基于高通量测序分析覆盆子酵素自然发酵过程中的微生物多样性.pdf

1202023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究收稿日期：2023-02-18 *通信作者基金项目：2020 年福建省中青年教师教育科研项目（JAT201404）；漳州卫生职业学院院级科研项目（ZWYZ202008）。作者简介：邹毅辉（1983-），男，硕士，实验师，研究方向：微生物组学。E-mail：。基于高通量测序分析覆盆子酵素 自然发酵过程中的微生物多样性邹毅辉*，陈育青，黄建军（漳州卫生职业学院药学系，漳州 363000）摘 要：为了解覆盆子酵素自然发酵过程中微生物结构组成变化。采用 Illumina MiSeq 高通量测序分析覆盆子酵素自然发酵前期（6 d），中期（16 d），后期（46 d）中细菌和真菌的群落结构组成及多样性差异。覆盆子酵素自然发酵过程的优势细菌门是变形菌门（Proteobacteria），葡萄糖杆菌属（Gluconobacter）是优势细菌属，相对丰度为 95.9%、94.6%和 28.2%。子囊菌门（Ascomycota）是优势真菌门，优势真菌属为汉逊酵母属（Hanseniaspora）和裂殖酵母属（Schizosaccharomyces），相对丰度为 32.7%52.4%和 30.4%44.8%。毕赤酵母属（Pichia）在发酵过程中相对丰度逐渐增加，发酵后期相对丰度达到 31.2%。在覆盆子酵素自然发酵过程中，细菌的丰富度和多样性逐渐增加，真菌的丰富度逐渐减少，多样性逐渐增加。关键词：药食同源；覆盆子；高通量测序；自然发酵；微生物多样性中图分类号：Q815/TS201.3 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2023）09-0120-07doi：10.19804/j.issn1006-2513.2023.09.016Analysis of microbial diversity during natural fermentation of Rubus chingii Hu enzymes by high-throughput sequencingZOU Yihui*，CHEN Yuqing，HUANG Jianjun（Department of Pharmacy，Zhangzhou Health Vocation College，Zhangzhou 363000）Abstract：To investigate the changes of microbial structure during natural fermentation of Rubus chingii Hu，Illumina MiSeq high-throughput sequencing was used to analyze the community structure and diversity of bacteria and fungi in the early（6 d），middle（16 d），and late（46 d）stages of Rubus chingii Hu natural fermentation.Proteobacteria and Gluconobacter were the dominant bacteria in the fermentation process of Rubus chingii Hu，with relative abundance of 95.9%，94.6%and 28.2%.Ascomycota was the dominant phylum，and the dominant fungi were Hanseniaspora and Schizosaccharomyces before，during and after the fermentation，with the relative abundance of 32.7%52.4%and 30.4%44.8%.The relative abundance of Pichia gradually increased to 31.2%at the late fermentation stage.During the natural fermentation process，the richness and diversity of bacteria increased gradually while the richness of fungi decreased and the diversity increased.Key words：herb-food homology；Rubus chingii Hu；high-throughput sequencing；natural fermentation；microbial diversity1212023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究覆盆子是蔷薇科植物华东覆盆子（Rubus chingii Hu）的干燥果实，产于江苏、安徽、浙江、江西、福建、广西等省1。果大，味甜，可食、制糖及酿酒，又可入药，为强壮剂。覆盆子既可作为药品又可作为食品，所含主要药效化合物有萜类、黄酮类、甾体、有机酸、香豆素等，具有补肾、抗癌、降糖、降脂、降压、改善学习记忆及抗氧化抗衰老等作用2-5。覆盆子作为药食同源植物，已被广泛用于药品、保健品、化妆品等领域。食用发酵食品可以增加肠道微生物群多样性并降低炎症标志物6。利用药食同源植物制备酵素食品，不但具有药食两用植物的药效作用，还能提供丰富的有益菌，已经成为近年来酵素产品开发的新热点7。利用乳酸菌发酵桑葚，可以提高抑菌性能和抗氧化活性8-9。苏春雷等10利用米根霉曲和黑曲霉曲发酵余甘子，提高了余甘子酵素中的游离氨基酸含量和总酚含量。张巧 等11利用酵母菌、醋酸菌和乳酸菌对大果山楂进行混菌发酵，经过单因素试验和正交试验优化，提高了发酵液中总酚含量和 SOD 活力。在国外，覆盆子早已被开发成食疗、保健产品，但其产量远不能满足市场需求。虽然近十年来，全国多个省的覆盆子种植面积不断攀升，产量不断增加12，然而目前国内市面上覆盆子多以医疗保健产品为主，其他加工领域还处于起步阶段，市场存在较大空缺，急需进行覆盆子的深加工研究13。开发覆盆子发酵产品既改善浆果汁的感官品质，又改善国人体质，又符合精准扶贫，乡村振兴战略。在大健康背景下，筛选合适的益生菌用于发酵覆盆子具有广阔的应用前景。由于传统微生物分离方法的局限性，高通量测序方法已经成为探索微生物多样性及跟踪发酵过程的强大工具14。汤灿辉等15利用高通量测序技术分析沙棘酵素发酵过程中细菌群落结构的变化，发现泛菌属（Pantoea）是发酵初始的优势菌属，而发酵后期的优势菌属是乳杆菌属（Lactobacillus）。高庆超等16利用高通量测序技术分析了不同发酵阶段的黑果枸杞酵素微生物的群落组成及多样性，发现黑果枸杞酵素在自然发酵过程中优势细菌为乳杆菌属（Lactobacillus），优势真菌为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）。陈 宠 等17用 传 统 微 生物培养法和高通量测序技术分析海棠酵素微生物菌相，发现优势细菌为乳酸菌和醋酸菌，优势真菌为酵母菌。邸鹏月等18利用宏基因技术发现桑葚酵素发酵过程中的优势菌是乳杆菌 属（Lactobacillus），优 势 真 菌 为 汉 逊 酵 母（Hanseniaspora）。由于发酵原材料成分的多样性，不能仅用单一的菌种进行发酵，因此有必要筛选适用于不同的发酵底物的微生物19。本研究通过高通量测序技术，分析覆盆子酵素自然发酵过程中的微生物组成的多样性及其群落动态变化规律，为后续筛选覆盆子酵素自然发酵优势微生物，研发覆盆子发酵益生菌，实现多菌种共同发酵提供科学依据。1 材料和方法1.1 材料和试剂覆盆子：2021 年 5 月采购于浙江省衢州市开 化 县；E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 试剂盒：美国 OMEGA 公司；Qubit3.0 DNA 检测试剂盒：美国 Life 公司；2Hieff Robust PCR Master Mix：上海翊圣生物科技有限公司；Hieff NGS DNA Selection Beads：上海翊圣生物科技有限公司。1.2 仪器与设备Pico-21 台式离心机：美国 Thermo Fisher 公司；TND03-H-H 混匀型干式恒温器：深圳拓能达科技有限公司；DYY-6C 电泳仪：北京市六一仪器厂；ETC 811 PCR 仪：北京东胜创新生物科技有限公司；FR-1000 凝胶成像系统：上海复日科技有限公司。1.3 方法1.3.1 覆盆子自然发酵选取新鲜成熟的覆盆子，用无菌水冲洗果实表面，将覆盆子与白砂糖以质量比为 31 置于无菌培养瓶中自然发酵，在发酵的 144 h、384 h、1104 h 分别取样 50 mL，放置于-20 冰箱待测。分别命名为 FQ（发酵前期）、FZ（发酵中期）、FH（发酵后期），每个样本 3 个平行 重复。1222023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究1.3.2 样品处理以（OMEGA）E.Z.N.A Mag-Bind Soil DNA Kit 提取试剂盒进行发酵液 DNA 的提取。利用 Qubit3.0 DNA 检测试剂盒对基因组 DNA精确定量。PCR 所用的引物为细菌 16S V3-V4区 341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和 805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC），真 菌 ITS3-ITS4 区 ITS3F（GCATCGATGAAGAACGCAGC）和 ITS4R（TCCTCCGCTTATTGATATGC）。以第一轮的 PCR 产物为模板，使用 Illumina 桥式 PCR兼容引物进行第二轮扩增。产物经 2%琼脂糖凝胶电泳检测定量后纯化回收，由生工（上海）生物工程有限公司的 Illumina-MiSeq 平台进行高通量测序。1.3.3 数据处理高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别分析转化为原始测序序列，经 cutadapt 软件去除引物接头序列后使用 PEAR 软件拼接，再用PRINSEQ 软件进行质量筛选和优化，以 97%的相似度对样本序列进行 OTU 聚类，利用 Alpha 多样性指数分析微生物的多样性和丰富度，基于分类学信息分析样本中不同分类水平上的微生物群落结构及组成20-21，采用 GraPhlAn 绘制的分类和系统发育信息可视化图，使用 OriginPro 2019b软件绘制群落组成结构图。2 结果与分析2.1 覆盆子自然发酵样品微生物 Alpha 多样性分析不同发酵时期的覆盆子样品 16S rRNA 共产生 530 019 条有效序列，平均序列长度为 408 bp，使用 97%相似度的 OTU，总共聚成 1 573个 OUTS；ITS 测序后共产生 507 542 条有效序列，平均序列长度为 360bp，使用 97%相似度的OTU，总共聚成 215 个 OUTS。样本文库的覆盖率达到了 1（见表 1，表 2），说明测序数据量足够用来描述样品中微生物的群落组成。Chao 指数和 Ace 指数可以用来表示群落丰富度，表 1 中的可以看出发酵后期的细菌 Chao指数和 Ace 指数最大，细菌丰富度最高；而表 2中发酵前期的真菌 Chao 指数和 Ace 指数最大，真菌丰富度最高。Shannon 指数以及 Simpson 指数可以用来衡量群落的多样性。发酵前期的细菌和真菌 Shannon 指数最小，Simpson 指数值最大，说明发酵前期细菌和真菌多样性最低。综合来看，随着发酵时间的延长，细菌的丰富度逐渐增加，真菌的丰富度逐渐减少；细菌和真菌的多样性逐渐增加。表 1 细菌 Alpha 多样性指数统计表Table 1 Bacterial Alpha diversity indexesSample Number OTUs ChaoAceShannon Simpson Coverage细菌FQ59349 66 85.64 100.21 0.57 0.75 1.00 FZ56431 148 156.65 156.34 0.77 0.70 1.00 FH46096 311 311.46 311.60 3.22 0.15 1.00 表 2 真菌 Alpha 多样性指数统计表Table 2 Fungal Alpha diversity indexesSample Number OTUs Chao Ace Shannon Simpson Coverage真菌FQ57665 24 29.10 41.99 0.16 0.93 1.00 FZ54490 20 24.83 27.51 0.29 0.83 1.00 FH52920 28 28.42 13.81 0.58 0.77 1.00 2.2 覆盆子自然发酵样品细菌门水平上组成结构分析自然发酵的覆盆子在门水平上的细菌群落分布情况如图 1 所示。3 个样本共鉴定出 5 个细菌门，分别为变形菌门（Proteobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes），放线菌门（Actinobacteria），厚壁菌门（Firmicutes），绿弯菌门（Chloroflexi），蓝藻门（Cyanobacteria_Chloroplast）。FQ（发酵前期）变形菌门占 98.5%，FZ（发酵中期）占FQFZFH020406080100相对丰度/%样本名OtherChloroflexiCyanobacteria_ChloroplastFirmicutesActinobacteriaBacteroidetesProteobacteria图 1 门水平上细菌群落结构分布Figure 1 Community structure distribution at phylum level1232023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究97.4%，FH（发酵后期）占 64.6%。可以判断出变形菌门是整个发酵过程的优势菌门，在整个发酵过程中起主导作用。随着发酵的进行，拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）所占比例逐渐增加，到了发酵后期，拟 杆 菌 门（Bacteroidetes）增 加了 13.3%，放 线 菌 门（Actinobacteria）增 加 了11.05%，厚壁菌门（Firmicutes）增加了 4.2%。2.3 覆盆子自然发酵样品细菌属水平上组成结构分析自 然 发 酵 的 覆 盆 子 在 属 水 平 上 的 细 菌群 落 分 布 情 况 如 图 2 所 示。葡 萄 糖 杆 菌 属（Gluconobacter）在 FQ（发酵前期）和 FZ（发酵中期）所占比例分别达到了 95.9%和 94.6%。虽然到了发酵后期所占比例降到了 28.2%，但是葡萄糖杆菌属（Gluconobacter）仍是整个发酵过程的优势菌属。FH（发酵后期）类香味菌属（Myroides），假 单 胞 菌（Pseudomonas），气单胞菌属（Aeromonas）所占比例分别为 10.1%，8.7%，3.2%。图 3 居中的为丰度大于 1%的物种进化分类树，假单胞菌（Pseudomonas）和气单胞菌属（Aeromonas）进化距离较近。不同的颜色代表不同的门，点的大小代表丰度大小，可以看出变形菌门（Proteobacteria）的丰度最高。平均丰度大于 1%的点用紫色方块表示，反之用橙色倒三角标出，类香味菌属（Myroides），假单胞菌（Pseudomonas），气单胞菌属（Aeromonas）在各样本中的丰度均大于 1%。外围环为热力图，颜色越深代表丰度越高，葡萄糖杆菌属（Gluconobacter）颜色最深，丰度最高。FQFZFH020406080100相对丰度/%样本名Otherunclassified_Rhodobacteraceaeunclassified_Xanthomonadaceaeunclassified_Comamonadaceaeunclassified_GammaproteobacteriaJanibacterAeromicrobiumSaccharopolysporaThaueraClostridium_sensu_strictoTatumellaRhodococcusAcinetobacterAeromonasPseudomonasMyroidesGluconobacter图 2 属水平上细菌群落结构分布Figure 2 Community structure distribution at bacterial genus levelACTINOBACTERIABACTEROIDETESCYANOBACTERIA CHLOROPLASTFIRMICUTESIGNAVIBACTERIAEPROTEOBACTERIAUNCLASSIFIED BACTERIAFQ1FQ2FQ3FZ1FZ2FZ3FH1FH2FH3MyroidesSaccharopolysporaJanibacterRhodococcusBrachybacteriumNocardioidesAeromicrobiumGluconbacterParacoccusunclassified Rhodobacteraceaeunclassified ComamonadaceaeAcidovoraxThaueraZoogloeaunclassified Rhodocyclaceaeunclassified Xanthomonadaceaeunclassified GammaproteobacteriaAeromonasunclassified Oceanospirillales PseudomonasAcinetobacterTatumellaEscherichia Shigellaunclassified IgnavibacteriaceaeSphingobacteriumunclassified Cyclobacteriaceaeunclassified BacteriaClostridium sensu strictoStreptophyta图 3 样品中优势细菌分类和系统发育信息可视化图Figure 3 Taxonomy and phylogenetic information visualization of dominant bacteria in samples1242023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究葡萄糖杆菌属在自然界中广泛存在于各种植物（水果、谷物、草药等）中，是食品工业中的重要微生物，因为它们能够在发酵过程中将多种类型的糖和醇氧化成有机酸作为最终产物22。由于有机酸的浓度的增加，导致发酵液 pH 值下降，抑制了其他细菌的生长。葡萄糖杆菌属可以作为生产健康的天然软饮料的发酵剂23。类香味菌属（Myroides）可以用于发酵生产芳香酯类的香气挥发物，其出现在发酵食品中的作用机理目前尚不明确24。假单胞菌（Pseudomonas）可以分解蛋白质，与含氮代谢产物显著相关，是最先被证明可以产生吩嗪类化合物的菌株，吩嗪是一种具有广谱抗菌活性的生物制剂25，随着发酵的进行，各类微生物通过群体效应相互感知和调控，促成了发酵制品的微生物多样性。2.4 覆盆子自然发酵样品真菌门水平上组成结构分析自然发酵的覆盆子在门水平上的真菌群落分布情况如图 4 所示。优势菌门为子囊菌门（Ascomycota），在发酵前期相对丰度占比达99.9%，随着发酵的进行，到了发酵后期，子囊菌门的相对丰度只是小幅降低，其占比仍然达到了 98.7%，是整个发酵过程的绝对优势菌门。研究表明，子囊菌门也是葡萄酒发酵、番茄酵素、海棠酵素、红树莓酵素的优势菌门17，26-28。子囊菌门不但是木质素的重要分解者，也可能促进其他微生物对木质素的降解，在发酵食品中起重要作用29。各个时期的覆盆子自然发酵样品在真菌门水平上的群落结构组成相近。FQFZFH020406080100相对丰度/%样本名OtherAscomycota图 4 门水平上真菌群落结构分布Figure 4 Fungal community structure distribution at phylum level2.5 属水平上的真菌群落结构差异分析由 图 5 可 知，在 覆 盆 子 自 然 发 酵 过程 中 共 检 测 到 4 个 真 菌 属，分 别 是 汉 逊酵 母 属（Hanseniaspora），裂 殖 酵 母 属（Schizosaccharomyces），毕 赤 酵 母 属（Pichia）。其 中 汉 逊 酵 母 属（Hanseniaspora）在 发 酵前、中、后期相对丰度占比为 52.4%、56.7%、32.7%，呈 现 先 上 升 后 下 降 的 趋 势。而 裂 殖酵 母 属（Schizosaccharomyces）在 发 酵 前 期 占比 44.8%，到了后期占比降至 30.4%，呈现先降低后趋于稳定。发酵过程中，相对幅度变化最大的是毕赤酵母属（Pichia），相对丰度从发酵前期的 2.4%上升到发酵后期的 31.2%。从图 6 可以看出子囊菌门（Ascomycota）的丰度最高。汉逊酵母属（Hanseniaspora），裂殖酵母属（Schizosaccharomyces），毕赤酵母属（Pichia）在各样本中的丰度均大于 1%。汉逊酵母属（Hanseniaspora）和毕赤酵母属（Pichia）进化距离较近。FQFZFH020406080100相对丰度/%样本名Otherunclassified_SaccharomycetalesPichiaSchizosaccharomycesHanseniaspora图 5 属水平上真菌群落结构分布Figure 5 Distribution of fungal community structure at genus level汉逊酵母属（Hanseniaspora），裂殖酵母属（Schizosaccharomyces），毕赤酵母属（Pichia）三者都属于非酿酒酵母30。非酿酒酵母通常存在于水果表面，是发酵早期最大的酵母群体，许多出版物和专利揭示了这类酵母的重要性31。它们大多数无法自己单独完成发酵或者不被用来进行酒的发酵，但是可以对发酵后期的品质和风味起到积极的作用。最近人们对非酿酒酵母的应用越来越感兴趣，通过多菌种发酵方式进行降酸和提升1252023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究口感32。结合对覆盆子自然发酵过程中细菌多样性的分析，由此推断覆盆子自然发酵过程存在非酿酒酵母菌和葡萄糖杆菌共同发酵，它们分别利用发酵环境中的碳水化合物产生酒精和有机酸，以及其他风味物质等，并抑制不耐酸菌或杂菌 生长。ASCOMYCOTAMUCOROMYCOTAFQ1FQ2FQ3FZ1FZ2FZ3FH1FH2FH3Asoergillusunclassified SaccharomycetalesPichiaHanseniasporaMeyerozymaRhizopusSchizosaccharomyces图 6 样品中优势真菌分类和系统发育信息可视化图Figure 6 Taxonomy and phylogenetic information visualization of dominant fungi in samples3 结论本研究利用高通量测序技术首次分析了覆盆子酵素自然发酵过程中微生物结构组成变化。不同发酵时期的覆盆子样品 16S rRNA 测序共产生 530019 条有效序列和 1 573 个 OUTS，分别包含 7 个门、8 个纲、15 个目、17 个科、30 个属。ITS 测序后共产生 507 542 条有效序列和 215 个OUTS，分别包含 4 个门、7 个纲、7 个目、7 个科、7 个属。通过样品的微生物 Alpha 多样性分析表明，发酵时间越长，细菌的丰富度越大，真菌的丰富度越小，细菌和真菌的多样性逐渐增加。覆盆子酵素中微生物主要有葡萄糖杆菌属（Gluconobacter）和汉逊酵母属（Hanseniaspora），裂 殖 酵 母 属（Schizosaccharomyces），毕 赤 酵母属（Pichia）等非酿酒酵母组成。在发酵后期，葡 萄 糖 杆 菌 属（Gluconobacter）相 对 丰度 降 低，类 香 味 菌 属（Myroides），假 单 胞 菌（Pseudomonas），气单胞菌属（Aeromonas）相对丰度逐渐升高。汉逊酵母属（Hanseniaspora）相对丰度呈现先上升后下降的趋势。而裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）相对丰度呈现先降低后趋于稳定。毕赤酵母属（Pichia）相对丰度逐渐升高。本研究尝试系统地揭示覆盆子自然发酵的微生物多样性和菌群变化，为覆盆子酵素发酵过程中菌群的选育提供方向，也为评价药食同源发酵制品对机体健康的影响奠定基础，以期开发出高附加值的覆盆子发酵制品。1262023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究参考文献1庞敏霞，陈丁江，谢雄杰，等.基于网络药理学研究覆盆子活性成分抗肿瘤作用机制 J.中国中西医结合杂志，2021，41（9）：1120-1126.2Huo Y，Zhao X，Zhao J，et al.Hypoglycemic effects of Fu-Pen-Zi（Rubus chingii Hu）fruit extracts in streptozotocin-induced type 1 diabetic mice J.Journal of Functional Foods，2021，87：104837.3Wu J J，Zhang D Q，Zhu B，et al.Rubus chingii Hu.unripe fruits extract ameliorates carbon tetrachloride-induced liver fibrosis and improves the associated gut microbiota imbalance J.Chinese Medicine，2022，17（1）：56.4Su X H，Duan R，Sun Y Y，et al.Cardiovascular effects of ethanol extract of Rubus chingii Hu（Rosaceae）in rats：An in vivo and in vitro approach J.Journal of 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