衍射检测样品的长程有序性.172.6 数据处理和分析.173结果与讨论.183.1 玉米淀粉的基本成分含量测定.183.2 PLG-LA相互作用对复合物形成的影响.183.2.1 PLG的内源性荧光.183.2.2 FTIR测定PLG的二级结构比例.213.2.3 PLG-LA相互作用对混合物体系粘度的影响.213.2.4 PLG-LA相互作用对复合物热力学性质的影响.243.2.5 PLG-LA相互作用对复合物短程分子有序性的影响.253.2.6 PLG-LA相互作用对复合物长程分子有序性的影响.283.2.7 小结.293.3 PLG-MPG相互作用对复合物形成的影响.293.3.1 PLG内源荧光检测.293.3.2 红外光谱测定0LG的二级结构比例.313.3.3 两种添加顺序对混合物体系粘度的影响.313.3.4 PLG-MPG相互作用对复合物热力学性质的影响.353.3.5 PLG-MPG相互作用对复合物短程分子有序性的影响.363.3.6 PLG-MPG相互作用对样品长程有序性的影响.393.3.7 小结.404结论.414.1 论文总结.414.2 论文创新点.414.3 论文的不足.415展望.436参考文献.447攻读硕士学位期间发表论文情况.558致谢.561 前言1.1 淀粉的基本组成和结构天然淀粉一般由植物通过光合作用产生，是植物用于长期储备能量的多糖，在植 物的多种器官内都有分布，尤其是种子、块茎、果实和根。淀粉也对人类具有重要意 义，为人体提供大量能量，在日常饮食中不可或缺。除了用于食品工业，淀粉也作为 可再生、可降解的生物原料广泛应用于能源、化工等非食品工业1。淀粉多为半晶状 排列的颗粒，结晶度在1545%之间。淀粉由a-D邛比喃葡萄糖聚合而成的两种高聚物 组成，一种是直链淀粉（AM）,另一种为支链淀粉（AP）。淀粉颗粒中AM和AP的 比例根据其植物来源不同而有很大差别，在很多常见植物的淀粉中，AM比例在15 35%之间，而有些植物种子中AM占淀粉颗粒比例达40%以上PT。AM是一种D-毗 喃葡萄糖残基单元组成的线性多糖，残基之间的连接基本是依靠a-1,4糖昔键，其分 子量大小与植物来源有关，多在1051（）6 之间。直链淀粉主要是单螺旋，也有 很少的比例的链由于AP支链的参与出现了双螺旋结构。AP是是大分子多糖，支链较 多，构成单元与AM相同，但连接残基的键有所不同，是占比约为95%的a-1,4糖昔 键以及占比很少的a-1,6糖昔键。由于a-1,6糖昔键连接了很多分支链，其相对分 子质量比AM大很多，能达到IO7i（）9Da。AP的一些外链可以交织在一起形成双螺 旋，有序排列形成的薄片层为淀粉颗粒的结晶区域。根据X-射线衍射出现的不同衍 射图，可以将淀粉颗粒分成A型、B型和C型等三种晶体类型。具有A型晶体的淀 粉颗粒常见于小麦，水稻等谷物淀粉中，在马铃薯等植物的块茎中多为B型淀粉，而 C型淀粉多被认为是A、B两型混合形成，主要分布在豆类淀粉以及一些植物的根茎 和果实中7一期。另外，在一些淀粉中还存在着V型晶体，一般认为这是直链淀粉与某 些脂质或其他小分子结合形成的复合物口力也1.2 乳球蛋白概述P-乳球蛋白（PLG）是牛奶的乳清蛋白中含量最高的成分，由于其较高的营养价 值以及良好的乳化性而被广泛应用于食品工业。牛PLG是一种水溶性蛋白质，单体分 子为球状，且每个单体分子由162个氨基酸残基组成，并且具有两个二硫键以及一个 游离筑基口MU相对分子质量约为18400。0LG在溶液中的存在形式包括单体和二聚 体等，不同形式的比例与溶液pH有较大相关性，如在中性pH下0LG主要以二聚体 形式在溶液中存在，而pH低于3.0时，主要以天然单体形式存在口5-18。在pH为7.5 时，存在一个单体-二聚体平衡。BLG单体的核心结构是9条反向平行的供折叠链（A-I）,其中8条反平行链（A-H）组成一个供桶状结构（中心花萼），周围有四个弹性环，第九 条链（D参与二聚体的形成口9-2工中心花萼周围的弹性环在pH变化时会发生可逆的 开闭过程，从而调节配体与中心花萼的接触，比如当pH高于6.8时，EF环呈现开放 式构象，允许配体进入内部222。许多疏水分子都能作为LG的配体，比如视黄醇、脂肪酸、甘油三酯、芳香族化合物等磔-28。1.3 乳球蛋白与脂质的相互作用1.3.1 B-乳球蛋白与脂质的相互作用概述蛋白质和脂质之间可以发生相互作用，它们之间的作用力可能包括共价键，疏水 相互作用和氢键等29。共价键一般出现在脂肽结构中。氢键发生在脂肪酸，甘油酯的 羟基的氢原子或磷脂的头基与蛋白质的默基之间。这些基团之间的氢键比水和非极性 基团之间的相互作用强很多，且氢键在很多蛋白质-脂质复合物的结构组织中起重要作 用3。疏水相互作用一般吸热而且是由端驱动的，并且其强度随温度升高增加。温度 对疏水相互作用的这种影响表明其对蛋白质的热稳定性也很重要I。蛋白质和脂肪酸之间的相互作用最初被认为是静电相互作用，现在多被认为是疏 水相互作用29。而且蛋白质与脂质之间的疏水相互作用被认为在蛋白质聚集过程中很 重要，并且对于稳定蛋白质-脂质复合物至关重要。PLG可以和脂质以及视黄醇等很 多疏水分子发生相互作用27M。但是视黄醇和棕桐酸与PLG发生疏水结合的位置一直 存在争议：有研究认为脂肪酸会和视黄醇与P-乳球蛋白是同一结合位点，有竞争作用 因,但也有其他研究表明这两个配体在不同位点结合，比如有人使用色氨酸荧光的增 强来定量结合，发现视黄醇和棕桐酸之间没有竞争网。PLG与脂肪酸的结合增加了 PLG对蛋白酶降解的抵抗力和对热变性的抵抗力，表明与配体结合可能是稳定pLG 结构的重要因素，但是当视黄醇与LG结合时，没有发现相关稳定性的增加kN。在 存在棕桐酸的情况下，PLG的稳定性较高可能是由于结构展开前需要先与配体解离，而结合的棕桐酸可以使二聚体稳定，因为其与两个单体中的残基都发生相互作用3习。目前关于PLG具有的所有结合位点数目有不同的结论，但一般认为PLG具有两 个可以较强结合脂肪酸或其他疏水性配体的位点，一个是位于中央的疏水性P-桶状结 构（中心花萼），另一个是靠近二聚体连接区域的表面口袋囚,35。因此，PLG可以同 时连接两个亲脂性分子36,3刀。晶体学研究表明，PLG中脂肪酸的主要结合位点是中心 花萼，配体烧链的末端深深地结合在花萼的疏水部分中，竣基位于花萼入口附近13%比如与油酸结合如图1-1所示RI。蛋白质和脂质间的相互作用在食品的加工过程中也会发生，而且两者之间可能形 成蛋白质-脂质复合物，从而对食品的各种特性产生影响。比如有研究报道，蛋白质-脂质相互作用会使某些蛋白质的功能及理化性质得到改善4叫这些相互作用会受pH,离子强度，温度及系统中其他变量的影响。不同种类的蛋白与脂质之间的相互作用非 常复杂，而P-乳球蛋白是在研究相互作用时经常采用的蛋白之一。这里值得注意的是 前面提到的pLG均来源于牛,而像马和猪等非反刍动物的乳球蛋白并不具有生理结合 或在体外结合脂肪酸的能力，可能是它们缺少一些疏水残基，不形成二聚体。CD图1-1 B-乳球蛋白-油酸复合物的卡通结构图，油酸显示为球形miFig.1-1 Structure of P-lactoglobulin-oleic acid complex in cartoon representation,oleic acid is shown as spheres1.3.2 B-乳球蛋白与脂质的相互作用的影响因素pLG能够与煌链中含有8至20个碳原子的脂肪酸结合，它们之间的结合力有随 着烽链长度增加而增大的趋势，主要原因是煌链中亚甲基的增加使脂肪酸与0LG之间 的疏水相互作用增强，也可能与FA在水溶液中的较低溶解度有关，但0LG最适合与 煌链中含有16个碳原子的C16:0结合印，41，44 对于含有16个以上碳原子的脂肪酸，煌链会扭曲以进入花萼或者竣基从花萼口伸出发生偏离mi。FA中双键的数量和位置 等结构性因素也微弱地影响其与PLG的相互作用固。溶剂种类、溶液中的离子强度、温度和环境pH值等很多因素会影响到两者之间的相互作用。有研究发现某些配体与BLG的结合对极端pH敏感，在较高的pH下结合力较弱，这可能与静电相互作用有关：随着pH的增加，PLG会变得带负电荷，而不利于与带 负电荷的脂肪酸种类发生结合阳。0LG对棕桐酸的亲和力随着孵育培养基的pH从6.5 升到8.7而有所增加，并随着培养基离子强度的增加而降低阳,当孵育培养基的pH 降低时，PLG对棕桐酸的亲和力降低，且在pH值低于4.5时不能观察到0LG与棕桐 酸的复合物囚。就PLG本身而言，影响与其他物质相互作用的关键在于其结合位点 所处环境以及结构完整性。一定程度的热处理可以使蛋白质的三级结构发生构象变化,影响其功能性质和与其他分子的相互作用43有研究表明，亚油酸与热处理后的pLG 结合并不随着蛋白表面疏水性的增强而发生明显变化，这表明两者结合可能更依赖结 合位点，而不是简单的疏水性接触KJ。另外有限的酶解会破坏pLG结构上与脂肪酸 结合所必需的特异性位点46。在尿素存在的情况下，以及将蛋白质暴露于高温或在孵 育前被乙酰化后，棕桐酸的结合力会降低倒LG与脂肪酸结合后稳定性会有所增强，与原来相比，受到热处理、离液剂诱导、压力处理时更不易发生变性。比如，在棕桐 酸存在的情况下，添加尿素后PLG的筑基Cysl21的暴露速率比没有配体时要慢得多 47o结合棕稠酸的pLG以及不含配体的PLG的活化能明显高于结合有视黄醇的pLG 的活化能，这表明棕桐酸与天然蛋白质的相互作用可能比视黄醇更为强烈阳。0LG与 棕桐酸的结合亲和力也与蛋白质的二聚程度有关，这与浓度具有相关性3叫他们的结 果表明，单体pLG能够在表面位点（也是二聚体形成过程中单体之间相互作用的位点）上较弱地结合大量棕桐酸分子。二聚体的形成消除了棕桐酸在表面结合的大部分机会,但是产生了较小且亲和力较高的结合位点。每个二聚体能结合两个棕桐酸分子，并且 结合亲和力比单体的亲和力大一个数量级。1.4 蛋白与脂质的相互作用的分析荧光光谱法可以应用于研究蛋白质的构象变化，主要是因为Trp残基中口引珠发色 基团对微环境的变化比较敏感。每个PLG单体中有两个Trp残基和四个Tyr残基园。以两个Trp残基为例，Trp61位于表面，而Trpl9埋在蛋白质的疏水核心内。但是由 于Trp61距离Cysl60-Cys66形成的二硫键很近，使其荧光降低冷，Trpl9对总体荧光 强度的贡献更大，超过70%o由pH、温度和化学变性等引起的结构变化可以通过蛋 白质中某些氨基酸的内源荧光变化来监测49。内源荧光的变化取决于蛋白质随整个溶 液条件变化而呈现的不同构象。例如，有研究指出，在pH高于7.3时，pLG中心结 构处的EF弹性环发生了变化，不再是闭合状态5叫因此，配体可以接触结合位点。脂肪酸与pLG结合会引起蛋白质荧光强度发生变化，这种作用可能是因为游离脂肪酸 与分子中包含Trp残基的片段直接发生反应，或者由于结合脂肪酸导致Trp残基区域 发生构象变化卬网。也有研究表明pLG和棕桐酸的相互作用增强了 Trp的荧光强度，而且这种荧光强度的增强被用来定量脂肪酸与PLG的结合。通过蛋白质二级结构的变化也能表征蛋白与脂质的相互作用。有很多方法可以检 测蛋白二级结构，比如圆二色谱法，傅里叶红外光谱法，拉曼光谱法等。有研究使用 圆二色谱法检测不同pH下a-乳白蛋白与油酸相互作用前后二级结构变化，发现a-乳 白蛋白与油酸相互作用会提高a-螺旋的比例图。而使用拉曼光谱研究肉类蛋白与脂质 相互作用引起二级结构的变化发现a-螺旋的比例降低了，P-折叠比例升高了图。等温滴定量热法（ITC）可以用来检测pLG与脂肪酸结合过程的热力学变化。有 研究通过等温滴定量热实验发现PLG与脂肪酸的结合是自发放热的且随着链长增加 有增大的趋势，焙值也随碳链长度的增加而增大Ml。此外，气相色谱以及核磁共振等 方法也可用于研究pLG与脂质的相互作用田。1.5 淀粉与脂质、蛋白质形成V型复合物1.5.1 淀粉-脂质复合物天然淀粉中存在的少量V型晶体，一般认为是淀粉粒中直链淀粉与自身的少量脂 质的复合物。淀粉与脂质是用量很大的食品原料，因此在食品制作过程中，两者之间 发生相互作用形成复合物就会很常见，尤其是加工往往需要加热处理，利于复合物形 成5支能够和脂质形成复合物的是淀粉颗粒中含有的AM,而AP较难与脂质形成复 合物，因为AP中的较短的链很多，不易形成螺旋的构象，也就难以形成复合物，但 也有脂肪酸与AP形成了复合物的报道55-58。淀粉与脂质等分子形成复合物需要经过复杂的过程，并且涉及到疏水相互作用、氢键、范德华力等非共价作用力59-61。在碘、脂肪酸等配体分子存在的情况下，热处 理使淀粉的构象发生转变，各个葡萄糖残基间出现了氢键，水从直链淀粉的螺旋构象 中被排出，形成了一个疏水的左旋的空腔结构，由于其空腔是疏水的，可以结合脂质 等疏水分子，最后再形成复合物的外部结构佟2-64,其形成示意图如图1一2所示。图1-2直链淀粉与脂质的复合物以及直链淀粉螺旋的示意图ElFig.1-2 A schematic description of the amylose lipid complex and amylose helix淀粉-脂质复合物一般分成I型复合物和II型复合物,主要是因为熔化的温度不同 而进行的划分，在DSC图谱中可以明显区分两者的熔融温度65,6叫I型复合物吸热熔 融发生在95至I105,而II型复合物熔融所需温度要超过110。（265,67。在晶体结构 方面，I型复合物似乎不形成晶体结构，因为用X-射线衍射检测不到晶体的衍射峰;而II型复合物能在晶体学中可以检测到V型晶体结构。由于实验参数和所用材料的 不同，最终形成复合物的结构也有所差异，但I型复合物的熔融温度比II型低10到 30 OC不等67-69。形成结晶区域不明显的I型复合物的温度较低（60。0,成核速度 快；而结构有序性强的II型复合物形成所需温度较高（90）且时间更长7。，7 对多种脂质来说，与淀粉形成II型复合物有更好的热力学稳定性，但速率要慢一些。由于结构有序性不同，n型复合物又能分成na型复合物及nb型复合物，这两种复合 物熔融温度大约为115和121。7叫极性脂质比非极性脂质更难形成II型复合物。有研究表明I型复合物在自身熔点之上，n型复合物熔点之下的条件存在较长时间之 后，可能会转化为II型复合物。，73。在超过90 的条件下保持较长时间也可能使Ila 型复合物转化成11b型7。形成复合物的脂质分子的种类会影响到不同复合物转化的 时间长短68,6叫1.5.2 淀粉-脂质-蛋白质复合物淀粉，脂质和蛋白质之间的三元相互作用的提出是因为在研究淀粉的粘度时，发 现在添加蛋白和脂肪酸后粘度曲线的降温阶段出现了比较明显的粘度峰，而单独添加 乳清蛋白或脂肪酸在冷却阶段没有观察到粘度峰7支在RVA实验中往含有淀粉和某 些脂肪酸的体系中加入pLG会在冷却降温阶段观察到比对应的淀粉-脂肪酸体系有更 强的粘度峰（图1-3）,这也归因于加热-冷却过程中二元复合物的形成75,7纥3500300050020005000003 z Z 1 1Q?s e-S 0 0 S 51 MSMS+LA-MS&LA+pLG100(。乙Jn】E9 d E一 90807060Time(min)图1-3玉米淀粉，淀粉-月桂酸二元体系（同一循环）和淀粉-月桂酸邛LG三元体系（蛋白在第 二循环加入）的RVA粘度图176Fig.1-3 RVA profiles of MS,MS-LA system（in one cycle）,and MS-LA（in the first cycle）+0LG（in second cycle）张根义等RI通过高效尺寸排阻色谱（HPSEC）和碘结合等方法验证了高粱淀粉、乳清蛋白、脂肪酸三者混合加热后可以产生三元复合物，且提出淀粉与脂肪酸的复合 物以及蛋白质与脂肪酸的复合物有可能为形成三元复合物的重要组成结构，而含有二C硫键的蛋白质也是不可或缺的。有研究利用HPSEC对三元复合物的存在做了进一步 的证实78,79。在如图4所示的高效体积排阻色谱图中79,淀粉出现两个明显的峰,其中小峰为支链淀粉洗脱峰，大峰为直链淀粉洗脱峰；淀粉和蛋白质的体系中出现了 很小的支链淀粉洗脱峰以及一个由蛋白质和直链淀粉共同引起的大峰;淀粉-脂肪酸体 系中只出现了明显支链淀粉峰，直链淀粉峰基本消失，表明直链淀粉与脂质形成了不 能溶于水的复合物，上清液已检测不到；在三元体系中出现了三个峰，分别代表着支 链淀粉、二元复合物、蛋白质自身或者蛋白质与脂质形成的聚合体。dsuodssc-H P3ZUBEJ0NA.Stanch20 40 60 80Time(minutes)B.Starch+Protein3.0X102.0X1 L1.0 x1 a40.0“suodsaj E P3ZHBEJ0N20 40 60Time(minutes)D.Starch+Protein+FFA1.5x1 or,1.0X105.0X1。0.0s D 8 Z U B U U 0 N suods9H E D9zBUU0N图1-4179几种样品体系的HPSEC图：A：淀粉样品体系；B：淀粉+蛋白质体系；C：淀粉+脂肪 酸体系；D：淀粉+蛋白质+脂肪酸体系Fig.1-4 High performance size exclusion chromatography(HPSEC)results of different samples:A starch；B starch+protein；C starch+FFA；D starch+protein+FFA利用高效体积排阻色谱与MALLS联用测得三元复合物的相对分子质量大约 106-107 Da,而它的回转半径(Rg)的范围在20-70 nm左右Us”。后来也有对三元复 合物的结构的研究提出，由于脂肪酸的疏水烧链能进入直链淀粉螺旋空腔发生结合,又含有携带负电荷的竣基，与蛋白质的带正电的基团发生静电相互作用而结合，游离 脂肪酸被认为在三元复合物形成时起到淀粉与蛋白质连接的桥梁作用，从而产生了淀 粉-脂质-蛋白质三元复合物8。,结构示意图如图1-5所示。图1-5的淀粉-脂质-蛋白质三元复合物的结构示意图，包括直链淀粉不同元素有不同颜色：氧（红）,碳（白）和氢（蓝）,a-亚油酸（黄），B-乳球蛋白样肽（蓝）Fig.1-5 Model diagram of starch-lipid-protein ternary complex,including amylose different elements and their colors:oxygen（red）,carbon（white）,and hydrogen（blue）,a-linoleic acid（yellow）,P-lactoglobulin-like peptide（blue）淀粉-脂质-蛋白质三元复合物比淀粉-脂质二元复合物更容易在水中溶解。用XRD 检测淀粉、脂肪酸、0LG形成的三元复合物显示出了与淀粉-脂质复合物相似的V型 衍射峰，表明淀粉-FA-PLG复合物也为V型结晶结构。利用XRD、DSC及RAMAN 光谱等方法对复合物进行结构分析，发现淀粉-脂质-蛋白质三元复合物与相对应的淀 粉-脂质二元复合物相比有更好的长程与短程有序性。通过DSC研究二元和三元复合 物的热力学性质，观察到两者都在90至U 105。（2的温度范围内有吸热转变，表明两种 复合物有相似的热稳定性75,7组虽然淀粉、脂肪酸、PLG能形成三元复合物，但很多 脂质只能与淀粉形成二元复合物，比如淀粉，单甘油酯和PLG在RVA加热和冷却过 程中没有形成三元复合物】。三元复合物也具有碘结合能力，且与蛋白质浓度有关，浓度增加时，吸收碘的能力降低，表明直链淀粉螺旋空腔对脂质的利用程度受蛋白浓 度影响82。RVA冷却阶段出现的粘度峰的大小与蛋白质变性，直链淀粉从淀粉颗粒的 溢出情况，不同组分加入体系的的顺序等有关，表明三元复合物的形成会受这些因素 影响75,83。1.5.3 影响淀粉-脂质复合物和淀粉-脂质-蛋白质复合物形成的因素淀粉-脂质复合物和淀粉-脂质-蛋白质复合物的形成会受到很多因素的影响，包括 淀粉和脂质自身的特性特性以及温度、水分等外部因素等。淀粉作为形成二元和三元复合物的最基本材料，其来源、种类、结构、性质等会 对复合物的形成及结构产生重要影响。使用来自不同种类的小麦制成的淀粉与相同脂 质形成复合物的熔融温度，结晶度等有所不同8支淀粉中直链淀粉的比例越高，形成 的复合物一般会越多侬,而且直链淀粉的链越长，聚合度（DP）越大，会形成数量 更多的复合物，复合物的结晶度也更大，热稳定性及对酶消化和酸水解的抗性越强 86,8刀。聚合度会对直链淀粉的溶解能力和结合某些分子的能力造成影响87,一般链越 长的直链淀粉可以结合更多的脂质，所以能形成有序结构更好，热稳定性也比较高的 复合物88。淀粉链过长，DP值过高会使复合物的晶体结构产生缺陷，如果链太短则 不利于形成晶体结构，89。支链淀粉不易与脂质形成复合物，因为其结构上高度分支,不利于形成单螺旋空腔结构58。一般淀粉经过脱分支后，线性葡聚糖链会增多，进而 与脂质形成更多复合物9。-9汽尤其会形成更多的H型复合物。淀粉脱分支处理的时 间越长，一般形成的复合物的熔融温度及焰值变化会越大，但处理时间过长也会影响 复合物的形成921。脂质作为形成复合物的重要材料之一，其种类、烧链长度、不饱和度等因素会影 响到复合物的形成及其结构。脂肪酸、单甘酯、磷脂等很多脂质都能够与淀粉结合形 成复合物69,90,95。脂肪酸与淀粉形成的复合物比单甘酯形成的复合物稳定性更强，但 数量更少。甘油二酯和甘油三酯有较大的空间位阻，不利于形成复合物伊久另外，虽 然单甘酯能够形成二元复合物，但很难形成三元复合物，可能与缺少竣基有关。制 备时所用脂肪酸的燃链越长，形成的复合物的熔化所需温度就越高，这与煌链长的脂 肪酸与淀粉的螺旋疏水腔的相互作用更强，形成的复合物稳定性更好有关儆69,76。但 是碳链长度增加后，形成的复合物减少，因为需要更多的活化能来形成复合物，而且 空间位阻大，溶解度也差，越容易自聚集，不利于形成复合物76,95,96。当脂肪酸的烧 链含有碳原子不足10个时，由于链长过短，疏水性稍差，较难在淀粉的疏水空腔中 诱导复合物形成网，9刀，而且脂肪酸煌链含有多少碳原子能更好的形成复合物各个研究 都有不同的结论98,991。脂肪酸煌链长度对三元复合物形成的影响与其对二元复合物影 响的规律基本相同，但对三元复合物影响程度较小Bl。有很多研究表明，参与形成V 型复合物的脂肪酸的不饱和度越高，那么形成的复合物具有更差的热稳定性PT。而 且脂质的不饱和程度越大，能形成更大的复合物颗粒，使其粒径范围增大，这可能与 不饱和双键两侧的碳原子能够自由转动有关口明。另外，反式不饱和脂肪酸比顺式不 饱和脂肪酸更易形成复合物，因为反式脂肪酸呈现弯曲状的空间构象，受到较大空间 位阻而不易进入到螺旋空腔中。不饱和脂肪酸参与形成三元复合物时，其不饱和度增 加时，复合物的热稳定性降低69,7纥脂质的用量也是复合物形成的重要影响因素。当添加量越多时，形成的