临床色谱质谱检验技术：色谱质谱技术的其他常见应用（二）.pdf

临床色谱质谱检验技术第六章色谱质谱技术的其他常见应用2016.05.03临床色谱质谱检验技术金融检监King Med Diagnostics主要内容八临床色谱质谱检验技术金融检监King Med Diagnostics复习A 9复习O氨基酸分析方法的分类？O衍生化离子交换色谱法的原理？O衍生化高效液相色谱法里，常见的衍生化试剂有哪些？o金嫉检验KinMed Diagnostics复习0目前氨基酸分析方法:为衍生化间接分析法为衍生化离子交换色谱法为衍生化高效液相色谱法 为柱前衍生化气相色谱法O衍生化毛细管电泳法为氨基酸直接分析法4 E必神及早复习衍生化离子交换色谱法（柱后衍生）分析原理：基于阳离子交换树脂分离-柱后苗三酮衍生化分光光度检测方 法。天冬氨酸的pl值为2.98所有的氨基酸在低pH值的条件下（pH为2.2）都带有正电荷，在阳离子 交换树脂上均被吸附。其中吸附程度：碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性氨 基酸、酸性氨基酸结合力最弱。被洗脱下来的氨基酸与苗三酮反应液在加热的条件下反应。复习005三酮反应原理，脯氨酸与苗三酮反应：波长440nm检测，其它氨基酸与苗三酮反应：波长570nm检测oo00-复习方法邻(OPA)和9-辨 基氯甲酸甲酯(FMOC)法异硫氧酸苯酯(PITC)法、6-氨基嘎琳-N-羟基琥珀 酰亚氨基氨基甲酸酯(AQC)法衍生方式柱前柱前柱前衍生化条件30s室温lh55 水浴 lOmin色谱柱C18C18C18检测器激发波长340nm,发射波 长450 nm(伯胺)，激发 波长260nm,发射波长 305nm(仲胺)紫外检测器254nm激发波长235nm,发射波 长395nm评价线性范围广，可实现衍生化 自动化同时测定伯氨酸和仲氨酸；衍生物稳定；衍生化时间长,条件要求高同时测定伯氨酸和仲氨酸；灵敏度身，但线性范围窄八临床色谱质谱检验技术金融检睑King Med Diagnostics质谱技术在临床实验室中的应用（一）顾o什么是质谱分析？O质谱分类有哪些？O色谱质谱联用仪的组成?金照检睑KingMed Diagnostics顾O质谱分析：是分离和检测带电物质的质量差异的一类分析方法；为质谱仪：本质上是测量离子质荷比的分析仪器，是将被测物质离子化后，按照离 子的质荷比分离，测量各种离子峰的强度而实现分析的仪器；a o u e p u r l q v)A E u p n odime penny nickel quarter half$Value(m顾顾离子化质量分析检测金呱检睑King Med Diagnostics离子的形成(带电荷单离子)SolidLiquidVapor样品引入Method to vaporize sample根据质荷比(m/z)分离质谱图数据分析质谱技术在临床实验室中的应用其中质谱技术（除联用技术外）在临床实验中主要有以下 的应用：O电感耦合等离子体质谱技术（ICP-MS）应用于元素分析三重四级杆技术应用于遗传代谢性疾病检测0基质辅助激光解析-飞行时间质谱技术应用于微生物鉴定*9M-质谱技术在临床实验室中的应用信息及文献检索在自然界存在的92种天然元素中，与人类生命活动密切相关的有26种。根据元素在机体内的含量，可划分：常量元素：占生命体总质量万分之一以上的元素，C-碳、H-氢、0-氧、N-氮、Ca-钙、P-磷、Mg-镁、Na-钠等;O微量元素：占生物体总质量万分之一以下的元素，Fe-铁、Zn-锌、Cu-铜、Mn-锦、Cr-铭、Se-硒、Mo-钥、Co-钻、F-氟等。根据它们在人体内的含量和作用的差异分为：O常量必须元素：K-钾、Ca-钙、Na-钠、Mg-镁、P-磷、S-硫、CI-氯；微量必须元素：Cr-铭、Mn-镒、Fe-铁、Co-钻、Ni-银、Cu-铜、Zn-锌、Mo-钥、I-碘、Se-硒、F-氟、Si-硅等。信息及文献检索King Med Diagnostics元素人体含量（g）所占体重的N元素氧450 0 0.065.0 0碎碳1 260 0.01 8.0 0镖氢7000.0季均1 0.0 0漏氮21 0 0.03.0 0锯钙1 0 50.01.50钛磷70 0.0,1.0 0镇硫1 75.0 JV0.25硼钾1 40.0=!=0.20铭钠1 0 5.00.15钉氯1 0 5.00.15铝镁35.00.0 5诘铁4.00.0057相锌2.30 00.0033钻锄1.20 00.0 0 1 7钺铜0.1402 X 1 0-4金铜0.1001.4 X 10-4银铝0.1001.4 X 10-4锂铅0.0801.1 X1 0-5祕锡0.0 304.3 X 10-5帆碘0.0 304.3 X 1 0-5铀镉0.0 304.3 X 1 0-5错镒0.0 203.0 X 10-5镶颍0.0 1 62.3 X 1 0-5镭金域不业验人体含量（g）所占体重的N 0.100 1,4 X 10-4 0.0 90 1.3 X 10-4 0.0 50 7.0 X 10-5 0.0 50 7.0 X 10-5 0.0 1 5 2,1 X 10.5 0.0 1 0 1,4 X 10-5 0.0 1 0 1,4 X 10-5 0.0 0 6 8,6 X 10-5 0.0 0 6 8,6 X 10-6 0.0 0 6 8,6 X 10-6 0.0 0 6 8,6 X 10-6 0.0 0 5 7.0 X 10-6 0.0 0 3 4.3 X 10-6 0.0 0 2 3.0 X 10-6 0.0 0 1 1,4 X 10-6 0.0 0 11.4 X 10-6 9.0 X 10-41.3 X 10-6 3.0 X 10-44.3 X 10-7 1 0,0 x 1 0-41.4 X 10-7 2,0 X 10-53.0 X 10-7 1,0 X 10-51.4 X 1口 2.0 X 10-53.0 X 10-7 C。、Cu、Zn等信息及文献检索元素名 主要功能称元素名 主要功能称碳 有机化合物的主要组成成分氢 水及有机化合物的主要组成成分氧 水及有机化合物的主要组成成分氮 有机化合物的组成成分氟 人体骨骼成长所必需的元素氯 细胞外的阴离子（CI-）,维持体液平衡碘 甲状腺素的成分硫 蛋白质的成分硒 与肝功能肌肉代谢有关的元素磷 含在ATP等之中，是生物合成与能量代谢必需的元素硅 骨骼及软骨形成的初期阶段必需的元素钾 细胞内的阳离子（K+）,维持体液平衡钠 细胞外的阳离子（Na+）,维持体液平衡钙 骨骼、牙齿的主要组分，神经传递和肌肉收缩必需的元素镁 酶的激活，叶绿素构成，骨骼的成分锌 胰岛素的成分.许多酶的活性中心镒 酶的激活，光合作用中水分解必需的元素铁 组成血红蛋白、细胞色素、铁-硫蛋白等，输送氧钻 形成红血球所必需的维生素B12的组分铜 铜蛋白的组分，铁的吸收和利用铝 黄素氧化酶、醛氧化酶，固氮酶等必需的元素帆 促进牙齿的矿化信息及文献检索有毒有害重金属元素：OPb-铅：对人体的损害主要表现在神经系统，消化系统和血液系统，多为慢性，轻度中毒，症状比较轻微，以神经衰弱症候群为常见。OHg-汞：进入人体后，即集聚于肝、肾、大脑、心脏和骨髓等部位，造成神经 性中毒和深部组织病变。OCr-铭：对人的粘膜及皮肤有刺激和灼烧作用。这些化合物以蒸气或粉尘方式进 入人体，均会引起鼻中隔穿孔、肠胃疾患、白血球下降、类似哮喘的肺部病变O分析测定方法目前元素分析方法：O石墨炉原子吸收光谱法 Graphite furnace atomic absorption spectrometry(GF-AAS)O火焰原子吸收光谱法 Flamless atomic absorption spectrophotometry(F-AAS)阳极溶出伏安法 Anodic stripping voltammetry(ASV)为电感耦合等离子体发射光谱法Inductively coupled plasma optical emission spectrometer(ICP-OES)O电感耦合等离子体质谱法 Inductively coupled plasma mass spectrometry(ICP-MSKing Med Diagnostics 41电感耦合等离子体质谱技术电感耦合等离子体质谱(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry z ICP-MS),主要有电感耦合等离子体(ICP)和质谱(MS)两大部分组成。ICP是一种 高温离子源，引入的样品在通道中进行蒸发、解离、原子化、电离等过程，离子通过 样品锥接口和离子传输系统进入高真空的MS部分。在MS部分，通过快速扫描测定所 有通过的离子，扫描元素质量数范围从6到260,并通过高速双通道分离后的离子进 行检测，浓度线性动态范围达9个数量级。电感耦合等离子体质谱技术样品导入系统电感耦合等离子体质谱技术射频电压诱导氮离子和电子快速 震荡，产生热量(8,000 K)RF工作线圈(内通循环水)载气_carrier gas辅助气 Aux gas石英同心炬管u u u等离子气Plasma gas载气将样品气溶胶载到等离 子体的中心，进而样品发生 干燥、去溶剂、解离、原子 化和电离等过程仲心温度68001)电感耦合等离子体质谱技术ICP最热部分 8000KRF发生器频率27MHz,样品通道6800K以上样品停留时间为几个毫秒在采样锥口处样品 以正离子形态存在采挂锥口处正离子浓度 最高，而多原子离子干扰浓度最演气溶胶干燥 粒子蒸发与解离解离成单原子且电离电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析ICP-MS的技术特点O分析元素覆盖面广（可达73元素），分析速度快O检出限低（多数元素检出限为ppb-ppt级）O线性范围宽（可达9个数量级）为谱图干扰少（原子量相差1可以分离）O能进行同位素分析为多种进样技术联用电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析2 HeAtomic Number,Symbol Isotopic Abundance Most Abundant Isotope1 HDetection Limit Ranges 0.1-1 ppt1-1 0 ppt1 0-1 0 0 ppt0.1-1 ppb1-1 0 ppb 3 Li 4 Be11 Na 12 MgBr6 o s-8345 8 po 84a 一 5 G9,m5,个=20-6 111 9-113 4 E 8oM 加98bNAc9 8b R 37cs一 3 55H13Fr87电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析Thermo X2 ICP-MSAgilent 7500a ICP-MSPE Niox300d ICP-MSAgilent 7700 ICP-MS样品制备样品制备：O直接稀释法：主要用于血液、尿液等生物体液的制备，优点是制样方法简单、目 不使用消解试剂，避免了因试剂不纯对测定的干扰。O湿法消解法：主要用于毛发和指甲样品的制备，使用的浓硝酸具有强氧化性，可 迅速破坏大部分有机物。0微波消解法：在高温高压下可迅速消解样品，它克服了传统消解方法的效果底、空白高、安全性差等缺点。借助这种方法可以快速消解血液、头发、和指甲、脑组 织和脏器官、骨骼等多种生物样品。电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析以ICP-MS检测全血Pb为例:O铅通过肠道和呼吸道吸收入人体后，随血流分布到全身各器官和组织，90%贮存 于骨骼中O吸收到体内的铅主要由肾排出，小部分由粪、汗、唾液、乳汁排泄，极少量通过 头发及指甲脱落排出体外人体内的铅大部分都以不易溶解盐的形式沉积在骨骼中，而且很难出来再回到血 液，骨骼中的铅的半衰期约为20 3。年，这部分铅对人体来说相对安全O血液中的铅主要与红血球内的血红蛋白紧密结合进行运输的，血液中铅的半衰期 约为35周，平均大约为1个月，血铅水平代表近一段时间内人体铅吸收的情况电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析参考值:全血铅：儿童（0-15岁）:O-lOOpg/L成人：0-400|jg/L尿铅：普通人群0-23.0用儿，职业人群0-70.0|jg/Lo尿铅测定是指测定对铅的中毒。尿中铅的含量可以反映人体接触铅的水平，对铅中 毒的诊断具有重要意义。电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析Q样品采集：人体内微量元素的含量较低，在样品的采集过程中易受到各种污染,因此微量元素血液样本在采集过程中需格外小心0使用合格的微量元素专用采血管。O卫生部血铅临床检验技术规范中对降低分析空白的各项规定0样品状态检查O是否抗凝C抗凝类型是否正确为样品中是否有凝块电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析O血液样品的特点：黏度大O基体复杂0含较多细小颗粒物蛋白质容易沉降0检测过程易出现的问题：O容易漂移O样品不均匀为易堵（雾化器）O稳定性较差电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析解决办法：O选择合适的酸度和曲拉通浓度稀释样品：O酸度（破坏红细胞）：过小，红细胞破坏不完全；有些元素的等离子体行为 受影响；过大，造成蛋白质沉降；曲拉通（防止样品沉降）：浓度过小，不能有效地防止沉降；过大，溶液黏 度大，容易起泡，造成精密度差。做最优秀的第三方检测机构To be the Best Independent Laboratories电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析干扰消除同量异位素干扰多原子离子同质 量干扰O选择无干扰同位素204Hg又寸于204Pb的干扰，使用208Pb 代替204PbO优化仪器参数可减少氧化物、双电荷离子OShieldTorch 技术减少具有高电离能的多原子离子O使用碰撞反应池消除干扰八临床色谱质谱检验技术金融检监King Med Diagnostics小结与思考为熟悉电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析O了解电感耦合等离子体质谱技术特点0了解ICP-MS检测全血Pb中，加入硝酸和曲拉通的 作用*