学位论文：重组人促卵泡激素检定用标准物质的研究.pdf

以中国药检s中国药品生物制品检定所 硕士研究生学位论文重组人促卵泡激素检定用标准物质的研究 ：目录中文摘要.I英文摘要.III、/=.刖三.1第一部分重组人促卵泡激素(rh FSH)结构确证部分研究.第一章实验材料.第二章重组人促卵泡激素(rh FSH)结构确证部分的方法学研究与优化.第三章实验步骤及实验结果.第四章讨论与小结.第二部分重组人促卵泡激素(rh FSH)质量检定部分研究.第一章实验材料.第二章实验步骤及实验结果.第三章讨论与小结.第三部分总结.参考文献.26综述.31综述参考文献.32致谢.41重组人促卵泡激素检定用标准物质的研究中文摘要人促卵泡激素(h uman f ol l icl e stimul ating h ormone,h FSH)是垂体前叶嗜 碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素。作为药物，广泛用于治疗垂体 功能低下的不孕不育，和人类辅助生殖技术。近几年随着基因工程技术的发展，重组型人促卵泡激素以高纯度、无毒副作用的优点渐渐替代天然提取型，已大量 用于临床治疗。鉴于此种情况，对此类药物制定严格的质量控制标准是非常必要 的。但是，国外现仅有重组人促卵泡激素国际生物标准品未有重组人促卵泡激素 国际理化对照品；我国也还没有重组人促卵泡激素的国家对照品和标准品。本实 验的目的是通过对重组人促卵泡激素(rh FSH)的结构确证，质量研究及实验方 法学的优化进行了较为全面系统的研究。为建立我国国家重组人促卵泡激素(rh FSH)标准物质及理化对照品奠定了基础，并完善了重组人促卵泡激素(rh FSH)质控技术标准。本实验首先进行了重组人促卵泡激素(rh FSH)结构确证部分的研究分析。三 种不同方法测定分子量，SDS-PAGE测定表观分子量为43KD,SEC-HPLC法测量 分子量大约在43KD和！3.7KD之间,MALDI-T0F测的结果两个亚基分别为14.2KD 和17.4KD,rh FSH分子量为31.6KD,与文献报道(31KD)一致。同时从紫外光谱 分析，测得rh FSH最大吸收波长在276.6nm处。等电聚焦分析rh FSH样品范围在 3.55.5之间。免疫鉴别印迹结果rh FSH对照品和rh FSH样品均为阳性，而rh CG 样品免疫印迹鉴别结果为阴性。再结合肽图分析等几个方面进行对上述实验的分 析，对重组人促卵泡激素(rh FSH)结构得到了基本确证。接着进行了重组人促卵泡激素(rh FSH)原液质量部分的研究。使用Lowry法 测定蛋白浓度为0.8 76mg/ml。用非还原SDSPAGE检测解离亚基小于5%。利 用SDS-PAGE(银染)检测聚合体的含量小于2%。使用Wis ter大鼠测量rh FSH 生物活性：测得效价PT=8 08 7.5IU/mL,效价的可信限率为FL=21.014%,效价的 可信限范围为6548.19947.HU/mL。结合数据，基本对rh FSH原液质量部分进 行确认。在实验当中，对重组人促卵泡激素(rh FSH)的检测实验进行了部分方法学的 研究与优化。rh FSH切糖试验中，经过反复试验和对比，增加了一步中高温加热 反应，优化了还原条件，使切糖试验结果更稳定，效果更明显。并比较自研方法 和传统试剂盒的切糖结果，证明前者切除rh FSH的糖链适宜，而后者对于切除 rh FSH的糖链不太适宜。，优化了切糖试验反应还原条件，并比较自研方法和传 统试剂盒的切糖结果；在rh FSH肽图试验中，优化了裂解肽段反应的条件，同时 比较分析了去除糖链前后的肽图图谱，证明两者的峰数和峰高度都不同，而且两 者的裂解位点也有所区别。通过以上的全面系统的实验研究，对重组人促卵泡激素(rh FSH)标准物质 及理化对照品的研制提供了数据及理论依据。关键词重组人促卵泡激素切糖Abstract暂缺中国药品生物制品检定所硕士学位论文前三人促卵泡激素(h uman f ol l icl e stimul ating h ormone,h FSH)是垂体前叶嗜碱性细胞 合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素。川它由两个非共价结合可解离的a-亚基和 B-亚基所组成。a-亚基和所有糖蛋白激素的a-亚基相同，由92个氨基酸组成，含 10个半胱氨酸和5个二硫键；B-亚基由111个氨基酸组成含12个半胱氨酸和6 个二硫键。有四条糖链分别以N-糖昔键的方式连结在a和B两个亚基各自的区 域，连接处通常是在天冬酰胺。每个亚基上有2个糖基化位点，a-亚基的分别位于 第52位和第78位氨基酸残基上，B-亚基的分别位于第7位和第24位氨基酸残基 上，这2个位点还会有一些糖链分枝。糖在糖蛋白激素分子中占15%30%,主要 包括:己糖(3.90%)、氨基己糖(2.40%)、岩藻糖(0.40%)、唾液酸(1.40%。.3,%习唾液 酸常在糖链末端，它对于FSH的生物学活性有直接影响；唾液酸的含量及等电点(pl)和FSH生物学活性有如下关系：随着唾液酸含量降低，pl值升高，激素与受体的结 合能力增强，体外生物学活性升高。还有一个与FSH生物学活性有密切关系的因素是 糖链的组成，研究表明用酶解或化学方法解离除去糖链，其生物学活性降低，甚至消 失。且a链上糖链的解离对激素的影响比B链更大。FSH在脱去糖链后，FSH与 受体的结合能力反而会增强，但几乎完全失去体内生物学活性，成为FSH的天然拮 抗剂俗,7,8,9,10,1L 12人促卵泡激素在人体中有重要作用：对女性，FSH对于卵泡达到成熟的时间 和卵泡数目至关重要；对男性来说，它能保持正常精子的数目和质量。网作为 药物，广泛用于治疗垂体功能低下的不孕不育，和人类辅助生殖技术。早在60 年代就，临床上应用于女性主要是刺激卵泡发育，促排卵，并用于助孕技术中刺 激多个卵泡发育口3在男性用于刺激精子发生。而今，卵泡刺激素(FSH)在体 外受精(IVF)或卵胞浆内单精子注射(ICSI)术中已成为控制性超排卵(COH)的标 准药物。研究表明，外源性促性腺激素(FSH等)合并应用促性腺激素释放激素 激动剂(GnRHa)有助于:促进卵泡的生长发育;提高卵子的质量;预防黄体 生成素(L H)的早期释放;(4)降低治疗周期取消率;(5)改善新鲜和冻融胚胎移植的 子宫内膜着床环境。目前，临床上大量使用的此种激素有两大类，一类是天然提取型激素药物(尿促 卵泡素)，另一类是利用基因工程技术生产的重组型激素药物(重组人促卵泡激-1-中国药品生物制品检定所硕士学位论文素）。而天然提取型激素药物又分为动物组织提取型和人尿源提取型，前者是从 屠宰的牲畜脑下垂体提纯的，缺点是纯度不高，含量甚少，有L H的存在，副作用较 大：后者虽不含有L H,纯度也可达95%,但含有残留尿液中的蛋白性质成分，且生 产成本极其昂贵。如要从垂体中提纯出具有超高纯的F SH,售价每克成本在1 亿元人民币左右。口7,18,19,20.21.22,2力随着分子生物学及基因重组技术的发展，利 用重组DNA技术生产重组人促卵泡素（rh FSH）已成为可能。它是将带有重组 后人促卵泡素基因的质粒共转染dh*缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,表达 重组人促卵泡激素。近些年来，不少学者在这方面进行了大量而有效的实验，到目 前为止已取得了突破性的进展。在1989年，Jef f bry等人四等利用异源细胞表达 F S H获得成功，1994年由Mounf brd、Gebert25,26等利用CHO细胞重组表达 绵羊和人的FSH,1997年Samaddarm等利用巴斯德毕赤酵母作为表达FSH的 表达系统。1998年Kato网等把猪fsh插入到杆状病毒基因组，并以重组病毒 感染昆虫细胞,FSH经昆虫细胞分泌表达，并经衣酶素糖基化处理。到了 1999年 29Linskens则利用土壤中的阿米巴盘基网柄菌属盘虫作为表达载体表达FSH二 聚体，其重组F S H同样具有与受体结合的能力，同时也能诱发生物活性反应。基因工程技术的发展，生产成本大幅降低，使重组型人促卵泡激素作为药物 已规模化生产；同时在临床治疗上它又以纯度高、生物学活性强且没有毒副作用 等优点渐渐替代天然提取型得到广泛的应用。鉴于此种情况，对此类药物制定严 格的质量控制标准是非常必要和必须的。但是，国外现仅有重组人促卵泡激素国 际生物标准品未有重组人促卵泡激素国际理化对照品；我国也还没有重组人促卵 泡激素的国家对照品和标准品。目前，我国对于此类糖蛋白激素需要经过详细的 结构确认，纯度检查，以及多种方法确定含量，研究建立原始基准品。药品检定 用标准物质如何满足计量科学的要求，如何提升计量科学在药品质控领域的应 用，解决药品分析技术与检测方法中的计量问题一测量标准、测量的可追溯性、测量的不确定性、测量方法的可比较性，已引起国内外业界的关注。即而目前一,国际上对此类糖蛋白结构分析热点主要集中在糖基化位点确定、糖链组成分析等 方面。所以对rh FSH的定性确证除了一般蛋白质定性研究中的分子量测定、免 疫印迹、圆二色光谱图测定、等电点测定、N端测序及肽图研究外，还需对寡糖 的糖组成和糖型进行研究。建立和规范上述各激素的结构分析方法，对研究糖蛋-2-中国药品生物制品检定所硕士学位论文白激素的分离与纯化，提高产品质量将会有巨大的推动作用。卬本研究的目的：通过对重组人促卵泡激素（rh FSH）的实验研究基本完成 rh FSH结构确证及部分的质量研究。在实际操作rh FSH的检测实验中进行部分方 法学的研究与优化。不仅优化了切糖试验反应还原条件，使切糖试验结果更稳定,效果更明显，并比较自研方法和传统试剂盒的切糖结果；而且优化了肽图试验裂 解肽段反应的条件，同时比较分析去除糖链前后的肽图图谱，证明两者的峰数和 峰高度都不同，而且两者的裂解位点也有所区别。通过以上的全面系统的实验研 究，对重组人促卵泡激素（rh FSH）标准物质及理化对照品的研制提供了数据及 理论依据。为建立我国国家重组人促卵泡激素（rh FSH）标准物质及理化对照品 奠定了基础，完善了重组人促卵泡激素（rh FSH）质控技术标准。-3-中国药品生物制品检定所硕士学位论文第一部分 重组人促卵泡激素(rh FSH)结构确证部分研究第一章实验材料1.实验试剂及耗材丙烯酰胺：北京欣经科生物技术有限公司N甲叉双丙烯酰胺：Merck-Sch ardt公司甘氨酸(Gl y)：北京欣经科生物技术有限公司十二烷基硫酸钠(SDS)：Sigma公司过硫酸氨(AP)：北京欣经科生物技术有限公司TEMED：Lif e Science 公司澳酚蓝：北京五七六。一有机化工厂B一筑基乙醇：Fl uka公司考马氏亮蓝G-250:Amresco公司NaH2P04-2H20:北京化学试剂公司Na2HP04-12H20:北京化学试剂公司NaCl:北京化学试剂公司两性电解质pH310：Ph armacia公司等电点 Marker：Ph armacia 公司低分子量蛋白质分子量标准：Amer sh am Ph armacia公司小鼠IgG：北京欣经科生物技术有限公司35KD的透析袋:Ph armacia公司10KD的超滤管：mil l pore公司TFA:Fl uka 公司乙月青：Fis h er Scientif ic 公司KH2P04:北京化学试剂公司0.45um 膜：Sartorius 7甲醇:北京化学试剂公司HC1:北京化学试剂公司枸檬酸：北京化学试剂公司NaOH：北京化学试剂公司-4-中国药品生物制品检定所硕士学位论文甘油：上海试剂公司三氯乙酸：Merck公司DTT：Inal co SPA 公司碘乙酸：Al f aAesar胰酶：Sigma公司碳酸钠:北京化学试剂公司外标物 Al dol ase 和 Al bumin：Sigma基质为 a-Cyano-4-h ydroxycinnamic acid(CHCA)：Sigma丁醇：Fis h er Scientif icNaHS04:北京化学试剂公司DIG检测试剂盒：Roch e公司鼠IgG:北京欣经科生物技术有限公司牛血清白蛋白：Sigma公司2.主要实验仪器电泳仪:Ph armacia,北京六一厂电泳槽及制胶模具:Ph armacia,北京六一厂电子天平：Mettl er Tol edo xs205PV 型恒温水浴锅：Precisdig公司恒温水浴摇床：Unitronic-orbitaleppendorf centrif uge 5415D 台式离心机TB1加热块：Labnet公司紫外分光光度记：北京新技术研究所8 8 23A-U平板电泳仪Ph armacia公司电泳冷却板：Ph armacia公司pH 计：Mettl er Tol edo MP230高效液相仪：Watersl 525,检测器：UV-2996；Sh imadzu高效液相色谱仪(日本岛津)，包括CBM-20A系统控制器，SPD-20A可 调波长紫外检测器，LC-20AD输液泵，DGU-20A脱气机，725i型手动进样阀，CTO-l OASvp 柱温箱-5-中国药品生物制品检定所硕士学位论文MALDI-TOF-MS：Voyager Biospectrometer 飞行时间质谱工作站 冷冻干燥离心机：Th ermo RVT4104TSK-GEL G2000 SWXL 凝胶柱：TOSOH 公司C18 柱：Vydac 2.8 TPC18-6-中国药品生物制品检定所硕士学位论文第二章重组人促卵泡激素（rhFSH）结构确证部分的方法学研究与优化一.重组人促卵泡激素（rh FSH）切糖试验（一）自研优化方法：预计适用于肽图、的初步实验。1.试剂配制1.2 还原竣基化试剂（尿素法）1.2.1 EDTA储备液EDTA-Na水室温6个月1.2.2 RCM缓冲溶液：尿素水37%盐酸使尿素溶解，混合约15分钟。TrisEDTA储备液糖型分析（唾液酸）、糖基化位点测定5g加水溶解并定容至100ml48 0.5g（8 摩尔）约 500ml20滴43.6g（0.36 摩尔）24ml37%盐酸调pH至8.60.05,加水定容至1000mL 临用前配制。1.2.3 DTT 溶液：DTT 1.54g加水溶解，定容至10ml。密闭，2-8 C 1月内有效。1.2.4 1M 碘乙酸溶液:1.0mol/L碘乙酸 18 6mg1M氢氧化钠 1ml1.3 PNG酶F缓冲液1.3.1 PNG酶F的缓冲液储备液-7-中国药品生物制品检定所硕士学位论文NaCl18 0g无水醋酸钠8 2g加水1700ml溶解冰醋酸调pH值至7.60 0.1定容至2000ml0.2|nm过滤室温保存6个月o1.3.2 PNG酉每F缓冲液PNG酶F的缓冲液储备液100ml900ml水水2供试品溶液制备2.1 原液初制取原液，脱盐后调整浓度约0.75mg/ml,取400ul（300ug）,真空抽干，成为干燥样品。如果当天不用则存于-15。2.2 样品的还原和竣化2.2.2尿素法2.2.2.1 还原将待测干燥样品和干燥对照品用RCM缓冲液稀释为约Img/ml o80度加热5分钟后，溶液以l Ojul/ml加入1MDTT溶液，37c孵育1小时。2.2.2.2 竣化加入碘乙酸溶液至25|Lil/ml,室温避光反应30分钟。加入50nl/ml 1M的DTT溶液终止反应。3.切糖3.1 以PN-GaseF缓冲液透析4小时，换液2次。3.2 以每毫克蛋白2U的比例（每毫克蛋白加入20|liL NEB的PNGase-F）加入 PN-GaseF,37。过夜（12 小时）。4.根据试验目的选择后续步骤。（二）糖甘酶试剂盒方法（NEB试剂盒）：作为自研方法的方法学对比和验证。1.试剂：试剂盒提供-8-中国药品生物制品检定所硕士学位论文1.1 10 x变性缓冲液:5%SDS,10%p筑基乙醇。1.2 10 xG7 缓冲液:0.5M 磷酸钠（pH7.525）1.3 NP-402.反应步骤2.1 样品处理：取原液供试品及对照品适量，根据要求离心浓缩至适宜体积或冷冻离心干燥。2.2变性糖蛋白样品Img适宜体积或冻干品1 Ox变性缓冲液l OOpL水补至1ml100变性10分钟2.3酶切变性反应物1mll xG7缓冲液100|nLNP-40100|nLPNGaseF20匹37c反应8小时3.根据试验目的选择后续步骤。（三）结果与讨论1.糖链切除的结果rh FSH是由a和B两个亚基非共价结合所组成。a和B两个亚基分别连有 糖链（连接点即糖基位点），每个亚基上有2个糖基位点（a-亚基的在52和 78位氨基酸残基上，B-亚基的在7和24位氨基酸残基上），这2个位点还残 存一些糖链分枝阳34.3叫 糖链连接方式通常是以N-糖首键的方式连结天冬酰 胺上,FSH的生物学活性依赖于糖链的组成，去除糖链后（用化学或酶解的方法）,降低了 FSH的生物学活性，甚至失去活性.M35,3旬在肽图分析，氨基酸组成分析，N端和C端氨基酸序列分析以及其他对糖 组成研究等后续试验中，需要将糖链与蛋白部分分离开。在这些试验中，都围绕-9-中国药品生物制品检定所硕士学位论文着糖链与蛋白质的分别研究情况。因此糖链的切除，对整个关于rh FSH的结构 和功能研究是最基础的，也是非常关键的一步。在此次试验中对切除糖链的方法进行了深一步的研究和对比。所选用的是自 研方法尿素二硫苏糖醇（DTT）还原，碘乙酸竣化，肽N-糖普酶F（PNGaseF）切除糖链。方法是靠尿素，硫苏糖醇及碘乙酸在一定的反应条件下使rh FSH肽 链变性，在物理形态方面从卷曲折叠结构变为平面直线结构；再使用肽N-糖昔 酶F切除糖链。在试验设计中对比了用N-糖昔酶试剂盒切除糖链的实验，实验结果表明：一,自研方法能完成糖链的切除，即可行性。二，在rh FSH糖链的切除的完成 效果方面优于完全用试剂盒切糖的效果。在电泳结果中能看到自研方法明显的切 除糖链效果，同时也发现用N-糖昔酶试剂盒在SDS-PAGE电泳中无法显示出切 糖后的条带（此验证实验曾重复数次结果都如此）。（如图1,2,3）再利用基质 辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）做切糖前后的分子量分析,N-糖普酶试剂盒的结果比理论值小的多，而自研方法的结果却与理论值相近。（如 图4,5,6）在本实验值得注意的地方还有一步，是还原步骤中有80度加热5分钟。这 一步同样是非常重要的，因为此步骤的中高温加热，既可以使还原的反应更完全,又避免了超高温对rh FSH的过度变性。恰到好处的温度可以使反应达到预期效 果。下图是SDS-PAGE电泳的结果-10-中国药品生物制品检定所硕士学位论文1 2 3 4 5 6 7 8图1.SDS-PAGE电泳结果一1.Marker（由上致下顺序：97.4KD、66.2KD、43KD、31KD、20.1KD、14.4KD）2.自研方法切糖效果（还原型）3.N-糖普酶试剂盒切糖效果（还原型）4.rh FSH原液（还原型）5.rh FSH原液经过还原竣化处理而不切除糖链（还原型）6.rh FSH原液不经过还原竣化处理而直接切除糖链（还原型）7.rh FSH原液（非还原型）8.自研方法切糖效果（非还原型）-11-中国药品生物制品检定所硕士学位论文1 2 3 4,5 6 7图2.SDS-PAGE电泳结果二1.Marker（由上致下顺序：97.4KD、66.2KD、43KD、31KD、20.1KD、14.4KD）2.N-糖普酶试剂盒切糖效果（还原型）3.自研方法切糖效果（还原型）4.rh FSH原液（还原型）5.N-糖甘酶试剂盒切糖效果（非还原型）6.自研方法切糖效果（非还原型）7.rh FSH原液（非还原型）-12-中国药品生物制品检定所硕士学位论文2 3 4 5 6 7 8图3.SDS-PAGE电泳结果三1 rh FSH原液（非还原型）2.自研方法切糖效果（非还原型）3.自研方法切糖效果（非还原型）4.N-糖昔酶试剂盒切糖效果（还原型）5.rh FSH原液（还原型）6.自研方法切糖效果（还原型）7.自研方法切糖效果（还原型）8.Marker（由上致下顺序：97.4KD、66.2KD、43KD、31KD、20.1KD、14.4KD）%lnt.37 mVsum=4599 mV Profiles 77-200 Smooth Av 2014216.4Data:fsh_native_20001.L21 15 Jan 2009 15:04 Cal:20090110 10 Jan 2009 12:40Kratos PC Axima CFRplus V2.4.0:Mode linear_2GHz,Power:83.Blanked,P.Ext.17000(bin 235)图4.切糖前质谱结果切糖前MALDI-T0F测的结果两个亚基分别为17.4KD和14.2KD,rh FSH分子量约为31.6KD,和文献报道（约17KD、14KD）一致。主峰峰型圆顿，且有很-13-中国药品生物制品检定所硕士学位论文多毛刺。每一个毛刺峰代表一个糖型。Data:e:studypapersmalditof_081227090115fsh_qie_10001 E21 15 Jan 2009 11:36 Cal:20090110 10 Jan 2009 12:40 Kratos PC Axima CFRplus V2.4 0:Mode linear_2GHz.Power:90.Blanked.P.Ext.30000(bin 313)%lnt.10090；80 7060-50：40；30：2010oj223 mV|sum=10707 mV 斗节gg.Smooth Av 208032.58000600012957.613-53.910702.2101.436.710000 1200014000Mass/Charge16000 18000 20000139图5.自研方法切糖质谱结果用自研方法切糖后的MALDI-TOF测的结果：三个主峰锋型尖锐整齐而单一，只将肽链相加理论计算值与实际测量值相似。说明此法切除糖链效果明显，而 且没有干扰到肽链的组成完整性，为后续其他研究提供可靠基础。Data:e:studypapersmalditof_081227090115fsh_shL10001.F21 15 Jan 2009 11:41 Cal:20090110 10 Jan 2009 12:40 Kratos PC Axima CFRplus V2.4.0:Mode linear_2GHz.Power:83.Blanked.P.Ext.10000(bin 178)%lnt.100；90；80：7060-50；40：30：20：10-0-s q即由电107 mVsum=6332 mV Profiles 1-59图6.试剂盒方法切糖质谱结果-14-中国药品生物制品检定所硕士学位论文用试剂盒方法切糖后的MALDI-TOF测的结果：多主峰，锋型尖锐而不单一，理论计算值与实际测量值相差很远，要理论值小的多。说明此法不太适宜切除 rh FSH糖链，而且干扰到肽链的组成完整性，不能为后续其他研究提供可靠基 础。二.重组人促卵泡激素（rh FSH）肽图试验（一）试剂配制及实验步骤1.1 试验溶液配制切糖部分同前，此处省略1.2 肽图部分的溶液配置：1.2.1 0.1M的碳酸氢镂缓冲液称取碳酸氢镂15.8 12g,用超纯水溶解，定容至2000ml1.2.2蛋白酶溶液取酶适量，用0.l mol/1碳酸氢镂溶解制备为Img/mL-20保存1个月。2.实验步骤2.1 切糖实验步骤见前，此处省略。2.2 SDS-PAGE 检测以LWM为蛋白分子量标准，以未切糖样品为对照，分别在还原和非还原条 件下电泳检测，方法详见电泳SOP。（过程检测，验证糖链是否切除成功）2.3胰蛋白酶切2.3.1 样品准备供试品：取约450席的切糖样品。2.3.2 酶切:用0.1M的碳酸氢钱缓冲液透析，35KD截留值，4小时以上（推荐7小时）。空白对照1：0.1M的碳酸氢镂缓冲液，不加样品不加酶。空白对照2：0.1M的碳酸氢镂缓冲液，加入和反应管同样浓度的胰蛋白酶不 加样品。空白对照3：取361中的对照品和供试品各50席。供试品：取约400度的切糖样品，按照1：50质量比加入胰蛋白酶溶液。对照品：同法制备。反应：37c反应6小时。-15-中国药品生物制品检定所硕士学位论文胰蛋白酶灭活：95C,10分钟。备用。2.4 RP-HPLC色谱分析2.5 供试样品上述2.3.2中的各个酶切样品及空白。2.6色谱分析色谱柱：C18,300A 511n1、250 x4mm。色谱条件：波长：214nm；流速：1.Oml/min；柱温：30；进样体积：200|nl o洗脱条件：T(min)流动相A（%）流动相B觥）01000310001580204565356040606101007001007110002.7系统适用性要求空白对照1色谱图中应没有干扰完整rh FSH和各肽段的色谱峰。空白对照3色谱图中应出现明显的rh FSH完整蛋白色谱峰。供试品和对照品色谱图中，保留时间相应于空白对照3中主峰位置的rh FSH 峰应基本消失。（二）结果与分析L相关肽图比较与分析rh FSH与别的激素药物不同，有特殊的结构，其化学本质是糖蛋白，包 括多肽链和糖链两个部分。rh FSH肽链是由两个非共价结合的3-亚基和a-亚基所组成。8-亚基由111个氨基酸组成，a-亚基由92个氨基酸组成，每个亚基都有相应数目的半胱氨酸和二硫键等。糖链是以N-糖昔键的方式 连结在a和B两个亚基各自的区域（a-亚基的分别位于第52位和第78位氨基 酸残基上，亚基的分别位于第7位和第24位氨基酸残基上），这2个位点还 会有一些糖链分枝.研究表明，糖链对于该激素发挥其生物活性起着不可或缺的 作用。虽然糖链的存在对于rh FSH的功能十分重要，但是在研究rh FSH的氨基酸-16-中国药品生物制品检定所硕士学位论文部分时，由于是单独研究肽链，要尽可能的排除其他干扰。理论上由于糖链的 特殊枝杈结构，会对肽段的裂解有干扰作用，肽图表现也会有不同。那么糖链 的切除与否，到底对肽图是否影响，在此实验中给予了对比分析。理论假设是 在肽图氨基酸分析上糖链会对肽链有影响，那么在肽图试验中设计了去除糖链 的肽图分析和不去除糖链的肽图分析。最后得到肽图图谱，表现是两者的峰数 和峰高度都不同，而且两者的裂解位点也有所区别。（如图7,8,9,10）最终 结论是实验结果与理论假设相同，即糖链的切除对肽图氨基酸分析有影响，两 者肽图裂解位点不同。但是具体是哪几个不同的裂解位点，本实验中没有深入 涉及到。如下图图7.去除糖链的肽图图谱-17-中国药品生物制品检定所硕士学位论文图9.两者区别肽图图谱上折线为不去除糖链的肽图图谱下折线为去除糖链的肽图图谱图10.两者区别肽图图谱 上折线为不去除糖链的肽图图谱 下折线为去除糖链的肽图图谱2.胰酶裂解条件的分析在去除糖链后，曾经直接加入胰酶裂解肽链部分，但是肽图图谱结果不理想,没有得到理论裂解肽段的肽图色谱峰。经过分析，发现在去除糖链后，样品的缓 冲体系仍然为PN-GaseF酶工作的PN-GaseF缓冲体系，对下一步的胰酶裂解工 作会发生干扰作用。因此在加入胰酶之前，对待裂解肽链的样品进行0.1M的碳 酸氢镀溶液透析4小时以上（35KD截留值），置换成胰酶工作的缓冲体系，再 加入胰酶，最后得到了理想的胰酶裂解效果。下图就是透析前后的肽图效果比较-18-中国药品生物制品检定所硕士学位论文（图 11,12）lA/25.0 5Q0 rrin图11.透析前去糖链的rh FSH肽图图12.透析后去糖链的rh FSH肽图第三章实验步骤及实验结果一.实验步骤（一）对重组人促卵泡激素rh FSH待测样品和rh FSH对照品的预处理1.对待测rh FSH样品的预处理将待测样品分为4ml和6ml两部分，将4ml rh FSH加入超滤管中，放入离心 机，每分钟4000转，离心30分钟，进行超滤浓缩及简单的除盐。然后将浓缩后 的rh FSH转移至eppendorf管中，放入离心干燥机中进行处理。操作时间2小时 10分钟，加热时间2小时，加热温度60度。最后得到干燥待测rh FSH样品约2.5-19-中国药品生物制品检定所硕士学位论文毫克共2支。将6ml rh FSH分装成1.5ml共4支，冻入-20度冰箱。以便后续试验操作，以减少反复冻融所带来的药物降解。2.对rh FSH对照品的预处理将40支国外某厂家的rh FSH对照品，富集，分别移入离心管中(截留值 10KD)放进离心机每分钟4000转，离心60分钟，进行超滤浓缩及简单的除 盐。接着放入截留值透析袋中用纯水过夜透析，进一步彻底除盐。随后再重 复第一步，离心浓缩。最后将浓缩后的rh FSH转移至eppendorf管中，放入 离心干燥机中进行处理。操作时间2小时10分钟，加热时间2小时，加热温 度60度。最后得到干燥待测rh FSH样品约0.4毫克共4支。3.待测rh FSH样品和rh FSH对照品富集产物完整性分析3.1用SDS-PAGE测定两者表观分子量3.1.1 溶液的制备3.1.1.1 30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 60g亚甲基双丙烯酰胺 1.6g溶于120ml水，定容至200ml,滤纸过滤。28 c避光保存，3个月内使用。3 1.1.2分离胶缓冲液(3.OmM,8 x)三羟甲基氨基甲烷(Tris)72.6g溶于140ml水，盐酸调pH至8.8,定容至200ml。28 c保存，3个月内 使用。3.1.1.3浓缩胶缓冲液(0.5mM,4x)三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.0g溶于70ml水，盐酸调pH至6.8,定容至100ml。28 c保存，3个月内使 用。3.1.1.4电极缓冲液三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.0g甘氨酸 28.8 gSDS 2.0g-20-中国药品生物制品检定所硕士学位论文溶于水后，定容至2000ml。室温保存，2周内使用。3.1.1.5 1%澳酚蓝澳酚蓝 100mg溶于1ml 0.Ol mol/L的NaOH中，用水定容至10ml,过滤。3.1.1.6 5 X样品缓冲液(10ml)非还原型还原型浓缩胶缓冲液1.2ml1.2ml80%甘油6.5ml6.0ml10%SDS2.0ml2.0ml1%澳酚蓝0.3m 10.3ml2-ME（或 10%的 DTT）一0.5ml3.1.1.7 2 X样品缓冲液（10ml）非还原型还原型浓缩胶缓冲液0.48 ml0.48 ml80%甘油5.0ml5.0ml10%SDS0.8 ml0.8 ml1%澳酚蓝0.2ml0.2ml筑基乙醇一0.2ml水3.6ml3.4ml3.1.1.8染色及固定液(考染)500ml 11考马氏亮蓝R-2500.5g中醇225ml冰乙酸50ml水225ml滤纸过滤后室温可贮存3个月。3.1.1.9脱色液（考染）500ml甲醇50ml冰乙酸50ml蒸福水400ml-21-中国药品生物制品检定所硕士学位论文3.1.2电泳胶的制备3.1.2.1.制胶12.5%分离胶：(12ml)30%丙烯酰胺溶液5.0ml分离胶缓冲液1.5ml10%SDS120ul水5.3ml10%过硫酸镂8 0u 1TEMED8 nl5%浓缩胶:(5ml)30%丙烯酰胺溶液0.8 3ml浓缩胶缓冲液1.25ml10%SDS50 u 1水2.8 2ml10%过硫酸镂50 u 1TEMED5Pl3.1.3样品处理用2倍非还原型样品缓冲液将蛋白样品制备成约5 口 g/20 口 1（h FSH蛋白质浓 度采用SEC-HPLC测定）；14.4-96.7KD的低分子量蛋白Marker:按着说明书进行。3.1.4电泳测定法将电极缓冲液注满内外电泳槽，拔出样品梳，用微量注射器在加样孔中加入 分子量Marker溶液10 P 1、样品溶液20 u 10以恒压8 0V开始电泳，至样品条带、进入分离胶后将电压调至120V,直至指示剂前沿移至电泳胶边沿处。关闭电源,取出电泳胶，浸入染色液中，用摇床摇动过夜。再进入脱色液中，用摇床摇动脱 色，不断更换新鲜的脱色液，直至凝胶底色近于无色为止。以分子量Marker标准斑点底Rf值为纵坐标，以分子量对数为横坐标，绘制 标准曲线，计算供试品的分子量。3.2 MALDI-TOF测定分子量-22-中国药品生物制品检定所硕士学位论文3.2.1样品的配制h FSH原液1.2mg/ml适量,采用10KD的透析袋透析过夜,5KD的超滤管浓缩。SEC-HPLC测定其浓度为10mg/ml o取样品10口1,加入40 U 10.125%TFA溶液，得到h FSH浓度为2mg/ml的 0.1%TFA的溶液。取 2mg/ml 的 0.1%TFA 的 h FSH 溶液 20 u 1 加入 20 u 10.1%TFA,得到 l mg/ml 的0.1%TFA的h FSH溶液。取 l mg/ml 的 0.1%TFA 的 h FSH 溶液 15 u 1 加入 15 u 10.1%TFA 得到 0.5mg/ml 的0.1%TFA的h FSH溶液。取 0.5mg/ml 0.1%TFA 的 h FSH 溶液 3 n 1 加入基质 CHCA3 口 1,点样 2 口 1。其 中基质CHCA用50%乙晴0.1%TFA的水溶液按照说明书配成饱和溶液，离心取其 上清。3.2.2外标的配制外标 1：Al dol ase(rabbit muscl e)平均分子量为 39212.28外标 2：Al bumin(bovin serum)平均分子量为 66430.09用0.1%TFA溶解，l OOpmol/口 1作为储备液，用时10倍稀释和基质1:1 混合，2 口 1点样。3.3.SEC-HPLC法测量分子量3.3.1 SEC-HPLC 色谱条件色谱柱：TSK gel G-2000wxl 柱(30cmX 7.8 mm)流动相(磷酸盐缓冲液):85%磷酸6.74mL加水8 00ml,再加硫酸钠14.2g,用50%的氢氧化钠溶液调pH至6.700.05,用水定容至1000ml,0.45um膜过 滤。流速：1.OmL/min检测波长：214nm测定法：吸取样品溶液100 uL注入液相色谱仪，记录色谱图，以分子筛 色谱蛋白分子量对照品(Ph armacia)做分子量标准。以重组人促卵泡激素峰为 计，理论塔板数应不小于1000,按外标法计算.3.3.2溶液的配制-23-中国药品生物制品检定所硕士学位论文对照品(国外某厂家)的配制：对照品适量，用注射用水稀释约为0.l mg/ml 的溶液。样品溶液的配制：重组人促卵泡激素(rh FSH),用注射用水稀释约为 0.l mg/ml的溶液。分子筛色谱蛋白分子量对照品(Ph armacia)的配制：将5种分子量标准 蛋白分别称取适量，用注射用水配成l mg/ml.再将5种分子量标准蛋白溶液各取 0.2ml混合成1ml.最后得5种混合溶液浓度为l mg/ml.(二)蛋白质紫外光谱1.溶液的配制1.1空白溶剂：10mM磷酸盐缓冲液(PB)+0.INaCl O.l mol/1磷酸盐缓冲液：A:NaH2P04 2H20 3.1202 克溶于水 100ml l 4B:Na2HP04-12H20 14.34 克溶于水 200ml;取 A 液 39ml,B 液定容至 200ml.4mol/l NaCl:23.4 克溶于 100ml 水。空白溶剂：0.l mol/1磷酸盐缓冲液稀释40倍，4mol/l NaCl稀释10倍2.样品的制备用空白溶剂稀释样品至0.48 mg/ml o3.紫外光谱扫描以空白溶剂为参比，在波长230330nm范围内，进行波长扫描，记录光谱图。(三)免疫印迹(Western Bl otting)1.缓冲溶液的制备1.1 转移缓冲液(pH8.4,半干转移)Tris 2.9g(60mM)、Gl y 1.45g(48 mM)、SDS 0.18 5g(0.05%),溶后定容 至400ml；用前加入20%甲醇。2.TBS 缓冲液(pH7.5)Tris 2.4g(20mM)、NaCl 29.2g(500mM),溶于 8 00ml 水，HC1 调 PH 值至 7.5,定