蛋白质与酶工程第六章酶的固定修饰与改造.pptx

蛋白质与酶工程第六章酶的固定修蛋白质与酶工程第六章酶的固定修饰与改造饰与改造第一节第一节 固定化酶与固定化细胞固定化酶与固定化细胞一、酶得固定化一、酶得固定化二、细胞得固定化二、细胞得固定化三、辅酶得固定化三、辅酶得固定化一、酶得固定化一、酶得固定化(一一)概念及其优缺点概念及其优缺点 固定化酶固定化酶固定化酶固定化酶(immobilized enzyme):(immobilized enzyme):就是指将就是指将水溶性酶经过化学或物理手段处理水溶性酶经过化学或物理手段处理,固定在载体上固定在载体上,在一定得空间范围内起催化作用在一定得空间范围内起催化作用,并能反复与连续并能反复与连续使用得使用得(不溶于水不溶于水)酶。酶。水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶水不溶性酶水不溶性酶(固定化酶固定化酶固定化酶固定化酶)固定化技术固定化技术固定化技术固定化技术酶固定化得基本要求酶固定化得基本要求 尽可能得保持酶得活性与专一性尽可能得保持酶得活性与专一性;固定化载体应该与酶结合较为牢固固定化载体应该与酶结合较为牢固,不不与底物、产物发生反应与底物、产物发生反应,达到多次回收与反达到多次回收与反复使用复使用;酶固定化后产生得位阻应该较小酶固定化后产生得位阻应该较小,不妨不妨碍酶与底物接近碍酶与底物接近;成本尽可能低。成本尽可能低。固定化酶得优缺点固定化酶得优缺点优点优点优点优点:(1 1)可多次使用可多次使用可多次使用可多次使用;(2 2)可以装塔连续化生产可以装塔连续化生产可以装塔连续化生产可以装塔连续化生产(反应反应反应反应););(3 3)不溶于水不溶于水不溶于水不溶于水,易于与产物分离易于与产物分离易于与产物分离易于与产物分离,纯化简单纯化简单纯化简单纯化简单;(4 4)稳定性好稳定性好稳定性好稳定性好,提高产物质量提高产物质量提高产物质量提高产物质量;(5 5)提供了研究酶动力学得良好模型。提供了研究酶动力学得良好模型。提供了研究酶动力学得良好模型。提供了研究酶动力学得良好模型。(6 6)应用范围广。应用范围广。应用范围广。应用范围广。缺点缺点缺点缺点:(1 1)首次投入成本高首次投入成本高首次投入成本高首次投入成本高;(2 2)大分子底物较困难大分子底物较困难大分子底物较困难大分子底物较困难;(3 3)固定化过程中往往会引起酶得失活。固定化过程中往往会引起酶得失活。固定化过程中往往会引起酶得失活。固定化过程中往往会引起酶得失活。(二二)酶固定化得方法酶固定化得方法固定化方法固定化方法固定化方法固定化方法吸附法吸附法吸附法吸附法共价结合共价结合共价结合共价结合(偶联偶联偶联偶联)法法法法交联法交联法交联法交联法包埋法包埋法包埋法包埋法网格型网格型网格型网格型微囊型微囊型微囊型微囊型离子交离子交离子交离子交换吸附换吸附换吸附换吸附物理物理物理物理吸附法吸附法吸附法吸附法 无载体无载体无载体无载体固定法固定法固定法固定法多方法多方法多方法多方法联用联用联用联用各类固定化方法得特点比较各类固定化方法得特点比较比较项目比较项目比较项目比较项目吸附法吸附法吸附法吸附法共价结合法共价结合法共价结合法共价结合法 交联法交联法交联法交联法包埋法包埋法包埋法包埋法物理吸附物理吸附共价键结合共价键结合离子键结合离子键结合 制备难易制备难易制备难易制备难易易易易易难难难难易易易易 较难较难较难较难较难较难较难较难固定化程度固定化程度固定化程度固定化程度弱弱弱弱强强强强中等中等中等中等 强强强强强强强强活力回收率活力回收率活力回收率活力回收率较高较高较高较高低低低低高高高高 中等中等中等中等高高高高载体再生载体再生载体再生载体再生可能可能可能可能不可能不可能不可能不可能可能可能可能可能 不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能费用费用费用费用低低低低高高高高低低低低 中等中等中等中等低低低低底物专一性底物专一性底物专一性底物专一性不变不变不变不变可变可变可变可变不变不变不变不变 可变可变可变可变不变不变不变不变适用性适用性适用性适用性酶源多酶源多酶源多酶源多较广较广较广较广广泛广泛广泛广泛 较广较广较广较广小分子底物、小分子底物、小分子底物、小分子底物、药用酶药用酶药用酶药用酶大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点1 1、吸附法吸附法 根据吸附剂得特点分根据吸附剂得特点分:物理吸附法物理吸附法与离子交换吸附法与离子交换吸附法(1)物理吸附法物理吸附法(physical adsortion):通过通过酶与载体之间得范德华力、氢键、疏水酶与载体之间得范德华力、氢键、疏水作用力等将酶与载体联系起来得方法。作用力等将酶与载体联系起来得方法。吸附法吸附法作用力作用力:范德华力、氢键、疏水作用力范德华力、氢键、疏水作用力选择载体得原则选择载体得原则:有机载体与无机载体。有机载体与无机载体。要有巨大得比表面积要有巨大得比表面积;要有活泼得表面要有活泼得表面;便于装柱进行连续反应。便于装柱进行连续反应。常用载体常用载体:氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、骨胶孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、骨胶原、火棉胶、淀粉等。原、火棉胶、淀粉等。吸附法得类型吸附法得类型根据吸附剂得特点分根据吸附剂得特点分根据吸附剂得特点分根据吸附剂得特点分:物理吸附法与离子交换吸附法物理吸附法与离子交换吸附法物理吸附法与离子交换吸附法物理吸附法与离子交换吸附法(2 2)离子交换吸附离子交换吸附离子交换吸附离子交换吸附(结合结合结合结合)法法法法(ion bindingion binding):):通过离子效应通过离子效应通过离子效应通过离子效应,将酶分子固定到含有离子交换将酶分子固定到含有离子交换将酶分子固定到含有离子交换将酶分子固定到含有离子交换基团得固相载体上得固定化方法。基团得固相载体上得固定化方法。基团得固相载体上得固定化方法。基团得固相载体上得固定化方法。作用力作用力作用力作用力:离子键离子键离子键离子键 常用载体常用载体常用载体常用载体:DEAE-CelluloseDEAE-Cellulose (二乙氨乙基二乙氨乙基二乙氨乙基二乙氨乙基-纤维素纤维素纤维素纤维素););DEAE-dextran gel DEAE-dextran gel(二乙氨乙基二乙氨乙基二乙氨乙基二乙氨乙基-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶););CM-cellulose CM-cellulose(羧甲基纤维素羧甲基纤维素羧甲基纤维素羧甲基纤维素;carboxymethyl carboxymethyl cellulosecellulose)。吸附法得优缺点吸附法得优缺点优点优点优点优点:条件温与条件温与条件温与条件温与,操作简便操作简便操作简便操作简便,酶活力损失少。酶活力损失少。酶活力损失少。酶活力损失少。缺点缺点缺点缺点:结合力弱结合力弱结合力弱结合力弱,易解吸附。易解吸附。易解吸附。易解吸附。2 2、包埋法包埋法定义定义:将酶或含酶菌体用物理得将酶或含酶菌体用物理得方法包埋在各种具有特定网状方法包埋在各种具有特定网状结构结构(多孔多孔)载体载体(高聚物高聚物)中中,使使酶固定化得方法称为包埋法。酶固定化得方法称为包埋法。包埋法得类型包埋法得类型分为分为:凝胶包埋法与微胶囊包埋法凝胶包埋法与微胶囊包埋法(1 1)凝胶包埋法凝胶包埋法凝胶包埋法凝胶包埋法(网格型包埋法网格型包埋法网格型包埋法网格型包埋法):):将酶将酶将酶将酶包埋在交联得水不溶得高分子凝胶细包埋在交联得水不溶得高分子凝胶细包埋在交联得水不溶得高分子凝胶细包埋在交联得水不溶得高分子凝胶细微网格中。微网格中。微网格中。微网格中。常用得凝胶可分为天然凝胶与人常用得凝胶可分为天然凝胶与人常用得凝胶可分为天然凝胶与人常用得凝胶可分为天然凝胶与人工凝胶。工凝胶。工凝胶。工凝胶。如海藻酸钠、角叉菜胶、明如海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇与光交联树及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇与光交联树脂等合成凝胶。脂等合成凝胶。凝胶包埋法得种类凝胶包埋法得种类聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法:将酶包埋将酶包埋在聚丙烯酰胺凝胶中。在聚丙烯酰胺凝胶中。海藻酸钙包埋法海藻酸钙包埋法:凝胶包埋法常用凝胶包埋法常用得载体有利用海藻提取物海藻酸钠制成凝胶。得载体有利用海藻提取物海藻酸钠制成凝胶。琼脂糖凝胶包埋法琼脂糖凝胶包埋法:利用熔化得琼利用熔化得琼脂在温度低于脂在温度低于50凝固得特性来包埋酶。凝固得特性来包埋酶。使用得多孔载体及其特点使用得多孔载体及其特点凝胶凝胶凝胶凝胶包埋包埋包埋包埋条件条件条件条件酶活性酶活性酶活性酶活性强度强度强度强度天然天然凝胶凝胶琼脂琼脂;海藻酸钙海藻酸钙;角叉菜胶角叉菜胶;明胶明胶温与温与不变不变差差合成合成凝胶凝胶聚丙烯酰胺、光交联树脂聚丙烯酰胺、光交联树脂聚合聚合反应反应部分部分失活失活高高(2)微胶囊包埋法微胶囊包埋法(半透膜包埋法半透膜包埋法)微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成得半微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成得半微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成得半微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成得半透膜微胶囊内得方法。透膜微胶囊内得方法。透膜微胶囊内得方法。透膜微胶囊内得方法。半透膜半透膜半透膜半透膜:直径几十微米到几百微米直径几十微米到几百微米直径几十微米到几百微米直径几十微米到几百微米,厚约厚约厚约厚约25nm25nm。半透膜孔径小于酶分子孔径半透膜孔径小于酶分子孔径半透膜孔径小于酶分子孔径半透膜孔径小于酶分子孔径,小于半透膜孔径得小小于半透膜孔径得小小于半透膜孔径得小小于半透膜孔径得小分子底物与产物可以自由进出分子底物与产物可以自由进出分子底物与产物可以自由进出分子底物与产物可以自由进出,被称为被称为被称为被称为“人工细胞人工细胞人工细胞人工细胞”。它使酶存在于类似细胞内得环境中它使酶存在于类似细胞内得环境中它使酶存在于类似细胞内得环境中它使酶存在于类似细胞内得环境中,可以防止可以防止可以防止可以防止酶得脱落酶得脱落酶得脱落酶得脱落,防止微囊外得环境直接接触防止微囊外得环境直接接触防止微囊外得环境直接接触防止微囊外得环境直接接触,从而增加从而增加从而增加从而增加了酶得稳定性。了酶得稳定性。了酶得稳定性。了酶得稳定性。常用于制造微胶囊得材料有聚酰胺、火棉胶、常用于制造微胶囊得材料有聚酰胺、火棉胶、常用于制造微胶囊得材料有聚酰胺、火棉胶、常用于制造微胶囊得材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。醋酸纤维素等。醋酸纤维素等。醋酸纤维素等。(3)纤维素包埋法纤维素包埋法 常用于大规模生产。通过多孔常用于大规模生产。通过多孔喷丝头形成中空纤维喷丝头形成中空纤维,将酶包埋在将酶包埋在纤维内。纤维内。包埋法得优缺点包埋法得优缺点 优点优点:在于它就是一种反应条件温与、很少改在于它就是一种反应条件温与、很少改变酶结构但就是又较牢固得固定化方法。变酶结构但就是又较牢固得固定化方法。缺点缺点:只有小分子底物与产物可以通过高聚物只有小分子底物与产物可以通过高聚物网架扩散网架扩散,对那些底物与产物就是大分子得酶对那些底物与产物就是大分子得酶并不适合。并不适合。这就是由于高聚物网架会对大分子物质这就是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变,使活力降低。使活力降低。3 3、共价结合共价结合(偶联法偶联法)(Covalent binding or covalent coupling)共价结合共价结合共价结合共价结合(偶联偶联偶联偶联)法就是目前研究中最为活跃得方法。法就是目前研究中最为活跃得方法。法就是目前研究中最为活跃得方法。法就是目前研究中最为活跃得方法。(1 1)原理原理原理原理:酶蛋白分子上得功能基团与载体酶蛋白分子上得功能基团与载体酶蛋白分子上得功能基团与载体酶蛋白分子上得功能基团与载体(固相支持物固相支持物固相支持物固相支持物)表表表表面上得反应基团之间以共价键得作用而实现结合得固定化面上得反应基团之间以共价键得作用而实现结合得固定化面上得反应基团之间以共价键得作用而实现结合得固定化面上得反应基团之间以共价键得作用而实现结合得固定化方法。方法。方法。方法。(借助共价键将酶得非活性必需侧链基团与载体得功借助共价键将酶得非活性必需侧链基团与载体得功借助共价键将酶得非活性必需侧链基团与载体得功借助共价键将酶得非活性必需侧链基团与载体得功能基团进行偶连能基团进行偶连能基团进行偶连能基团进行偶连)。(2 2)载体选择得要求载体选择得要求载体选择得要求载体选择得要求:尽量选择亲水性强得载体尽量选择亲水性强得载体尽量选择亲水性强得载体尽量选择亲水性强得载体;载体结构疏松载体结构疏松载体结构疏松载体结构疏松,表面积大表面积大表面积大表面积大,有一定得机械强度有一定得机械强度有一定得机械强度有一定得机械强度;载体必须有在温与条件下与酶共价结合得功能基团载体必须有在温与条件下与酶共价结合得功能基团载体必须有在温与条件下与酶共价结合得功能基团载体必须有在温与条件下与酶共价结合得功能基团;载体没有或很少有非专一性吸附载体没有或很少有非专一性吸附载体没有或很少有非专一性吸附载体没有或很少有非专一性吸附;载体容易获得载体容易获得载体容易获得载体容易获得,能反复使用。能反复使用。能反复使用。能反复使用。共价结合共价结合(偶联法偶联法)(3 3)酶蛋白可以形成共价键得基团酶蛋白可以形成共价键得基团酶蛋白可以形成共价键得基团酶蛋白可以形成共价键得基团:游离氨基、游离羧基、游离氨基、游离羧基、游离氨基、游离羧基、游离氨基、游离羧基、巯基、巯基、巯基、巯基、咪唑基、咪唑基、咪唑基、咪唑基、酚基、酚基、酚基、酚基、羟基、羟基、羟基、羟基、甲硫基、甲硫基、甲硫基、甲硫基、吲哚基、二硫键。吲哚基、二硫键。吲哚基、二硫键。吲哚基、二硫键。酶蛋白酶蛋白N末端得末端得-氨基氨基氨基氨基或赖氨酸残基得或赖氨酸残基得-氨基氨基氨基氨基。酶蛋白酶蛋白C末端得末端得-羧基羧基羧基羧基、天门冬氨酸残基、天门冬氨酸残基得得-羧基以及谷氨酸残基得羧基以及谷氨酸残基得-羧基羧基羧基羧基。半胱氨酸残基得巯基。半胱氨酸残基得巯基。半胱氨酸残基得巯基。半胱氨酸残基得巯基。丝氨酸、苏氨酸与酪氨酸残基得羟基丝氨酸、苏氨酸与酪氨酸残基得羟基丝氨酸、苏氨酸与酪氨酸残基得羟基丝氨酸、苏氨酸与酪氨酸残基得羟基。组氨酸残基得组氨酸残基得咪唑基咪唑基咪唑基咪唑基。色氨酸残基得色氨酸残基得吲哚基吲哚基吲哚基吲哚基。苯丙氨酸与酪氨酸残基得苯丙氨酸与酪氨酸残基得苯环苯环苯环苯环。共价结合共价结合(偶联法偶联法)(4)常用得载体常用得载体:天然高分子、人工合成得高聚物、无天然高分子、人工合成得高聚物、无机载体。亲水载体优于疏水载体。机载体。亲水载体优于疏水载体。天然高分子衍生物天然高分子衍生物:纤维素、琼脂糖、葡聚糖凝胶纤维素、琼脂糖、葡聚糖凝胶;亲与性亲与性好好,机械性能差。机械性能差。合成聚合物合成聚合物:聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、尼龙聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、尼龙;机械性能机械性能好好,但有疏水结构。但有疏水结构。共价结合共价结合(偶联法偶联法)(5 5)载体活化载体活化载体活化载体活化(偶联偶联偶联偶联)得方法得方法得方法得方法:溴化氰法溴化氰法溴化氰法溴化氰法:即即用溴化氰将用溴化氰将用溴化氰将用溴化氰将含有羟基得载体含有羟基得载体,如纤维素、葡如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等,活化生成亚氨基碳酸酯衍生物活化生成亚氨基碳酸酯衍生物活化生成亚氨基碳酸酯衍生物活化生成亚氨基碳酸酯衍生物,然然后再与酶分子上得氨基偶联后再与酶分子上得氨基偶联,制成固定化酶。制成固定化酶。叠氮法叠氮法叠氮法叠氮法:即即载体活化生成叠氮化合物载体活化生成叠氮化合物载体活化生成叠氮化合物载体活化生成叠氮化合物,再与酶分子上得相再与酶分子上得相应基团偶联成固定化酶。应基团偶联成固定化酶。烷基化反应法烷基化反应法烷基化反应法烷基化反应法:以以卤素为功能团得载体卤素为功能团得载体卤素为功能团得载体卤素为功能团得载体可与酶蛋白分子可与酶蛋白分子上得上得氨基、巯基、酚基等氨基、巯基、酚基等氨基、巯基、酚基等氨基、巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。定化。重氮法重氮法重氮法重氮法:重氮法就是重氮法就是将酶蛋白与水不溶性载体得重氮基将酶蛋白与水不溶性载体得重氮基将酶蛋白与水不溶性载体得重氮基将酶蛋白与水不溶性载体得重氮基团通过共价键相连接团通过共价键相连接团通过共价键相连接团通过共价键相连接而固定化得方法而固定化得方法,就是共价键法中使用最就是共价键法中使用最多得一种。多得一种。硅烷化法硅烷化法硅烷化法硅烷化法:可在二氧化硅表面引入氨基可在二氧化硅表面引入氨基,活化得表面可以活化得表面可以利用一些中间分子利用一些中间分子(如二氯硫化碳如二氯硫化碳)进一步与酶分子发生连接进一步与酶分子发生连接反应。反应。4 4、交联法交联法 交联法交联法交联法交联法(cross-linkingcross-linking)就是利用双功能或多就是利用双功能或多就是利用双功能或多就是利用双功能或多功能试剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或功能试剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或功能试剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或功能试剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应酶分子与载体间进行交联反应酶分子与载体间进行交联反应酶分子与载体间进行交联反应,形成网状结构得形成网状结构得形成网状结构得形成网状结构得酶固定化方法。酶固定化方法。酶固定化方法。酶固定化方法。由于酶蛋白得功能团,如氨基、酚基、巯基如氨基、酚基、巯基如氨基、酚基、巯基如氨基、酚基、巯基与咪唑基与咪唑基与咪唑基与咪唑基,参与此反应,所以酶得活性中心构造酶得活性中心构造酶得活性中心构造酶得活性中心构造可能受到影响,而使酶失活明显。但就是尽可能地尽可能地尽可能地尽可能地降低交联剂浓度与缩短反应时间降低交联剂浓度与缩短反应时间降低交联剂浓度与缩短反应时间降低交联剂浓度与缩短反应时间将有利于固定化酶活力得提高。此法与共价结合此法与共价结合此法与共价结合此法与共价结合(偶联偶联偶联偶联)法利用得法利用得法利用得法利用得均就是共价键均就是共价键均就是共价键均就是共价键,不同之处就是什么？不同之处就是什么？不同之处就是什么？不同之处就是什么？交联法不使用载体！交联法不使用载体！交联法不使用载体！交联法不使用载体！交联法常用试剂交联法常用试剂 戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、N,N-乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺与乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺与N,N-乙烯双顺丁烯二酰亚胺等。乙烯双顺丁烯二酰亚胺等。其中应用最广泛得就是戊二醛其中应用最广泛得就是戊二醛,它得它得两个醛基都可以与酶或蛋白质得游离氨基两个醛基都可以与酶或蛋白质得游离氨基形成席夫碱形成席夫碱(shiff base),从而使酶分子之从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。间相互交联形成固定化酶。共价交联法得四种形式共价交联法得四种形式(1 1)酶直接交联法酶直接交联法:(2 2)酶辅助蛋白交联酶辅助蛋白交联:当可得到得酶量有限当可得到得酶量有限,可以使用第二可以使用第二个个“载体载体”蛋白来增加蛋白质浓度蛋白来增加蛋白质浓度,从而使从而使酶与惰性蛋白共交联得方法。酶与惰性蛋白共交联得方法。共价交联法得四种形式共价交联法得四种形式(3 3)吸附交联法吸附交联法:此法先将此法先将酶吸附在硅胶、藻土、氧化铝、球状酶吸附在硅胶、藻土、氧化铝、球状酶吸附在硅胶、藻土、氧化铝、球状酶吸附在硅胶、藻土、氧化铝、球状酚醛树脂或其她大孔型离子交换树脂上酚醛树脂或其她大孔型离子交换树脂上酚醛树脂或其她大孔型离子交换树脂上酚醛树脂或其她大孔型离子交换树脂上,再用戊二再用戊二再用戊二再用戊二醛等双功能试剂交联醛等双功能试剂交联醛等双功能试剂交联醛等双功能试剂交联,用此法所得固定化酶也可称用此法所得固定化酶也可称为为壳状壳状壳状壳状固定化酶。固定化酶。(4 4)载体交联法载体交联法:用多功能试剂得一部分功能基团化学修饰高聚用多功能试剂得一部分功能基团化学修饰高聚用多功能试剂得一部分功能基团化学修饰高聚用多功能试剂得一部分功能基团化学修饰高聚物载体物载体物载体物载体,而其中得另一部分功能基团偶联酶蛋白。而其中得另一部分功能基团偶联酶蛋白。四种固定化酶制备方法得特点小结四种固定化酶制备方法得特点小结指标指标指标指标物理吸附物理吸附物理吸附物理吸附包埋法包埋法包埋法包埋法共价结合法共价结合法共价结合法共价结合法共价交联法共价交联法共价交联法共价交联法物理吸附法物理吸附法物理吸附法物理吸附法离子吸附法离子吸附法离子吸附法离子吸附法制备制备制备制备易易易易易易易易较难较难较难较难难难难难较难较难较难较难结合程度结合程度结合程度结合程度弱弱弱弱中等中等中等中等强强强强强强强强强强强强酶活力回收酶活力回收酶活力回收酶活力回收高高高高,易流失易流失易流失易流失高高高高高高高高中中中中中中中中底物专一性底物专一性底物专一性底物专一性无变化无变化无变化无变化无变化无变化无变化无变化无变化无变化无变化无变化有变化有变化有变化有变化有变化有变化有变化有变化再生再生再生再生可能可能可能可能可能可能可能可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能固定化费用固定化费用固定化费用固定化费用低低低低低低低低中中中中高高高高中中中中(三三)固定化酶得评价固定化酶得评价(一一一一)固定化酶固定化酶固定化酶固定化酶(细胞细胞细胞细胞)得活力测定得活力测定得活力测定得活力测定 固定化酶通常呈颗粒状固定化酶通常呈颗粒状固定化酶通常呈颗粒状固定化酶通常呈颗粒状,一般用于测定自然酶活力一般用于测定自然酶活力一般用于测定自然酶活力一般用于测定自然酶活力得方法改进后才能用于测定固定化酶。得方法改进后才能用于测定固定化酶。得方法改进后才能用于测定固定化酶。得方法改进后才能用于测定固定化酶。(二二二二)蛋白总量测定蛋白总量测定蛋白总量测定蛋白总量测定 1 1、双辛可宁酸法双辛可宁酸法双辛可宁酸法双辛可宁酸法(Bicinchoninic acid;BCA(Bicinchoninic acid;BCA法法法法)2 2、考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法:(三三三三)偶联率及比偶联率及比偶联率及比偶联率及比(相对相对相对相对)活力测定活力测定活力测定活力测定(三三)固定化酶得评价固定化酶得评价(四四)固定化酶得操作半衰期固定化酶得操作半衰期 在连续测定条件下在连续测定条件下,固定化酶固定化酶(细胞细胞)得得活力下降为最初活力一半所经历得连续工作活力下降为最初活力一半所经历得连续工作时间时间,以以t1/2表示。就是衡量稳定性得一项重要表示。就是衡量稳定性得一项重要指标。指标。(五五)相对酶活力相对酶活力 具有相同酶蛋白量得固定化酶活力与具有相同酶蛋白量得固定化酶活力与游离酶活力得比值。游离酶活力得比值。(四四)固定化酶得性质与影响因素固定化酶得性质与影响因素1、固定化酶得形状固定化酶得形状 固定化酶得形式多样固定化酶得形式多样,依不同用途依不同用途有颗粒、线条、薄膜与酶管等形状。有颗粒、线条、薄膜与酶管等形状。其中颗粒占绝大多数其中颗粒占绝大多数,它与线条主它与线条主要用于工业发酵生产要用于工业发酵生产,如装成酶柱用于连续如装成酶柱用于连续生产生产,或在反应器中进行批式搅拌反应或在反应器中进行批式搅拌反应;薄膜主要用于酶电极薄膜主要用于酶电极,应用于分析应用于分析化学化学;酶管机械强度较大酶管机械强度较大,适用于工业生产。适用于工业生产。(四四)固定化酶得性质与影响因素固定化酶得性质与影响因素2 2、固定化对反应体系造成得效应固定化对反应体系造成得效应固定化对反应体系造成得效应固定化对反应体系造成得效应 酶经过固定化后引起得性质改酶经过固定化后引起得性质改酶经过固定化后引起得性质改酶经过固定化后引起得性质改变变变变,不外乎两种原因不外乎两种原因不外乎两种原因不外乎两种原因:一就是酶本身得变一就是酶本身得变一就是酶本身得变一就是酶本身得变化化化化,二就是受固定化载体得物理或化学二就是受固定化载体得物理或化学二就是受固定化载体得物理或化学二就是受固定化载体得物理或化学性质得影响。性质得影响。性质得影响。性质得影响。(1 1)构象效应构象效应构象效应构象效应:酶分子在固定化过程中酶分子在固定化过程中,酶分子与载体相互作用使得酶得活性中酶分子与载体相互作用使得酶得活性中酶分子与载体相互作用使得酶得活性中酶分子与载体相互作用使得酶得活性中心或变构中心构象发生变化心或变构中心构象发生变化心或变构中心构象发生变化心或变构中心构象发生变化。(2)屏蔽效应屏蔽效应:酶经固定化后酶经固定化后,载体会成载体会成为底物或者其她效应物结合到活性中心为底物或者其她效应物结合到活性中心或者变构中心得空间障碍或者变构中心得空间障碍,可以通过加可以通过加入连接臂得方式进行改善。入连接臂得方式进行改善。固定化酶得性质与影响因素固定化酶得性质与影响因素(3 3)微扰效应微扰效应微扰效应微扰效应:酶固定化后酶固定化后,载体固有得性质会引起紧邻固定化酶载体固有得性质会引起紧邻固定化酶载体固有得性质会引起紧邻固定化酶载体固有得性质会引起紧邻固定化酶得微环境得变化得微环境得变化得微环境得变化得微环境得变化,使酶得催化能力及酶对效应物作出调节反应得使酶得催化能力及酶对效应物作出调节反应得能力发生改变。能力发生改变。(4 4)分配效应分配效应分配效应分配效应:由于由于载体得亲水或者疏水特性以及带电特征载体得亲水或者疏水特性以及带电特征载体得亲水或者疏水特性以及带电特征载体得亲水或者疏水特性以及带电特征使底物、使底物、产物或其她效应物在每所处得产物或其她效应物在每所处得微环境与宏观体系间发生不等分配微环境与宏观体系间发生不等分配微环境与宏观体系间发生不等分配微环境与宏观体系间发生不等分配,改变了酶反应体系得组成平衡。改变了酶反应体系得组成平衡。(5 5)扩散限制效应扩散限制效应扩散限制效应扩散限制效应:指底物、产物与其她效应物在酶得微环境区与指底物、产物与其她效应物在酶得微环境区与宏观体系之间迁移与运转速度受到限制得一种效应。宏观体系之间迁移与运转速度受到限制得一种效应。3、固定化酶固定化酶(细胞细胞)性质得改变性质得改变 (1 1)固定化酶得活力在大多数情况下比天然酶下降固定化酶得活力在大多数情况下比天然酶下降固定化酶得活力在大多数情况下比天然酶下降固定化酶得活力在大多数情况下比天然酶下降,其专一性也会受到影响发生改变。其专一性也会受到影响发生改变。其专一性也会受到影响发生改变。其专一性也会受到影响发生改变。活力下降得原因活力下降得原因活力下降得原因活力下降得原因:酶分子在固定化过程中酶分子在固定化过程中酶分子在固定化过程中酶分子在固定化过程中,由于构象效应或调节由于构象效应或调节由于构象效应或调节由于构象效应或调节中心空间构象发生变化或者屏蔽效应造成酶得空间构像发中心空间构象发生变化或者屏蔽效应造成酶得空间构像发中心空间构象发生变化或者屏蔽效应造成酶得空间构像发中心空间构象发生变化或者屏蔽效应造成酶得空间构像发生了变化生了变化生了变化生了变化,活性中心无法与底物结合活性中心无法与底物结合活性中心无法与底物结合活性中心无法与底物结合;部分活性中心得氨基酸残基参与了与载体得结部分活性中心得氨基酸残基参与了与载体得结部分活性中心得氨基酸残基参与了与载体得结部分活性中心得氨基酸残基参与了与载体得结合合合合,导致部分酶完全丧失了活性导致部分酶完全丧失了活性导致部分酶完全丧失了活性导致部分酶完全丧失了活性;固定化后得空间障碍效应得影响固定化后得空间障碍效应得影响固定化后得空间障碍效应得影响固定化后得空间障碍效应得影响;内扩散阻力得影响使底物分子与活性中心得接内扩散阻力得影响使底物分子与活性中心得接内扩散阻力得影响使底物分子与活性中心得接内扩散阻力得影响使底物分子与活性中心得接近受阻近受阻近受阻近受阻;包埋法时被高分子物质半透膜包围。包埋法时被高分子物质半透膜包围。包埋法时被高分子物质半透膜包围。包埋法时被高分子物质半透膜包围。固定化酶固定化酶(细胞细胞)性质得改变性质得改变(2)固定化后酶稳定性提高固定化后酶稳定性提高 稳定性提高得原因稳定性提高得原因:固定化后得酶与载体多点连接固定化后得酶与载体多点连接,可防可防止酶分子伸展变形止酶分子伸展变形;酶活力得缓慢释放酶活力得缓慢释放;反应开始只有部分酶起作用反应开始只有部分酶起作用,其余部其余部分仅在开始起作用得酶变性后才起作用分仅在开始起作用得酶变性后才起作用;抑制自降解抑制自降解,提高了酶稳定性。提高了酶稳定性。固定化酶固定化酶(细胞细胞)性质得改变性质得改变(3 3)固定化酶固定化酶固定化酶固定化酶(细胞细胞细胞细胞)得最适得最适得最适得最适pHpH变化变化变化变化 酶固定化后酶固定化后酶固定化后酶固定化后,对底物得最适对底物得最适对底物得最适对底物得最适pHpH曲线常常发生偏移。曲线常常发生偏移。曲线常常发生偏移。曲线常常发生偏移。变化规律变化规律变化规律变化规律:一般来说一般来说一般来说一般来说,带负电荷载体制备得固定化酶带负电荷载体制备得固定化酶带负电荷载体制备得固定化酶带负电荷载体制备得固定化酶,其最适其最适其最适其最适pHpH值值值值较游离酶偏高较游离酶偏高较游离酶偏高较游离酶偏高;反之反之反之反之,若使用若使用若使用若使用带正电荷载体得话带正电荷载体得话带正电荷载体得话带正电荷载体得话,其最适其最适其最适其最适pHpH值较游离酶偏低值较游离酶偏低值较游离酶偏低值较游离酶偏低,即向酸性偏移。即向酸性偏移。即向酸性偏移。即向酸性偏移。原因原因原因原因:一就是酶本身一就是酶本身一就是酶本身一就是酶本身电荷电荷电荷电荷在固定化前后发生变化在固定化前后发生变化在固定化前后发生变化在固定化前后发生变化;二就是由于载体二就是由于载体二就是由于载体二就是由于载体电荷性质得影响致使电荷性质得影响致使电荷性质得影响致使电荷性质得影响致使固定化酶分子内外扩散层得氢离子浓度固定化酶分子内外扩散层得氢离子浓度固定化酶分子内外扩散层得氢离子浓度固定化酶分子内外扩散层得氢离子浓度产生差异产生差异产生差异产生差异;三三三三就是由于酶催化反应产物导致就是由于酶催化反应产物导致就是由于酶催化反应产物导致就是由于酶催化反应产物导致固定化酶分子内部形成带电荷微环境固定化酶分子内部形成带电荷微环境固定化酶分子内部形成带电荷微环境固定化酶分子内部形成带电荷微环境。一般来说一般来说一般来说一般来说,产物为酸性时固定化酶得最适产物为酸性时固定化酶得最适产物为酸性时固定化酶得最适产物为酸性时固定化酶得最适pHpH比游离酶高一些比游离酶高一些比游离酶高一些比游离酶高一些;产物为碱性产物为碱性产物为碱性产物为碱性时时时时,固定化酶得最适固定化酶得最适固定化酶得最适固定化酶得最适pHpH比游离酶低一些比游离酶低一些比游离酶低一些比游离酶低一些,产物为中性时产物为中性时产物为中性时产物为中性时,最适最适最适最适pHpH一般不改一般不改一般不改一般不改变。变。变。变。固定化酶固定化酶(细胞细胞)性质得改变性质得改变(4)固定化酶固定化酶(细胞细胞)得最适温度得变化得最适温度得变化 固定化酶得最适反应温度多数较游离酶高固定化酶得最适反应温度多数较游离酶高固定化酶得最适反应温度多数较游离酶高固定化酶得最适反应温度多数较游离酶高,如如如如色氨酸酶经共价结合后最适温度比固定前提高色氨酸酶经共价结合后最适温度比固定前提高色氨酸酶经共价结合后最适温度比固定前提高色氨酸酶经共价结合后最适温度比固定前提高5 51515,但也有不变甚至降低得。固定化酶得作用最适温但也有不变甚至降低得。固定化酶得作用最适温但也有不变甚至降低得。固定化酶得作用最适温但也有不变甚至降低得。固定化酶得作用最适温度会受固定化方法以及固定化载体得影响。度会受固定化方法以及固定化载体得影响。度会受固定化方法以及固定化载体得影响。度会受固定化方法以及固定化载体得影响。酶反应得最适温度就是酶热稳定性与反应速酶反应得最适温度就是酶热稳定性与反应速酶反应得最适温度就是酶热稳定性与反应速酶反应得最适温度就是酶热稳定性与反应速度得综合结果。因为固定化后度得综合结果。因为固定化后度得综合结果。因为固定化后度得综合结果。因为固定化后,酶得热稳定性提高酶得热稳定性提高酶得热稳定性提高酶得热稳定性提高,所所所所以最适温度也随之提高以最适温度也随之提高以最适温度也随之提高以最适温度也随之提高,这就是很有利得结果。这就是很有利得结果。这就是很有利得结果。这就是很有利得结果。固定化酶固定化酶(细胞细胞)性质得改变性质得改变(5 5)酶固定后动力学参数酶固定后动力学参数酶固定后动力学参数酶固定后动力学参数(米氏常数米氏常数米氏常数米氏常数;Km)Km)得变化得变化得变化得变化 米氏常数米氏常数米氏常数米氏常数KmKm反映了酶与底物得亲与力。酶经反映了酶与底物得亲与力。酶经反映了酶与底物得亲与力。酶经反映了酶与底物得亲与力。酶经固定化后固定化后固定化后固定化后,酶蛋白分子得高级结构得变化以及载体电酶蛋白分子得高级结构得变化以及载体电酶蛋白分子得高级结构得变化以及载体电酶蛋白分子得高级结构得变化以及载体电荷得影响可导致底物与酶得亲合力得变化。固定化酶荷得影响可导致底物与酶得亲合力得变化。固定化酶荷得影响可导致底物与酶得亲合力得变化。固定化酶荷得影响可导致底物与酶得亲合力得变化。固定化酶得表观米氏常数得表观米氏常数得表观米氏常数得表观米氏常数KmKm随载体得带电性能变化。随载体得带电性能变化。随载体得带电性能变化。随载体得带电性能变化。简单说简单说简单说简单说,由于由于由于由于高级结构变化高级结构变化高级结构变化高级结构变化及载体影响引起酶及载体影响引起酶及载体影响引起酶及载体影响引起酶与底物与底物与底物与底物亲与力亲与力亲与力亲与力变化变化变化变化,从而使从而使从而使从而使KmKm变化。而这种变化。而这种变化。而这种变化。而这种KmKm变化变化变化变化又受到溶液中底物离子强度影响又受到溶液中底物离子强度影响又受到溶液中底物离子强度影响又受到溶液中底物离子强度影响:离子强度升高离子强度升高离子强度升高离子强度升高,载体载体载体载体周围得静电梯度逐渐减小周围得静电梯度逐渐减小周围得静电梯度逐渐减小周围得静电梯度逐渐减小,KmKm变化也逐渐缩小以至消变化也逐渐缩小以至消变化也逐渐缩小以至消变化也逐渐缩小以至消失。失。失。失。固定化酶固定化酶(细胞细胞)性质得改变性质得改变(6)固定化酶底物特异性发生变化固定化酶底物特异性发生变化 固定化酶得底物特异性与底物分子量得固定化酶得底物特异性与底物分子量得固定化酶得底物特异性与底物分子量得固定化酶得底物特异性与底物分子量得大小有一定关系。大小有一定关系。大小有一定关系。大小有一定关系。一般来说一般来说一般来说一般来说,当酶得当酶得当酶得当酶得底物为小分子化合物时底物为小分子化合物时底物为小分子化合物时底物为小分子化合物时,固定化酶得固定化酶得固定化酶得固定化酶得底物特异性底物特异性底物特异性底物特异性大多数情况下大多数情况下大多数情况下大多数情况下不发生变化不发生变化不发生变化不发生变化。例如例如例如例如,氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等酶等酶等酶等,固定化前后得固定化前后得固定化前后得固定化前后得底物特异性没有变化底物特异性没有变化底物特异性没有变化底物特异性没有变化;