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基于发光共振能量转移的无标记上转换荧光探针灵敏检测 8-OHdG闾心悦1，于 慧1，曹 丹2，郭会琴1，颜流水1，刘小明1（1.南昌航空大学 环境与化学工程学院，南昌330063；2.金华海关综合技术服务中心，浙江 金华321001）摘要 8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）是一种重要的 DNA 损伤标志物，其含量的多少可反映人体的氧化损伤程度。本研究以氨基功能化的上转换纳米粒子（Upconversion nanoparticles,UCNPs）为能量供体，金纳米粒子（AuNPs）为能量受体，由于 AuNPs 可导致 UCNPs 在 545 nm 处的荧光发生猝灭，而 8-OHdG 能够对 AuNPs 产非特异性诱导团聚作用，从而改变 UCNPs 在该位置处的荧光强度，据此构建了一种基于发光共振能量转移（Luminescence resonanceenergy transfer,LRET）的上转换荧光探针，并用于尿样基质中 8-OHdG 的检测。所建立方法简单、灵敏且适用 pH 范围宽。在 AuNPs 溶液的浓度为 1.34 nmolL1，pH 为 27 的实验条件下，所构建探针能够分别在低浓度范围（1.67 10113.3 109molL1）和高浓度范围（1.0 1083.3 106 molL1）内实现对 8-OHdG 的快速检测。共存干扰实验结果表明，尿样中常见的无机离子和化合物存在的前提下，所构建探针对 8-OHdG 呈现了良好的选择性。将探针应用于实际尿液样品基质中 8-OHdG 的检测，加标回收率为 91.4%109.2%。关键词 8-羟基-2-脱氧鸟苷；无标记检测；上转换荧光；纳米金；尿样 中图分类号 X132 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.2096-8566.2023.03.008 文章编号 2096-8566(2023)03-0076-12Sensitive Detection of 8-OHdG by a Label-free Upconversion Fluorescent ProbeBased on Luminescence Resonance Energy TransferLYU Xin-yue1，YU Hui1，CAO Dan2，GUO Hui-qin1，YAN Liu-shui1，LIU Xiao-ming1（1.School of Environmental and Chemical Engineering,Nanchang Hangkong University,Nanchang 330063,China;2.Jinhua Customs Comprehensive Technology Service Center,Zhejiang Jinhua 321001,China）Abstract:8-Hydroxy-2-deoxyguanosine(8-OHdG)is an important DNA damage marker,which can reflect the degree of oxidativedamage in human body.In this study,a LRET-based label-free upconversion fluorescent probe was constructed based on theLuminescence resonance energy transfer between amino-functionalized upconversion nanoparticles(UCNPs)as the energy donorand gold nanoparticles(AuNPs)as the energy acceptor.As the AuNPs can induce the fluorescence quenching of UCNPs at 545 nm,and 8-OHdG can produce nonspecifically induced clustering of AuNPs,the fluorescence intensity of UCNPs is altered,whichrenders the detection of 8-OHdG in urine matrix.The developed method is simple,sensitive,and workable over a wide pH window.When the concentration of AuNPs solution is 1.34 nmolL1 and the pH is 27,the 8-OHdG can be sensitively detected both in thelow concentration range (1.6710113.3109 mol L1)and high concentration range (1.01083.3106 mol L1).The anti-interference experiment results show that the co-existing inorganic ions and organic compounds found commonly in urine have no 收稿日期2023-07-30 修回日期2023-08-26基金项目国家自然科学基金（21665018，21966023）；江西省自然科学基金（20181BAB203014）通讯作者郭会琴（1982），女，副教授。主要研究方向：环境痕量有机物检测及水污染控制。第 37 卷 第 3 期南昌航空大学学报：自然科学版Vol.37 No.32023 年 9 月Journal of Nanchang Hangkong University:Natural SciencesSept.2023 obvious effect on the detection,indicating the well selectivity of the method.The spiked results obtained in real urine samplesexhibit a recovery ranged from 91.4%to 109.2%.Key words:8-hydroxy-2-deoxyguanosine；label-free detection；up-conversion fluorescence；Au nanoparticles；urine sample 引言生物体的氧化损伤是指机体内抗氧化与氧化之间的平衡被打破，导致氧化加重引起组织损伤1-2。8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxygua-nosine，8-OHdG）是活性氧（ROS）引起 DNA 氧化损伤的标志物3。生理条件下，ROS 被抗氧化防御系统清除，但过量的 ROS 会导致细胞成分的氧化损伤，包括蛋白质、脂质和 DNA。目前已发现的DNA 损伤产物中，鸟嘌呤由于拥有的分子轨道能级较高最易被氧化损伤，生成化学性质比较稳定的产物 8-OHdG。大量研究表明，8-OHdG 是在人体中发现的最丰富的氧化 DNA 修复产物，能进入血液并排泄到尿液中，而不会进一步代谢4。对于这种稳定的氧化修饰 DNA 产物的定量检测已被广泛用于反映 DNA 的氧化损伤程度。1989 年，Stillwell5首次报道了使用毛细管气相色谱质谱法对实验动物和人尿液样品中的 8-OHdG 的分析。此后，学者们针对 8-OHdG 的检测方法做了大量探索和研究。目前对 8-OHdG 进行检测的方法可以分为直接法和间接法两大类6-7。直接法的基本步骤是分离细胞 DNA 后，将这些分离物进行酶解或化学水解为核苷酸、核苷或游离碱基，最后利用色谱对 8-OHdG 进行分离和测定。直接法包括32P 后标记法、高效液相色谱电化学检测法（HPLC-CED）8、高效液相色谱质谱联用法（HPLC-MS/MS）9-10和气相色谱质谱联用法（GC-MS）等。间接法测定 8-OHdG 是利用 N-糖苷酶 DNA 来切割氧化的氮碱基使其断裂后进行检测的方法，有单细胞凝胶电泳法（彗星法）11-12、碱性洗脱法、免疫酶法（ELISA、RIA）13-14和聚合酶链式反应法（PCR）15。在这些方法中，高效液相色谱电化学检测法、高效液相色谱质谱联用法和气相色谱质谱联用法是较为常用的方法4，但也存在不同的局限性16。如：高效液相色谱电化学检测法对固相萃取技术（SPE）具有较大依赖性，高效液相色谱质谱联用法的线性范围较窄，气相色谱质谱联用法的操作步骤较为复杂且操作过程中产生的高温会导致衍生过程中 DNA 碱基的氧化等。因此，仍需要进一步探索能够高效、简便地检测 8-OHdG 的方法。荧光检测法因其高灵敏度、高稳定性和较小的细胞毒性等优点被广泛地研究和应用17-18。稀土上转换纳米材料（UCNPs）作为一种稀土掺杂的纳米发光材料，可在近红外激发下得到不同颜色荧光，能够有效避免检测样品干扰，提高检测体系的灵敏度，是构建荧光探针的理想材料。基于UCNPs 所构建的上转换荧光纳米探针目前已被研究者用于多种生物基质样品和不同环境样品中金属离子19、生物小分子20、细胞中活性氧21、化学致癌物22、环境持久性有机物23等痕量组分的灵敏检测。由于具有多重表面功能和特殊的表面等离子体共振效应，金纳米粒子（AuNPs）能够被应用在许多方面，是所有贵金属纳米粒子中研究最广泛的对象之一。AuNPs 的等离子共振性质可进一步导致表面增强拉曼光谱、荧光增强、光热转化和比色反应等，被广泛应用于原位检测和体内诊断成像等领域24。本课题组在前期研究中，曾使用柠檬酸钠还原法所制备的 AuNPs 基于共振光散射技术构建 8-OHdG 检测探针，并将其应用于尿样中 8-OHdG 的检测，获得了良好的精度和准确度25。在 本 研 究 中，将 柠 檬 酸 还 原 法 所 制 备 的AuNPs 作为能量受体，氨基修饰的稀土上转换纳米粒子 NaYF4:Yb,Er 作为能量供体，基于发光共振能量 转 移（Luminescence resonance energy transfer,LRET）作用，构建二者和待分析物 8-OHdG 之间由于静电作用而形成竞争机制的荧光探针来达到对8-OHdG 的灵敏检测。对检测体系的工作条件进 第 3 期闾心悦，于 慧，曹 丹，等：基于发光共振能量转移的无标记上转换荧光探针灵敏检测 8-OHdG 77 行系统研究，考察尿样中常见的无机离子和化合物与 8-OHdG 共存前提下该检测方法对目标物检测的选择性，并对健康成人尿样基质中 8-OHdG 进行加标回收检测。1 实验部分 1.1 主要仪器与试剂Q-250DV 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器 有 限 公 司）；Centrifuge5804 型 离 心 机（德 国Eppendorf 公司）；DZF-6050 型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；F-7000 荧光分光光度计（日本日立公司）；980 nm 高稳定性激光发射器（长春新产业光电技术有限公司）；Nicolet is5 傅里叶变换红外光谱仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；JSM-2010（HR）型透射电子显微镜（日本电子公司）；Direct-Q5UV 纯水仪（美国 Millipore 公司）。YCl3 6H2O（99.9%）、YbCl3 6H2O（99.9%）、ErCl36H2O（99.9%）、聚丙烯酸（PAA）购自麦克林试剂；氯金酸、油酸、3-氨丙基三乙氧基硅烷、聚乙烯吡络烷酮、异丙醇、正硅酸乙酯购自阿拉丁试剂；二水合柠檬酸三钠、乙二醇、NaCl、NH4F 购自西陇化工股份有限公司；8-羟基-2-脱氧鸟苷购自Sigma 公司。由于实验所用试剂均为分析纯，无需进一步纯化；8-OHdG 储备液用去离子水配置后，4 避光保存，使用前用流动缓冲液（B.R 缓冲液）将其稀释至所需浓度 16。1.2 材料制备 1.2.1 NaYF4:Yb,Er 的合成和氨基化修饰使用溶剂热法制备纳米上转换材料 NaYF4:Yb,Er26。将含 1 mmol Ln(Cl3)（Ln=Y,Yb,Er，摩尔比 80:18:2）的 5 mL 溶液加至 50 mL 烧瓶，并加入2 mmol 柠檬酸钠和 10 mL 去离子水，磁力搅拌10 min 使其充分溶解和分散。将含有 NaCl（2.88mmol）、NH4F（6 mmol）、油酸（10 mL）和乙二醇（5 mL）的混合液体加至上述溶液中，搅拌 30min 后转移到 50 mL 反应釜，于 180 下反应 6h。冷却后使用乙醇离心洗涤，并于 60 下过夜烘干，得到 UCNPs 固体粉末。称取 100 mg UCNPs 和 40 mg 聚乙烯吡络烷酮（PVP）加入盛有 60 mL 异丙醇的 250 mL 圆底烧瓶中，超声 40 min 使其完全分散。然后依次在其中加入 20 mL 蒸馏水和 2.5 mL 25%的氨水，35 下封口并快速磁力搅拌 15 min 后，逐滴加入20 mL 异丙醇和 60 L 正硅酸乙酯（TEOS）的混合溶液并反应 3 h。反应结束后再逐滴加入 30 mL 异丙醇和 200 L 的 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）的混合溶液，继续反应 1 h 后停止搅拌并于室温下陈化 2 h。最后将所得产物离心分离，并使用去离子水反复洗涤，得到表面氨基化修饰的核壳型上转换材料 NH2-UCNPs。将材料分散在去离子水中保存待进一步使用。1.2.2 金纳米粒子的制备取 2 mL 浓度为 1%的氯金酸溶液缓慢滴加至50 mL 的沸腾去离子水中，再加入 4 mL 1%二水合柠檬酸三钠煮沸 15 min 得到 AuNPs 溶液，停止加热并冷却至室温，在 4 下保存。1.3 纳米探针的构建及其对 8-OHdG 的荧光响应使用 B.R 缓冲液作为溶剂配置不同浓度的 8-OHdG 标准工作溶液。在 10 mL 具塞比色管中加入 1 mL AuNPs 溶 液 和 1 mL 不 同 浓 度 的 8-OHdG 标准溶液，充分混合均匀后于室温下静置，然后再加入 1 mL 制备好的 NH2-UCNPs 分散液，继续孵化 10 min，于 980 nm 激发光下，测量并记录体系在 545 nm 处的荧光发射光谱和强度变化，记为 F；使 用 相 同 体 积 的 B.R 缓 冲 溶 液 代 替 8-OHdG 标准溶液作为探针空白，将其在 545 nm 下的荧光发射光谱和强度记为 F0，根据 545 nm 处检测探针与探针空白荧光强度的差值变化（F0-F）实现对 8-OHdG 的定量检测。实验中测量 3 组平行数据取其平均值得到最终结果。1.4 尿样样品的采集及预处理尿样样品来自于健康成人，采集后将样品带回实验室并置于离心机中，于 12 000 rmin1条件下离心去除杂质，取上清液保存在 4 冰箱中待分 78 南昌航空大学学报：自然科学版第 37 卷析使用。实验前取出样品，使用 0.22 m 滤膜多次过滤后加入 B.R 缓冲液稀释 30 倍。测量时保持尿样体积不变，加入不同浓度 8-OHdG 进行回收率检测。所有实验均在室温下进行。1.5 荧光纳米材料的表征AuNPs 以及 AuNPs/NH2-UCNPs 的透射电镜（TEM）图像采用 JEM-2100F 显微镜获得，上转换荧光光谱通过日立 F-7000 荧光光谱仪（980 nm 激光器，长春新产业光电技术有限公司）测定得到，AuNPs 的紫外可见吸收光谱由北京普析 T6 紫外可见分光光度计得到。2 结果与讨论 2.1 材料表征以稀土氯化物为原料，通过溶剂热法合成了UCNPs 并对其进行表面氨基硅烷化修饰，得到NH2-UCNPs。材料的傅里叶红外（FT-IR）表征结果如图 1a 所示。可以看出，3430 cm1处为OH或 NH 伸缩振动峰，2930 cm1处为长链烷基中甲基CH3的对称伸缩振动峰，1625 cm1和 1426cm1处分别为胺的 NH 剪式振动峰和 CN 伸缩振动峰。另外，NH2-UCNPs 在 794、1090 cm1处有特异吸收峰，其中，794 cm1的特征峰来自SiO 的对称伸缩振动峰，1090 cm1的特征峰为SiOSi 反对称伸缩振动峰，表明在上转换材料表面已完成了硅烷化修饰。NH2-UCNPs 的 SEM图像如图 1b 所示，制备得到的 NH2-UCNPs 具有良好的分散性，呈扁平正六棱柱型，表面分布有小球状 SiO2颗粒，平均粒径为 1.5 m。进 一 步 地，对 添 加 8-OHdG 前 后 AuNPs 与NH2-UCNPs 的结合情况进行表征，获得 AuNPs 的紫外吸收光谱和透射电镜图像，如图 2 所示。从图 2a 可以看出：所制备的 AuNPs 呈规则球状、尺寸均一；由于 AuNPs 是使用柠檬酸三钠还原法合成，其表面带有丰富的负电荷，因而制得的 AuNPs在水溶液中具有良好的单分散性，十分稳定。AuNPs 粒径分布在 1020 nm，平均粒径 15 nm，电镜表征结果与根据 AuNPs 吸收峰位置推算的粒径结果一致。如图 2a 的紫外可见吸收光谱图所示，4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000500透光率/%UCNPs3439293016251426163010907941430(a)(b)波长/cm1NH2-UCNPs2 m 图 1 NH2-UCNPs 的红外表征图谱(a)和 SEM 图像(b)(a)(b)(c)(d)20 nm200 nm500 nm1 m0.80.60.40.20400450500550600650700波长/nm吸光度/(a.u.)图 2 AuNPs 形貌及其紫外可见吸收光谱图(a)、未添加 8-OHdG 的 AuNPs 与 NH2-UCNPs 的结合情况(b)和局部放大图(c)、加入 8-OHdG 后 AuNPs 与 NH2-UCNPs结合情况(d)(C8-OHdG=3 108 molL1)第 3 期闾心悦，于 慧，曹 丹，等：基于发光共振能量转移的无标记上转换荧光探针灵敏检测 8-OHdG 79 AuNPs 在 520 nm 处出现了最大吸收峰，对应吸光度为 0.724 Lmol1cm1。金纳米粒子浓度计算公式为：C=Aeb其中：C 为 AuNPs 浓度；e 为消光系数，520 nm 处e=2.7 108 L(molcm)1；A 为 AuNPs 最大吸收峰吸光度值；b 为比色皿长度，本实验 b=1 cm。通过该公式可计算得出所制备 AuNPs 浓度约为 2.68nmolL1。AuNPs 与 NH2-UCNPs 混合后的 SEM 结果如图 2b 和图 2c 所示，两者混合后 AuNPs 团聚在NH2-UCNPs 表 面 的 硅 烷 化 修 饰 层。8-OHdG（C8-OHdG=3 108 molL1）与 AuNPs 混合后，再加入 NH2-UCNPs 后表征的结果如图 2d 所示。可见，AuNPs 先与全部的 8-OHdG 通过静电吸附作用结合后，剩余的 AuNPs 再吸附在 NH2-UCNPs 表面，在 NH2-UCNPs 周 围 形 成 AuNPs 聚 集 簇，可 增强 AuNPs 对 NH2-UCNPs 的荧光共振能量转移作用。2.2 荧光探针的设计策略对所合成 AuNPs 的 UV-Vis 吸收光谱和 NH2-UCNPs 在 980 nm 激发光照射下的荧光发射光谱进行分析，如图 3 所示。AuNPs 在 450650 nm 处具有较宽的吸收峰，与 980 nm 激发下 NH2-UCNPs的发射光谱有较大的重叠范围。将 AuNPs 加入NH2-UCNPs 溶液后，体系在 545 nm 处的荧光强度发生了一定程度猝灭（图 3b），表明 AuNPs 与 NH2-UCNPs 之间发生了 LRET 作用。将 8-OHdG 与AuNPs 进行预结合后加入 NH2-UCNPs 溶液，体系在 545 nm 处的荧光猝灭得到一定的抑制或增强，据此建立 8-OHdG 的荧光检测方法。所构建能量转移体系对 8-OHdG 的荧光检测机 理 如 图 4 所 示。8-OHdG 上 的 氨 基 和 NH2-UCNPs 表面修饰的氨基在酸性条件下均可发生质子化而带正电荷，AuNPs 由于表面柠檬酸根离子的作用而带负电荷。在实验条件下，AuNPs 与质子化的 8-OHdG 相互作用，诱导 AuNPs 发生聚集。8-OHdG 在低浓度范围内与 AuNPs 发生聚集而形成小粒径的团聚物，导致 AuNPs 对 NH2-UCNPs 在545 nm 处的光谱吸收减少，从而使得体系较AuNPs 与 NH2-UCNPs 直接混合体系的发光增强；8-OHdG 在高浓度范围内诱导 AuNPs 发生急剧聚集而形成较大颗粒的聚集簇，分散在 NH2-UCNPs周围，从而增强了对 NH2-UCNPs 的荧光猝灭作用，400450500550600650700AuNPs(a)400450500550600650700010002000300040005000NH2-UCNPs(b)波长/nm波长/nmNH2-UCNPs吸光度/(a.u.)强度/(a.u.)NH2-UCNPs+AuNPs 图 3 AuNPs 吸收光谱和 NH2-UCNPs 发射光谱图(a)和NH2-UCNPs 与 AuNPs 混合后的荧光变化图(b)低浓度 8-OHdG高浓度 8-OHdGAuNPsAuNPsAuNPs 小粒径团聚物AuNPs 大颗粒聚集簇NH2-UNCPs 图 4 AuNPs/NH2-UCNPs 探针检测 8-OHdG 的机理图 80 南昌航空大学学报：自然科学版第 37 卷导致体系的上转换发光进一步减弱。2.3 所构建探针对 8-OHdG 的检测为使荧光探针对 8-OHdG 的检测性能达到最优，检测前对各物质的加入顺序、AuNPs 和 NH2-UCNPs 的浓度比、pH 值以及孵化反应时间进行了优化。2.3.1 体系中各物质加入顺序对检测灵敏度的影响考察了 8-OHdG、AuNPs 和 NH2-UCNPs 三者的不同加入顺序对检测体系的响应情况和灵敏度的影响，结果如图 5 所示。在将 NH2-UCNPs 先与8-OHdG 混合或最后加入 8-OHdG 的情况下，检测体系对 8-OHdG 的浓度变化均呈现基本无响应状态（图 5a）。在将 AuNPs 先与 8-OHdG 混合后再加入 NH2-UCNPs 条件下，8-OHdG 浓度的负对数与检测体系的荧光降低猝灭值呈现出如图 5b 所示的线性响应关系。这可能是由于 AuNPs 先与 8-OHdG 混合时，8-OHdG 分子中质子化的氨基可通过静电吸附诱导表面带负电的 AuNPs 发生团聚，从而使 NH2-UCNPs 在 545 nm 处的荧光强度被进一步猝灭。因此选择在将 AuNPs 先与 8-OHdG预混合后再加入 NH2-UCNPs 的顺序下对 8-OHdG进行定量检测。2.3.2 AuNPs 浓度对检测灵敏度的影响为考察 AuNPs 浓度对检测体系灵敏度的影响，取一系列不同浓度的 AuNPs 溶液（2.68、1.34、0.89、0.67、0.54 nmolL1），先与一定浓度的 8-OHdG 混合，后加入 1 mL 1 mgmL1 的 NH2-UCNPs溶液混合均匀，后使用缓冲溶液定容，并进行荧光光谱分析，所有结果均为两组平行实验的平均值。在相同 AuNPs 浓度下，将所测得的荧光强度与样品空白作比较，以两者在 545 nm 处的荧光强度差值 F0-F 为纵坐标，AuNPs 的浓度作为横坐标，得到图 6b 结果。当 AuNPs 浓度为 1.34 nmolL1时，F0-F 得到最大值，即 AuNPs 在此浓度下探针体系对 8-OHdG 具有较高的检测灵敏度。这可能是由于 8-OHdG 不能充分诱导低浓度的 AuNPs 发生聚 500550600650010002000300040005405425445463000320034003600380040004200NH2-UCNPs+8-OHdG+AuNPsNH2-UCNPs+8-OHdG+AuNPs(a)56789101130003250375040004250(b)强度/(a.u.)强度/(a.u.)强度/(a.u.)波长/nm波长/nmAuNPs+8-OHdG+NH2-UCNPsAuNPs+8-OHdG+NH2-UCNPsAuNPs+NH2-UCNPs+8-OHdGAuNPs+NH2-UCNPs+8-OHdGLOG(c8-OHdG)图 5 组分加入顺序对 AuNPs/NH2-UCNPs 检测体系灵敏度的影响 0.540.670.891.342.6820002500300035004000450050005500F0F(a)0.540.670.891.342.680100200300400500600700800(b)AuNPs 浓度/(nmolL1)AuNPs 浓度/(nmolL1)强度/(a.u.)F-F0F-F0 图 6 AuNPs 浓度对 AuNPs/NH2-UCNPs 检测体系灵敏度的影响(C8-OHdG=3 108 molL1)第 3 期闾心悦，于 慧，曹 丹，等：基于发光共振能量转移的无标记上转换荧光探针灵敏检测 8-OHdG 81 集，而 AuNPs 浓度太高时，与 NH2-UCNPs 之间的LRET 作用较强，加入 8-OHdG 后不容易产生明显的荧光强度变化。因此选择 AuNPs 溶液浓度 1.34nmolL1构建探针，并进行目标物检测。2.3.3 体系 pH 值对检测灵敏度的影响实验中发现溶液 pH 对体系检测目标物具有较大影响。使用 B.R 缓冲液调节溶液 pH 值至211 范围内，研究 pH 值对探针检测 8-OHdG 的影响，结果如图 7 所示。(a)(b)44004200400038003600340032003000强度/(a.u.)F0F24681012pH24681012pH10008006004002000F0-F 图 7 pH 值对 AuNPs/NH2-UCNPs 检测体系灵敏度的影响(C8-OHdG=3 108 molL1)在 pH 27 范围内该体系均能正常完成检测，同时在 pH 25 范围内具有更高的灵敏度。这可能是因为在检测过程中 8-OHdG 与 AuNPs 的预结合需要在其表面氨基质子化后才可以更好进行，且AuNPs 与 NH2-UCNPs 之间 LRET 作用的形成也需要 NH2-UCNPs 发生质子化后通过静电作用来完成，因此酸性条件对整个检测过程非常有利。随着 pH 继续增大，检测灵敏度呈下降趋势。因此实验选择在 pH 25 范围内对 8-OHdG 进行检测。与其他已有的 8-OHdG 检测方法相比，本实验在可测 pH 值范围方面有突出优势，Matayatsuk 等10用高效液相色谱法对 8-OHdG 进行测量需要在 pH4.5 条件下进行；而 Guan 等16利用毛细管电泳电化学方法进行检测，为达到获得较高的 8-OHdG 分辨率的同时尽量缩短分析时间防止分析物氧化的目的，需要将 pH 控制在 8.2 为最佳。相比之下，本探针在宽酸性范围内（pH 25）均能达到较高灵敏度，在中性范围内也能正常进行检测工作，显示出较为优越的应用前景。2.3.4 孵化时间的影响AuNPs/NH2-UCNPs 检测体系与 8-OHdG 结合前后的荧光稳定性通过荧光分光光度计进行测定。室温下每间隔 510 min 时间，将待测溶液进行荧光光谱扫描并记录其在 545 nm 处的荧光强度值，结果如图 8。由图 8a 可知：AuNPs/NH2-UCNPs 探针本身荧(a)(b)4200360034003200强度/(a.u.)时间/min0102030405060时间/min0102030405060F0F1000800600400200F0-F 图 8 8-OHdG 加入前后 AuNPs/NH2-UCNPs 体系的(a)荧光稳定性和(b)灵敏度随时间变化图(C8-OHdG=3 108 molL1)82 南昌航空大学学报：自然科学版第 37 卷光强度较为稳定；加入 8-OHdG 后，体系的荧光强度在 05 min 内迅速下降，510 min 时逐渐趋于平衡，10 min 后达到稳定状态，室温下至少可保持60 min。同样，以 545 nm 处荧光强度的差值 F0-F 为纵坐标，孵化时间为横坐标作图，得到图 8b 中结果。为确保 AuNPs/NH2-UCNPs 检测体系与 8-OHdG 相互作用后获得较稳定的荧光响应信号，后续实验选择室温孵化 10 min 后开始测定。2.4 标准曲线的制定分别在 10 mL 比色管中依次加入 1 mL 1.34nmolL1的 AuNPs 溶液和 1 mL 不同浓度的 8-OHdG 溶液，于室温下混合。然后，分别加入配置好的 NH2-UCNPs 水分散液后，使用 B.R 缓冲液定容至 3 mL 并混匀，在室温下孵化 10 min。将溶液转移到石英比色皿中，在 980 nm 激光器激发下记录体系发射光谱，并记录 545 nm 处的荧光发射强度。如图 9a 所示，加入 8-OHdG 后，体系荧光强度降低。推断小分子 8-OHdG 加入后均匀分散在溶液中，与 AuNPs 共同作用使 NH2-UCNPs 荧光进一步猝灭。与此同时，在 8-OHdG 的低浓度范围内和高浓度范围内，随着 8-OHdG 浓度的逐渐增加，体系的荧光强度呈现相反的变化趋势。50055060065001000200030004000空白(a)56789101130003100320033003400370038003900(b)8.59.09.510.010.511.0100150200250300350(c)5.56.06.57.07.58.0550600650700750800850900950(d)强度/(a.u.)强度/(a.u.)强度/(a.u.)4000380036003400波长/nm波长/nm3200540542544546LOG/(c8-OHdG)LOG/(c8-OHdG)LOG/(c8-OHdG)F0-FF0-FF0-F=71.409LOG(c8-OHdG)434.5F0-F=120.01LOG(c8-OHdG)+1547.4 图 9 8-OHdG 浓度对 AuNPs/NH2-UCNPs 体系的荧光发射强度影响(a)；标准曲线图(b)；低浓度范围内(c,1.67 10113.3 109 molL1)和高浓度范围(d,1.0 1083.3 106 molL1)8-OHdG 对体系荧光改变的影响 以 980 nm 光激发下加入 8-OHdG 前后探针在545 nm 处荧光强度的变化值 F0-F 为纵坐标，以 8-OHdG 浓度的负对数为横坐标作图，结果如图 9c图 9d 所示。图 9c 中，在低浓度范围内（1.67 10113.3 109 mol L1），AuNPs 对 NH2-UCNPs的 LRET 作 用 减 弱，体 系 荧 光 猝 灭 程 度 随 8-OHdG 浓度的增加而降低，这可能是因为此时AuNPs 相对 8-OHdG 过量，质子化带正电的 8-OHdG 加入后与 AuNPs 表面的负电位点首先结合，诱导 AuNPs 发生团聚后分散在溶液中，剩余AuNPs 可与 NH2-UCNPs 的表面氨基通过静电作用结合形成 LRET。第 3 期闾心悦，于 慧，曹 丹，等：基于发光共振能量转移的无标记上转换荧光探针灵敏检测 8-OHdG 83 由图 9d 可知，高浓度条件下（1.0 1083.3 106 molL1），AuNPs/NH2-UCNPs 体系荧光猝灭程度随着 8-OHdG 浓度的增加逐渐增强，这可能是由于此时相对于 AuNPs 来说 8-OHdG 过量，AuNPs 通过 8-OHdG 的诱导作用形成较大颗粒分散在 NH2-UCNPs 粒子周围，无需通过静电作用也能达到构成 LRET 的距离条件。且此范围内 8-OHdG 浓度越高，对 AuNPs 的诱导作用越大，形成的 AuNPs 团 聚 物 直 径 越 大，对 NH2-UCNPs 的LRET 作用越强，探针的荧光猝灭越明显。当加入 8-OHdG 的浓度介于 0.33 1081.0 108 mol L1之 间 时，8-OHdG 对 AuNPs/NH2-UCNPs 体系的荧光性能影响并不明显。这可能是因为在这个区间内，所加入 8-OHdG 与 AuNPs 之间的作用达到较为平衡的状态，此时既没有过量AuNPs 结合在 NH2-UCNPs 的表面而减弱 LRET 作用，也没有出现较大粒径的 AuNPs 团聚物而增加猝灭效应，从而 8-OHdG 对 AuNPs/NH2-UCNPs 的荧光性能影响降至最低。但不同浓度范围内 8-OHdG 对探针荧光猝灭的机理，还需要进一步的实验研究。2.5 所构建探针性能的对比与评价目前已有报道使用不同的材料和方法构建荧光探针用于检测 8-OHdG，将本文所构建的探针与这些荧光探针的不同参数进行综合比较，如表 1 所示。本文构建的探针具有如下优点：孵化时间短，探针制备好后可以短时间内检测出对应8-OHdG 的浓度，在实际操作中可以节省大量时间；线性范围宽，在低浓度与高浓度范围内均能对 8-OHdG 进行准确测量，提高了结果的准确性；检测限低，能够高于已有探针至少一个数量级的检测限，灵敏度极高；有较宽的 pH 响应范围（pH27），与需要保持 pH 在最佳值 7.4 的检测条件相比，本文的探针实验条件更宽容，便于不同情况下样品的测定；此外，大多荧光探针使用的是紫外光或可见光作为发射光，本方法使用的发射光波长在红外光范围内，为进一步开发原位检测方法提供基础。表 1 基于 LRET 的无标记上转换荧光探针与其他已报道荧光探针检测 8-OHdG 的比较探针种类线性范围/(nmolL1)检测限/(nmolL1)响应pH范围孵化(准备)时间/min激发光强/nm参考文献3-D DNA nanomachine0.02704 1037.46047027CDs/AuZIF-80.11.75 1033.1 1017.41035028AuNPs/CDs0.012.5 1047 1037.42035029Apt-K+-NMM3.962111.197.4103993012CAgNCs0.1100.057.41598031AuNPs/NH2-UCNPs1.67 1053.3 1030.013.31.67 1052710980本工作 Guan 等16利用毛细管电泳电化学方法，通过测定正常人与癌症患者尿液中 8-OHdG 的含量得到正常人尿液中 8-OHdG 的含量在 4.133 1085.064 108 molL1之间，而癌症病人尿液中 8-OHdG 的含量极高，在 2.258 5 1073.366 5 107molL1之间；Kuo 等32对乳腺癌患者尿液中的 8-OHdG 进行检测发现癌症病人体内的 8-OHdG 会随着癌症的各个阶段有所改变，从期的 1.055 7 107 molL1逐渐下降至期的 2.7 108 molL1。可以看到，不同病人、癌症发展的不同阶段等情况下，尿样中 8-OHdG 的含量都有所不同，但本研究在检出范围方面有突出优势，总能满足各种情况下的测定要求。2.6 潜在干扰物共存条件下的检测性能研究对所构建荧光探针的选择性检测研究结果如图 10 所示。在相同条件下测试了尿样中可能存在 84 南昌航空大学学报：自然科学版第 37 卷的一些干扰物质如尿素、尿酸、抗坏血酸、葡萄糖、肌酐、Ca2+、Mg2+、Al3+、Na+、Z