酶联免疫方法的原理及详细操作步骤.pptx

酶联免疫方法的原理及详细操作步骤1、ELISA得原理得原理2、ELISA得类型得类型3、试剂准备试剂准备:免疫吸附剂免疫吸附剂 结合物结合物 酶底物得准备酶底物得准备 4、对照设定对照设定5、标本得采取和保存标本得采取和保存6、结果判断结果判断 ELISA ELISA就是一种免疫测定就是一种免疫测定(immunoassayimmunoassay,IAIA)。基础。基础:抗抗原或抗体得固相化及抗原或抗体得酶标记。加入酶反应得原或抗体得固相化及抗原或抗体得酶标记。加入酶反应得底物后底物后,底物被酶催化成为有色产物底物被酶催化成为有色产物,产物得量与标本中受产物得量与标本中受检物质得量直接相关检物质得量直接相关,由此进行定性或定量分析。由此进行定性或定量分析。1、ELISA得原理得原理酶免疫测定类型酶免疫测定类型 这种固相酶免疫测定方法在这种固相酶免疫测定方法在19711971年最初建立时称为酶联免疫年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定吸附剂测定(Enzyme Linked ImmunoSorbent AssayEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay),),简称简称ELISAELISA。酶免疫技术酶免疫技术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均相酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定1 1、1 1抗原抗体反应抗原抗体反应 1 1、1 1、1 1可逆性可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物得过程就是一种动抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物得过程就是一种动态平衡态平衡,其反应式为其反应式为:Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗体得亲和力抗体得亲和力(affinityaffinity),),可以用平衡常数可以用平衡常数K K表示表示:K=AgK=AgAbAbAgAb,AgAgAb,AgAbAb得解离程度与得解离程度与K K值有关。值有关。高亲和力抗体得抗原结合点与抗原得决定簇在空间构型上高亲和力抗体得抗原结合点与抗原得决定簇在空间构型上非常适合非常适合,两者结合牢固两者结合牢固,不易解离。解离后得抗原或抗体不易解离。解离后得抗原或抗体均能保持原有得结构和活性。均能保持原有得结构和活性。1 1、1 1、2 2特异性特异性 抗原抗体得结合发生在抗原得决定簇与抗体得结合位点抗原抗体得结合发生在抗原得决定簇与抗体得结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系之间。化学结构和空间构型互补关系,具有高度得特异性。具有高度得特异性。测定某一特定得物质测定某一特定得物质,而不需先分离待检物。而不需先分离待检物。1 1、1 1、3 3最适比例最适比例 1 1、1 1、4 4敏感性敏感性化学比色法得敏感度为化学比色法得敏感度为mg/mlmg/ml水平水平酶反应测定法得敏感度约为酶反应测定法得敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法得敏感度与酶反应法相仿免疫测定中凝胶扩散法和浊度法得敏感度与酶反应法相仿标记得免疫敏感度可提高数千倍标记得免疫敏感度可提高数千倍,达达ng/mlng/ml水平水平例如例如,HBsAgHBsAg,其敏感度可达其敏感度可达0 0、1ng/ml1ng/ml。大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点1 1、4 4免疫测定在临床检验中得应用免疫测定在临床检验中得应用由于各种抗原成份由于各种抗原成份,包括小分子得半抗原包括小分子得半抗原,均可用以制备特均可用以制备特异性得抗血清或单克隆抗体异性得抗血清或单克隆抗体,利用此抗体作为试剂就可检利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应得抗原测标本中相应得抗原,因此免疫测定得应用范围极广。因此免疫测定得应用范围极广。2 2ELISAELISA得类型得类型 ELISA ELISA可用于测定抗原可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要得试剂法中有三个必要得试剂:(1 1)固相得抗原或抗体固相得抗原或抗体,即即 免疫吸附剂免疫吸附剂(immunosorbentimmunosorbent);(2 2)酶标记得抗原或抗体酶标记得抗原或抗体,称为称为 结合物结合物(conjugateconjugate);(3 3)酶反应得底物。酶反应得底物。可设计出各种不同类型得检测方法。可设计出各种不同类型得检测方法。2 2、2 2、1 1双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。只要获得针对受检抗原得异性抗体等。只要获得针对受检抗原得异性抗体,就可用就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。2 2、2 2、2 2 双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释标本不需稀释,可直接用于测定可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗接法。乙肝标志物中抗HBsAgHBsAg得检测常采用本法。本法关键得检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原得制备在于酶标抗原得制备,应根据抗原结构得不同应根据抗原结构得不同,寻找合适得寻找合适得标记方法。标记方法。2 2、2 2、3 3 间接法测抗体间接法测抗体 传染病得诊断。间接法得优点就是只要变换包被抗原就可利传染病得诊断。间接法得优点就是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体得方法。用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体得方法。2 2、2 2、4 4 竞争法测抗体竞争法测抗体 当抗原材料中得干扰物质不易除去当抗原材料中得干扰物质不易除去,或不易得到足够得纯化或不易得到足够得纯化抗原时抗原时,可用此法检测特异性抗体。可用此法检测特异性抗体。2 2、2 2、5 5 竞争法测抗原竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法得两个以上得位点小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法得两个以上得位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。可以采用竞争法模式。其原理就是标本中得抗原和一定量得酶标抗原竞争与固相其原理就是标本中得抗原和一定量得酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上得酶标抗结合在固相上得酶标抗原愈少原愈少,最后得显色也愈浅。小分子激素、药物等最后得显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISAELISA测测定多用此法。定多用此法。2 2、2 2、6 6 捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体IgMIgM得检测常用于传染病得诊断。用抗人得检测常用于传染病得诊断。用抗人IgMIgM抗体包被固相抗体包被固相,以捕获血清标本中得以捕获血清标本中得IgMIgM(其中包括针对抗原得特异性其中包括针对抗原得特异性IgMIgM抗抗体和非特异性得体和非特异性得IgMIgM)。此法常用于病毒性感染得早期诊断。此法常用于病毒性感染得早期诊断。2 2、2 2、7 ABS-ELISA7 ABS-ELISA法法:固相支持物固相支持物;:样品样品;:特异性特异性IgGIgG;:生物素化抗小鼠生物素化抗小鼠IgG IgG(BiotinBiotin););:辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HRP-HRP-酶标链亲和素酶标链亲和素(AvidinAvidin););:DABDAB显色液显色液;:显色显色;3 3、ELISA ELISA得试剂得试剂(A(A、B B、C C三部分三部分)ELISAELISA中有三个必要得试剂中有三个必要得试剂:免疫吸附剂、结合物和酶得底免疫吸附剂、结合物和酶得底物。物。(1 1)已包被抗原或抗体得固相载体已包被抗原或抗体得固相载体(免疫吸附剂免疫吸附剂););(2 2)酶标记得抗原或抗体酶标记得抗原或抗体(结合物结合物););(3 3)酶得底物酶得底物;(4 4)阴性对照品和阳性对照品阴性对照品和阳性对照品,参考标准品参考标准品;(5 5)结合物及标本得稀释液结合物及标本得稀释液;(6 6)洗涤液洗涤液;(7 7)酶反应终止液酶反应终止液ELISAELISA得试剂准备得试剂准备A A 固相载体固相载体 聚苯乙烯具有较强得吸附蛋白质得性能聚苯乙烯具有较强得吸附蛋白质得性能,抗体或蛋抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来得免疫学活性。白质抗原吸附其上后仍保留原来得免疫学活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质得吸附性能比聚苯乙烯高聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质得吸附性能比聚苯乙烯高,但但空白值也略高。空白值也略高。良好得良好得ELISAELISA板应该就是吸附性能好板应该就是吸附性能好,空白值低空白值低,孔底透明孔底透明度高度高,各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。3 3、1 1、2 2 包被得方式包被得方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体就是通过物理吸附结合得蛋白质与聚苯乙烯固相载体就是通过物理吸附结合得,靠靠得就是蛋白质分子结构上得疏水基团与固相载体表面得疏水得就是蛋白质分子结构上得疏水基团与固相载体表面得疏水基团间得作用。这种物理吸附就是非特异性得基团间得作用。这种物理吸附就是非特异性得,受蛋白质得受蛋白质得分子量、等电点、浓度等得影响。大分子蛋白质较小分子蛋分子量、等电点、浓度等得影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多得疏水基团白质通常含有更多得疏水基团,故更易吸附到固相载体表面。故更易吸附到固相载体表面。不易吸附得非蛋白质抗原可用间接包被得抗原经固相抗体得亲不易吸附得非蛋白质抗原可用间接包被得抗原经固相抗体得亲和层析作用和层析作用,包被在固相上得抗原纯度大大提高包被在固相上得抗原纯度大大提高,因此含杂质较因此含杂质较多得抗原也可采用捕获包被法。多得抗原也可采用捕获包被法。亲和素生物素亲和素生物素 即用亲和素先包被载体即用亲和素先包被载体,加入生物素化得加入生物素化得DNADNA,这种包被方法均匀、牢固这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质得定量已扩大应用于各种抗原物质得定量测定。测定。脂类物质无法与固相载体结合脂类物质无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂可将其在有机溶剂(例如乙醇例如乙醇)中溶解后加入中溶解后加入ELISAELISA板孔中板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒待酒精挥发后精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。让脂质自然干固在固相表面。优点优点:试验得特异性、敏感性均由此得以改善试验得特异性、敏感性均由此得以改善,重复性亦佳。重复性亦佳。抗原用量少抗原用量少,仅为直接包被得仅为直接包被得1/101/10乃至于乃至于/100/100。包被用抗原包被用抗原:天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原就是抗原决定簇得氨基酸序列人工合成得多肽片段。合成多肽抗原就是抗原决定簇得氨基酸序列人工合成得多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇一般只含有一个抗原决定簇,纯度高纯度高,特异性也高特异性也高,但由于分子量但由于分子量太小太小,往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体得往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体得吸附吸附,间接地结合到固相载体表面。间接地结合到固相载体表面。3 3、1 1、4 4 包被用抗体包被用抗体IgGIgG对聚苯乙烯有强吸附力对聚苯乙烯有强吸附力,其联结发生在其联结发生在FcFc段上段上,抗体结合点抗体结合点暴露于外。暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体得培养液取材于抗血清或含单克隆抗体得培养液、须除去杂抗体后才须除去杂抗体后才能用于能用于ELISAELISA,以保证试验得特异性。以保证试验得特异性。腹水中单抗得浓度较高腹水中单抗得浓度较高,特异性亦较强特异性亦较强,因此不需要作吸收层因此不需要作吸收层析处理析处理,直接包被。在某些情况下直接包被。在某些情况下,用多种单抗混合包被用多种单抗混合包被,可取可取得更好得效果。得更好得效果。3 3、1 1、5 5 包被得条件包被得条件pH9pH9、6 6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液pH7pH7、2 2得磷酸盐缓冲液得磷酸盐缓冲液pH7-8pH7-8得得Tris-HCLTris-HCL缓冲液。缓冲液。加入包被液后加入包被液后,在在4-84-8冰箱中放置过夜冰箱中放置过夜,3737中保温中保温2 2小小时。包被浓度随载体和包被物得性质可有很大得变化时。包被浓度随载体和包被物得性质可有很大得变化,每批每批材料需通过实验与酶结合物得浓度协调选定。一般蛋白质得材料需通过实验与酶结合物得浓度协调选定。一般蛋白质得包被浓度为包被浓度为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。3 3、1 1、6 6 封闭封闭封闭封闭(blocking)(blocking)就是继包被之后用高浓度得无关蛋白质溶就是继包被之后用高浓度得无关蛋白质溶液再包被得过程。封闭就就是让大量不相关得蛋白质充填液再包被得过程。封闭就就是让大量不相关得蛋白质充填这些空隙这些空隙,从而排斥从而排斥ELISAELISA后得步骤中干扰物质得再吸附。后得步骤中干扰物质得再吸附。常用封闭剂常用封闭剂:0 0、05%-005%-0、5%5%得得BSA;10%BSA;10%得小牛血清或得小牛血清或1%1%明明胶胶;脱脂奶粉脱脂奶粉,比较价廉比较价廉,可以高浓度使用可以高浓度使用(5%5%)。所有得所有得ELISAELISA固相均需封闭？固相均需封闭？3 3、4 4 洗涤液洗涤液在板式在板式ELISAELISA中中,常用得稀释液为含常用得稀释液为含0 0、05%05%吐温吐温2020磷磷酸盐缓冲液。酸盐缓冲液。ELISA得试剂准备得试剂准备B 3 3、2 2 结合物结合物 即酶标记得抗体即酶标记得抗体(或抗原或抗原)就是就是ELISAELISA中关键得试剂中关键得试剂 1 1 酶得催化活性酶得催化活性 2 2抗体抗体(或抗原或抗原)得免疫活性得免疫活性 3 3含有或少含有游离得抗体含有或少含有游离得抗体(或抗原或抗原)4 4结合物尚要有良好得稳定性。结合物尚要有良好得稳定性。3 3、2 2、1 1 结合物用得抗原和抗体结合物用得抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高得制备结合物时所用纯度较高得IgGIgG,以免在与酶联结时其以免在与酶联结时其她杂蛋白得干扰。最好用层析纯化得抗体她杂蛋白得干扰。最好用层析纯化得抗体,这样全部酶结合这样全部酶结合物均具有特异得免疫活性物均具有特异得免疫活性,可以在高稀释度进行反应可以在高稀释度进行反应,实验实验结果本底浅淡。在结果本底浅淡。在ELISAELISA中用酶标抗原得模式不多中用酶标抗原得模式不多,总得要总得要求就是抗原必须就是高纯度得。求就是抗原必须就是高纯度得。3 3、2 2、2 2酶酶纯度高纯度高,催化反应得转化率高催化反应得转化率高,专一性强专一性强,性质稳定性质稳定,来源丰富来源丰富,价格不贵价格不贵,受检标本中不存在相同得酶。受检标本中不存在相同得酶。酶结合物保留活性部分和催化能力酶结合物保留活性部分和催化能力,底物易于制备和保存底物易于制备和保存,价价格低廉格低廉,有色产物易于测定等。有色产物易于测定等。在在ELISAELISA中中,HRPHRP,APAP,葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶,-D-D-半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。HRPHRP就是一种糖蛋白就是一种糖蛋白,含糖量约为含糖量约为18%18%,分子量为分子量为4400044000,就是一就是一种复合酶种复合酶,由主酶由主酶(酶蛋白酶蛋白)和辅基和辅基(亚铁血红素亚铁血红素)结合而成结合而成,就就是一种卟啉蛋白质。是一种卟啉蛋白质。3 3、2 2、3 3 结合物得制备结合物得制备酶标记抗体得制备方法主要有两种酶标记抗体得制备方法主要有两种,即戊二醛交联法和过碘酸即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。盐氧化法。(1)戊二醛交联法戊二醛交联法:戊二醛就是一种双功能团试剂戊二醛就是一种双功能团试剂,可使酶与蛋可使酶与蛋白质得氨基通过她而联结。有效白质得氨基通过她而联结。有效(结合率达结合率达60%-70%60%-70%)和重复性和重复性好。好。交联反应就是随机得交联反应就是随机得,结合物得大小也不均一结合物得大小也不均一,酶与酶酶与酶,抗抗体与抗体之间也有可能交联体与抗体之间也有可能交联,影响效果。影响效果。(2 2)过碘酸氧化法过碘酸氧化法:适用含糖量较高得酶。过碘酸钠将适用含糖量较高得酶。过碘酸钠将HRPHRP分子分子表面得多糖氧化为醛基很活泼表面得多糖氧化为醛基很活泼,可与蛋白质上得氨基形成可与蛋白质上得氨基形成chiffchiff氏碱而结合。简便有效氏碱而结合。简便有效、结合物中混有得游离酶一般不影响结合物中混有得游离酶一般不影响ELISAELISA中最后得酶活性测中最后得酶活性测定。但游离得抗体则会与酶标抗体竞争相应得固相抗原定。但游离得抗体则会与酶标抗体竞争相应得固相抗原,因此因此制备得酶结合物应予纯化制备得酶结合物应予纯化,去除游离得酶和抗体后用于检测去除游离得酶和抗体后用于检测,效效果更好。果更好。制得结合物制得结合物,最适得工作浓度就就是指结合物稀释至这一浓最适得工作浓度就就是指结合物稀释至这一浓度时度时,能维护一个低得本底能维护一个低得本底,并获得测定得最佳灵敏度并获得测定得最佳灵敏度,达到最达到最合适得测定条件和测定费用得节省。合适得测定条件和测定费用得节省。3 3、2 2、4 4结合物得保存结合物得保存 酶和抗体均为生物活性物质酶和抗体均为生物活性物质,易失活。高浓度较为稳定易失活。高浓度较为稳定,冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积得甘油入等体积得甘油,加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素(例例如庆大霉素如庆大霉素)和防腐剂和防腐剂(HRPHRP结合物加硫柳泵结合物加硫柳泵,APAP结合物可加结合物可加叠氮钠叠氮钠)。3 3、2 2、5 5 结合物得稀释液结合物得稀释液 用于稀释高浓度得结合物以配成工作液。为避免结合物在用于稀释高浓度得结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上反应中直接吸附在固相载体上:0 0、1%1%牛血清白蛋白牛血清白蛋白,0 0、05%05%吐温吐温20 20。试剂盒均已用合适得缓冲液配成工作液。试剂盒均已用合适得缓冲液配成工作液,使用使用时不需再行稀释时不需再行稀释,在在4-84-8保存期可达保存期可达6 6个月。个月。试剂准备试剂准备 C 酶得底物酶得底物3 3、3 3 酶得底物酶得底物3 3、3 3、1 1 HRPHRP得底物得底物OPDOPD氧化后得产物呈橙红色氧化后得产物呈橙红色,用酸终止酶反应后用酸终止酶反应后,在在492nm492nm处有最处有最高吸收峰高吸收峰,灵敏度高灵敏度高,比色方便比色方便,就是就是HRPHRP结合物最常用得底物。结合物最常用得底物。DH2+H2O2 D+2H2O 上式中，上式中，DH2为供氧体，为供氧体，H2O2为受氢体。为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺如：邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS。ETMBTMB经经HRPHRP作用后共产物显蓝色。作用后共产物显蓝色。TMBTMB性质较稳定性质较稳定,可配成溶液试可配成溶液试剂剂,只需与只需与H H2 2O O2 2溶液混和即成应用液。酶反应终止后溶液混和即成应用液。酶反应终止后,TMBTMB产物产物由蓝色呈黄色由蓝色呈黄色,可在比色计中定量可在比色计中定量,最适吸收波长为最适吸收波长为450nm450nm。ABTSABTS虽不如虽不如OPDOPD和和TMBTMB敏感敏感,但空白值极低但空白值极低,也为一些试剂盒所采也为一些试剂盒所采用。用。HRPHRP对氢受体得专一性很高对氢受体得专一性很高,仅作用于仅作用于H2O2H2O2、小分醇得过氧化物、小分醇得过氧化物和尿素过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。APAP得底物为磷酸酯酶得底物为磷酸酯酶,一般采用对硝基苯磷酸酯作为一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色得对硝基酚底物。产物为黄色得对硝基酚,在在405nm405nm波长处有吸收波长处有吸收峰。用峰。用NaOHNaOH终止酶反应后终止酶反应后,黄色可稳定一时间。黄色可稳定一时间。APAP也也有发荧光底物有发荧光底物(磷酸磷酸4-4-甲基伞酮甲基伞酮),),可用于可用于ELISAELISA作荧光作荧光测定测定,敏感度较高于用显色底物得比色法。敏感度较高于用显色底物得比色法。3 3、5 5 酶反应终止液酶反应终止液常用得常用得HRPHRP反应终止液为硫酸反应终止液为硫酸,其浓度按其浓度按加量及比色液得最终体积而异加量及比色液得最终体积而异,在板式在板式ELISAELISA中一般采用中一般采用2mol/L2mol/L。4 4 对照设定对照设定 阳性对照品阳性对照品(positive control)(positive control)和阴性对照品和阴性对照品(negative(negative control)control)就是检验试验有效性得控制品就是检验试验有效性得控制品,同时也作为判断结果同时也作为判断结果得对照。得对照。阳性对照品得基本组成应尽量与检测标本得组成相一致阳性对照品得基本组成应尽量与检测标本得组成相一致,多以含蛋多以含蛋白保护剂得缓冲液为基质。白保护剂得缓冲液为基质。加入得量应与试剂得敏感度相称加入得量应与试剂得敏感度相称;在测定中得到得吸光值与受检标本吸光值比较在测定中得到得吸光值与受检标本吸光值比较,可以估计标本物质可以估计标本物质得量。得量。参考标准品参考标准品 定量测定定量测定(如甲胎蛋白质如甲胎蛋白质,癌胚抗原测定等癌胚抗原测定等)应含有制作标准应含有制作标准曲线用得参考标准品曲线用得参考标准品,应包括覆盖可检测范围得应包括覆盖可检测范围得4-54-5个浓度个浓度,一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂得缓冲液中一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂得缓冲液中、阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAgHBsAg检测得阴检测得阴性对照品中不可含性对照品中不可含HBsAgHBsAg,最好抗最好抗HBsHBs也就是阴性。也就是阴性。5 5 标本得采取和保存标本得采取和保存 体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。抗原成份。以血清标本为例以血清标本为例:血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其其她成份同血清。血浆和血清可同等应用。她成份同血清。血浆和血清可同等应用。血清标本应避免溶血血清标本应避免溶血:红细胞溶解时会释放出具有过氧化物红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性得物质酶活性得物质,以以HRPHRP为标记得为标记得ELISAELISA测定中测定中,可能会增加非特可能会增加非特异性显色。异性显色。加样加样:在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚次加样步聚,即加标本即加标本,加酶结合物加酶结合物,加底物。加样时应将所加物加在加底物。加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔得底部板孔得底部,避免加避免加在孔壁上部在孔壁上部,并注意不可溅出并注意不可溅出,不可产生气泡。不可产生气泡。基本操作注意事项基本操作注意事项保温保温抗原抗体完成反应得保温过程称为温育抗原抗体完成反应得保温过程称为温育(incubation)(incubation)。ELISAELISA属固相免疫测定属固相免疫测定,抗原、抗体得结合只在固相表面上发抗原、抗体得结合只在固相表面上发生。为什么生。为什么ELISAELISA反应总就是需要一定时间得温育？反应总就是需要一定时间得温育？温育常采用得温度有温育常采用得温度有4343、3737、室温和、室温和44(冰箱温度冰箱温度)等。等。3737就是实验室中常用得保温温度就是实验室中常用得保温温度,也就是大多数抗原抗体结也就是大多数抗原抗体结合得合适温度。合得合适温度。保温方式保温方式:ELISAELISA仪器附有特制得电热块仪器附有特制得电热块,水浴。水浴。若用保温箱若用保温箱:ELISAELISA板放在湿盒内板放在湿盒内,在盒底垫湿得纱布在盒底垫湿得纱布,最后将最后将ELISAELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放,以保证各板得温以保证各板得温度都能迅速平衡。度都能迅速平衡。室温温育得反应室温温育得反应,操作时得室温应严格限制在规定得范围内操作时得室温应严格限制在规定得范围内,标准室温温度就是指标准室温温度就是指20-2520-25,但具体操作时可根据说明书得但具体操作时可根据说明书得要求控制温育。应注意温育得温度和时间应按规定力求准确。要求控制温育。应注意温育得温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点为保证这一点,一个人操作时一个人操作时,一次不宜多于两块板同时测定。一次不宜多于两块板同时测定。洗涤洗涤洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不就是一个反应步骤过程中虽不就是一个反应步骤,但却也决定着实验但却也决定着实验得成败。得成败。ELSIAELSIA洗涤洗涤:达到分离游离得和结合得酶标记物得目得。达到分离游离得和结合得酶标记物得目得。清除残留在板孔中游离得物质清除残留在板孔中游离得物质,以及非特异性地吸附得干扰物以及非特异性地吸附得干扰物质。质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质得吸附就是普遍性得聚苯乙烯等塑料对蛋白质得吸附就是普遍性得,而在洗涤时又应把这而在洗涤时又应把这种非特异性吸附得干扰物质洗涤下来。种非特异性吸附得干扰物质洗涤下来。可以说在可以说在ELISAELISA操作中操作中,洗涤就是最主要得关键技术。洗涤就是最主要得关键技术。洗涤得方式除某些洗涤得方式除某些ELISAELISA仪器配有特殊得自动洗涤仪外仪器配有特殊得自动洗涤仪外,手工手工操作有操作有流水冲洗式和流水冲洗式和浸泡式两种浸泡式两种:(1 1)流水冲洗式流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体得洗涤流水冲洗法最初用于小珠载体得洗涤,洗涤液洗涤液为蒸馏水为蒸馏水,自来水。洗涤效果更为彻底自来水。洗涤效果更为彻底,且也简便、快速。已有且也简便、快速。已有实验表明实验表明,流水冲洗式同样适用于微量滴定板得洗涤。让水流流水冲洗式同样适用于微量滴定板得洗涤。让水流冲击板孔表面冲击板孔表面,洗涤效果更佳。洗涤效果更佳。(2 2)浸泡式浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂得微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂得中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质得结合就是疏水性得中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质得结合就是疏水性得,非非离子型洗涤剂既含疏水基团离子型洗涤剂既含疏水基团,也含亲水基团也含亲水基团,使蛋白质回复到水使蛋白质回复到水溶液状态溶液状态,从而脱离固相载体。从而脱离固相载体。显色显色显色就是酶催化无色得底物生成有色产物得温育反应。反应显色就是酶催化无色得底物生成有色产物得温育反应。反应得温度和时间仍就是影响显色得因素。在一定时间内得温度和时间仍就是影响显色得因素。在一定时间内,阴性孔阴性孔可保持无色可保持无色,而阳性孔则随时间得延长而呈色加强。适当提高而阳性孔则随时间得延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。温度有助于加速显色进行。TMBTMB受光照得影响不大受光照得影响不大,可在室温中置于操作台上可在室温中置于操作台上,边反应观察边反应观察结果。但为保证实验结果得稳定性结果。但为保证实验结果得稳定性,宜在规定得适当时间阅读宜在规定得适当时间阅读结果。结果。TMBTMB经经HRPHRP作用后作用后,约约4040分钟显色达顶峰分钟显色达顶峰,随即逐渐减弱随即逐渐减弱,至至2 2小时后即可完全消退至无色。小时后即可完全消退至无色。比色比色拭干板底附着得液体拭干板底附着得液体,然后将板正确放入酶标比色仪中。然后将板正确放入酶标比色仪中。以蒸馏水校零点以蒸馏水校零点,测读底物孔测读底物孔(未经任何反应仅加底物液得未经任何反应仅加底物液得孔孔)和空白孔和空白孔(以生理盐水或稀释液代替标本作全过程得孔以生理盐水或稀释液代替标本作全过程得孔),),以记录本次试验得试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零以记录本次试验得试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点点,以上各孔得吸光度需减去空白孔得吸光度以上各孔得吸光度需减去空白孔得吸光度,然后进行计算。然后进行计算。结果以光密度结果以光密度(oplical densityoplical density,ODOD),),现按规定用吸光度现按规定用吸光度(absorbenceabsorbence,A A),),两者含义相同。通常得表示方法就是两者含义相同。通常得表示方法就是,将吸将吸收波长写于收波长写于A A字母得右下角字母得右下角,如如OPDOPD得吸收波长为得吸收波长为492nm492nm,表示方表示方法为法为AA492492nmnm或或ODOD492492nmnm。酶标比色仪酶标比色仪酶标比色仪简称酶标仪酶标比色仪简称酶标仪,通常指测读通常指测读ELISAELISA光度计。针对固相光度计。针对固相载体形式得不同载体形式得不同,各有特制得适用于板、珠和小试管得设计。各有特制得适用于板、珠和小试管得设计。酶标仪得主要性能指标有酶标仪得主要性能指标有:测读速度、读数得准确性、重复性、测读速度、读数得准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良得酶标仪得读数一般可精确度和可测范围、线性等等。优良得酶标仪得读数一般可精确到精确到0 0、001001,准确性为准确性为1%1%,重复性达重复性达0 0、5%5%。操作时室温宜在操作时室温宜在15-3015-30,使用前先预热仪器使用前先预热仪器15-3015-30分钟分钟,测读测读结果更稳定。测读结果更稳定。测读A A值时值时,要选用产物得敏感吸收峰要选用产物得敏感吸收峰,如如OPDOPD用用492nm492nm波长。有得酶标仪可用双波长式测读。波长。有得酶标仪可用双波长式测读。各种酶标仪性能有所不同各种酶标仪性能有所不同,使用中应详细阅读说明书。使用中应详细阅读说明书。6 6 结果判断结果判断 6 6、1 1 定性测定定性测定定性测定得结果判断作出定性测定得结果判断作出“有有”或或“无无”得回答得回答,分别用分别用“阳阳性性”、“阴性阴性”表示。在这种半定量测定中表示。在这种半定量测定中,将标本作一系列将标本作一系列稀释后进行试验稀释后进行试验,呈阳性反应得最高稀释度即为滴度。根据滴呈阳性反应得最高稀释度即为滴度。根据滴度得高低度得高低,可以判断标本反应性得强弱可以判断标本反应性得强弱,这比观察不稀释标本这比观察不稀释标本呈色得深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。呈色得深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法在间接法和夹心法ELSIAELSIA中中,阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法法ELISAELISA中则相反中则相反,阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应得结果阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应得结果判断方法不同判断方法不同,分述于下。分述于下。A A、阳性判定值阳性判定值:(:(cut-off valuecut-off value)一般为阴性对照一般为阴性对照A A值加值加上一个特定得常数上一个特定得常数(0(0、05)05),以此作为判断结果阳性或阴性以此作为判断结果阳性或阴性得标准。得标准。B B、标本标本/阴性对照比值阴性对照比值:在实验条件在实验条件(包括试剂包括试剂)较难保证较难保证恒定得情况下恒定得情况下,这种判断法较为合适。在得出标本这种判断法较为合适。在得出标本(S S)和阴和阴性对照性对照(N N)得得A A值后值后,计算计算S/NS/N值。值。间接法和夹心法间接法和夹心法(2 2)竞争法竞争法因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照得显色差异因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照得显色差异,一般均一般均用比色计测定用比色计测定,读出读出S S、P P和和N N得吸光值。得吸光值。a a、阳性判定值法阳性判定值法 阴性判定值阴性判定值=0=0、4NCX+04NCX+0、6PCX6PCX 阳性阳性 AA阳性判定值阳性判定值 阴性阴性 A A阳性判定值阳性判定值 b b、抑制率法抑制率法 抑制率抑制率(%)=(阴性对照阴性对照A A值值-标本标本A A值值)100%/100%/阴性对照阴性对照 阳性阳性 抑制率抑制率50%50%为为 阴性阴性 50%50%4 4、7 7、2 2 定量测定定量测定ELSIAELSIA操作步骤复杂操作步骤复杂,影响反应因素较多影响反应因素较多,特别就是固相载体特别就是固相载体得包被难达到各个体之间得一致得包被难达到各个体之间得一致,因此在定量测定中因此在定量测定中,每批测每批测试均须用一系列不同浓度得参考标准品在相同得条件下制作试均须用一系列不同浓度得参考标准品在相同得条件下制作标准曲线。标准曲线。测定大分子量物质得夹心法测定大分子量物质得夹心法ELISAELISA,标准曲线得范围一般较宽标准曲线得范围一般较宽,曲线得值逐点连接曲线得值逐点连接,所得曲线一般呈所得曲线一般呈S S形形,其头、尾部曲线趋其头、尾部曲线趋于平坦于平坦,中央较呈直线得部分就是最理想得检测区域。中央较呈直线得部分就是最理想得检测区域。