液态活检技术及其临床应用-课件.pdf

液态活检技术及其临床应用传统的肿瘤诊断技术病理组织检查（HE,IHC）r病理检验诊断血清标志物检测（CEA,PSA）分子病理检测（FISH,RT-PCRf NGS）传统肿瘤J 诊断技术）超声波检测（B超）X射线断层扫描术（XRAYfCT）I影像学检测核磁共振成像（MRI）正电子成像术（PET-CT）内窥镜（Endoscope）传统的肿瘤诊断存在的问题早期筛查：标记物不统一，方法不够灵敏或是特异性不足。临床诊断：影像学：较灵敏，特异性不足，对病灶大小有要求。病理学：金标准，但是需要组织样本，取样会带来创伤和扩散风 险，很多晚期患者无法取样或取样不足。治疗/复发转移监测：影像学：结果普遍存在滞后性。血清标志物：较灵敏，但是特异性不足；有些类型癌症没有合适 的血清标志物。2015年十大突破技术一液态活检技术MIT Technology ReviewMIT Technology Review杂志发布了2015年度十大突破技 术(10 Breakthrough Technologies 2015)的榜单。液态活检技术 光荣上榜。10Breakthrough Technologies2015液态活检：快速、简便、无痛苦、无创伤的癌症血液检测方法传统而又崭新的检测技术-“液态活检”“液态活检”的定义：A liquid biopsy is a liquid biomarker that can be easily isolated from many body fluids blood,saliva,urine,ascites,pleural effusion,etc.)and,as well as a tissue biopsy,a representative of the tissue from which it is spread.-Christian Rolfo,Biochimica et Biophysica Acta,2013.“液态活检”的标记物CTCsctDNA（cfDNA）主要指来自于抗凝的外周血全血，完整的肿瘤细胞主要指来自于抗凝血外周血的血浆，片段化 的DN A片段一般认为来源于肿瘤原发灶/转移灶肿瘤瘤细胞凋亡/坏死释放的DN A片段活细胞，一般不宜长期保存提取纯化后的核酸，可以保存可以用于细胞学形态、结构分析；也可以分 析细胞DN A、RN A、蛋白质等各类标志物一般用于DN A突变监测、甲基化等DN A修饰相 关分析用于病情评价、预后判断，肿瘤早期诊断潜 力不明确用于个体化治疗，肿瘤早期诊断潜力相对明 确还有miRNAs,Peptides,Exosomes（外泌体）,Secretomes（分泌物质组）等。什么是ctDNA?ctDNA(circulating tumor DNA),即循环肿瘤DNA,从字面意思来讲，指的是由肿瘤细胞释放到血液循环 系统中的DNA。但是在了解ctDNA之前，我们要知道另一个与之相关的概念一一cfDNAocfDNA(cell-free DNA),或者叫血浆游离DNA,是血浆中游离存在的DNA,它们有的来自于正常细胞，有 的来自于异常细胞(如肿瘤细胞)，还有部分来自于我们外部(如病毒DNA)。来源：1、来自于坏死的肿瘤细胞2、来自于凋亡的肿瘤细胞3、来自于肿瘤细胞分泌的外排物ctDNA的发现人们逐渐明白，cfDNA中携带肿瘤特有突变的那一小部分DNA,确 确实实是由肿瘤细胞释放出来的，ctDNA的研究终于与肿瘤关联起来。又过了 17年，人们才发现这种携带了突 变信息的循环DNA是肿瘤的标志1977年，Leon等人发现，肿瘤患者的 血浆游离DNA水平要明显高于健康人群早在1947年，Mandel和Metais就发 现血浆中存在游离的核酸分子。s N9U 03euap 三 J。Aduanb。不同分期癌症的ctDNA检出情况o o o O O 8614 2(造 2,7,Scott V BratmanJacqueline lb3,Jacob F Wyiuie3,Neville C W Eclov3,Leslie A Modliii5,Cliili Long Liu1,2,Joel W Neal2,Heather A Wakelee2,Robert E Merritt4,Joseph B Slirager4,Billy W Loo Jr3,Ash A Alizadeh1,2,5&Maximilian Diehn1*3,6Circulating tumor DNA(ctDNA)is a promising biomarker foe noninvash/e assessment of cancer burden,but existing ctDNA detection methods have insufficient sensitivity or patient coverage for broad clinical applicability.Here we introduce cancer personalized profiling by deep sequencing(CAPP-Seq),an economical and ultrasensitive method for quantifying ctDNA.We implemented CAPP-Seq foe non-small-cell lung cancer(NSCLC)with a design covering multiple classes of somatic alterations that identified mutations in 95%of tumors.We detected ctDNA in 100%of patients with stage ll-IV NSCLC and in 50%of patients with stage I.with 96%library preparation methods for low DNA input masses with a multiphase bioinformatics approach to design a selector consisting of biotinylated DNA oligonucleotides that target recurrently mutated regions in the cancer of interest.To monitor ctDNA,the selector is applied to tumor DNA to identify a patient s cancer-specific genetic aberrations and then directly to circulating DNA to quantify them(Fig.la).Here we demonstrate the technical performance and explore the clinical utility of CAPP-Seq in patients with early-and adranced-stage NSCLC.RESULTS著名的JohnsHopkins大学最近的一项研究揭示了ctDN A的真面目，它其实是 一种具备广泛应用前景、高敏感性、高特异性的肿瘤标志物，-Nature Medicine,2014,Mayo o o o O0 8 6 4 2-I-()21-SU SPretreatment plasma DNASn Sp一 Stages I l-IV 100%96%All stages 85%96%AUC 0.99 0.95r0-0 20 40 60 80 100100-specificity(%)研究者还在不同级别的肺癌患者中对CAPP-Seq进行了验证，发现H-IV期的N SCLC 中检测敏感性100%,I期的N SCLC中敏感性为50%,而且在各期的肺癌中的特异性均在 96%o在H-IV期和所有分期的肺癌中，根据R0C曲线计算出的AUC分别为0.99和0.95,所以CAPP-Seq具有强大的检测能力。临床资料表明，ctDN A比例低至0.019%的时候也 还能够被被PP-Seq检测到o Eno研究者用CAPP-Seq测定的ctDN A的水平和肿瘤体积（肿瘤体积用CT和PET评估测 定）之间存在显著相关性（p=0.0002,R2=0.89）,除了几例I期肺癌患者的肿瘤体 积明显高于其ctDN A相对应的大小。随访研究发现ctDN A水平随着疾病进展和相应的 治疗，也在不断变化。对10例样本（7例阳性和3例阴性）进行了肿瘤标本（侵入性 的活检）和血液标本（非侵入性的CAPP-Seq检测）在筛查和基因型（EGFR和K RAS）检测中的对比，结果发现CAPP-Seq并不比金标准肿瘤活检的检测效能差，能够准确 测定肺癌的基因型。c t DN A中P13 KC A的检测可用于预测 原发性乳腺癌患者的预后)o)oo o)0o D500050C2010(1N.3 2a(_E、sd。)s q 里_e-uelnuj os-aCases with Cases with HealthyPIK3CA PIK3CA non-controlmutant mutanttumors tumorso o o o o o0 8 6 4 2 1a()SLSLog-rank P=0.0029ctDNAr”(n=85)-u_ ctDNA-(n=25)50 100 150Months after surgeryo o o o o o0 8 6 4 21e()SLBLog-rank P=0.0002ctDNAiwFrw(n=98)i-ctDNA6(n=12)50 100 150Months after surgery100 Q O0 8 6 41b()s oJi 2:1Log-rankP=0.0283.ctDNAy0优(n=85)qctDNA(n=25)IOOOOO 0 8 6 4 2 1 f()soLog-rankP=0.0048-ctDNAlaw4f,eftve(n=98)-ctDNAhi(n=12)50 100 150Months after surgery50 100 150Months after surgery1.ctDNA有PI3KCA检出的乳腺癌患者，其预后要比没有检出的患者差。2.ctDNA中PI3KCA拷贝数高的乳腺癌患者，其预后要比拷贝数低的患者差。-Breast Cancer Res Treat,2015,MarchCTC形成、播散及转移的模式图原发肿瘤血管生成 一侵润：DIDI kY_pi._*_*_ z-l-.A上皮一间质转化wr(EMT)Q J /I 2 等,;肿瘤细胞r 血翟成1 F.r/间质-上皮转转移(MET)2)循环肿瘤细胞侵入血管内 TC)|、_)循环肿瘤Kg可自一J 微栓凋亡的CTC/、侵入血管外(CTC):血管内增殖.(CTM)转移到骨髓 1 _和其他器官 ，H 转移f rei a B播散肿瘤细胞(DTC)n 7微转移休眠灶CTC的稀有性和异质性Cell typeErythrocytes PlateletsReticulocytesNeutrophils Lymphocytes Monocytes Eosinophils BasophilsCTCsStemCTCsmjiwiMesenchymal cellEpithelial cellPart eplthellal/part1 I mesenchymal cell!Cancers,2013；Nature Review of Clinical Oncology,201018CTC的临床应用方向3、术后1、预后评估2、疗效 监测监用两种不同的方法检测CTC以评估 非小细胞肺癌患者的预后VariablesISET+p value*CellSearch 4-p value*ISET+and CellSearch+p value*ISET+orCell Search+p value*Histologic cell typeAdenocarcinoma64(53%)0.7451(43%)0.327(23%)0.2388(73%)0.066Squamous cell carcinoma23(40%18(32%)7(12%)34(60%)Neuroendocrine carcinoma4(57%)2(29%)1(14%)5(71%)Large cell carcinoma5(56%)4(44%)2(22%)7(78%)Adenosquamous carcinoma1(50%)0(0%)0(0%)1(50%)Sarcomatoid carcinoma4(40%)3(30%)2(20%)5(50%)NSCLC(NOS)3(60%)4(80%)3(60%)4(80%)pTNM stage144(48%)0.5033(36%)0.813(14%)0.0764(70%)0.59II24(60%)18(45%)12(30%)30(75%)III27(45%)24(40%)13(22%)38(63%)IV9(47%)7(37%)4(21%)12(63%)L ISET法检出率为104/210(50%),CellSearch法检出率为82/210(39%),两种方法 检出CTC的患者的DFS均明显劣于无CTC检出的患者。2.ISET法检出23/210(11%)的患者外周血中含有间质化的CTC细胞，这种细胞 通常意味着更强的侵袭性。ISET法和CellSearch法可以作为CTC检测的互补的方法，两种方法单独或者联合使 用都可以用于检测CTC,以评估肺癌手术的预后。-Int.J.Cancer,2011,Voll29通过检测非小细胞肺癌患者的外周血中 循环肿瘤细胞评价放疗疗效CTC Pilot study of Non-Small Cell Lung Cancer(NSCLC)patients receiving definitive RTCase D(Pre-RT)Pre-RTCTC analysisRTCTC analysisPost-RT CTC analysisRetrospectively correlate CTC trends with tumor response10 20 30Diameter(microns)40Case D(Post-RT)2015 10 o 5 _ e 0 0 10 20 30 40Diameter(microns)放疗前，65%患者检出CTC,平均检出率9.1CTCs/ml,明显高于放疗后的CTC平 均数（0.6个）。有1名在放疗后CTC明显未降低的患者，出现远端转移。-Cancer J,2015,121 CTC可作为慢性阻塞性肺炎(COPD)患者 肺癌早期诊断的新的标志物分类COPD患者吸烟者健康人检测结果CTC+CTC-CTC-CTC-人数51634235当时是否检测出癌症NoNoNoNo5年内检测出癌症Yes(5/5)NoNoNoTdble 2.Clinical and pj I ho logical churdclr of G FC positive COPD pulienl.adei ivcd t c mum aPatientsSexAgo(years)Smokinq status(PY)Year of COPD diagnosisGOLD scoreYear of CTC Detection(Study entry)CTCi/CTMYear of Lunq cancor diagnosisLung Cancor size(cm)HistologyStageMutation tumor statusOne-year ffallow up after surgeryCTGCTMPlM54GO19983200943120121.9Invasive papillary adfnorarrinnmaIAIWAS p.Glyl2GysNorecurrenceP2F4S27009673701015Invasive papillary adenocarcinomaIAKHA p Gly17ValNnrpriirrp nrpP3M47S519g720cMC It 1.11 adenocarcinomaIAKRAS|.(lyl X ysNoiP4M524519943200919120132bqudiiiuu cell cdruinuiikiIA5/KJ1(inisyis 匕 mutation)NufM.unen.eP5M635520013200928120131.5Invasive acinarIANo mutationNorecurrenceHofman P.,PLoS One,2014,Vol9(10)22CTC v.s.ctDNA互相排斥还是互为补充?CTCsCtDNA1.2.3.细胞形态结合分子标记，特异性高；血液中数量稀少，检测难度大；只能代表肿瘤细胞的部分亚群，但是是最有侵袭性的一部分细胞；V.S.4.反向选择的CTCs检测适用于大多数癌 症种类，但有些癌症检出率太低。5.完整的有活性的肿瘤细胞个体，能检 测对药物的反应；可以提供新的肿瘤治疗靶点，可以帮助理解肿瘤转移的机制。CTCs与ctDNA检1!的1.可能来源于非肿瘤组织，特异性低；2.血浆中含量较丰富，检测方法简便；3.来自多个细胞的更全面的遗传信息，但一般来自于凋亡的肿瘤细胞；4.ctDN A用于实时监测乳腺癌等疾病的进 展和疗效时，灵敏度更高；5.因为不含特异性突变，ctDN A不适用于 某些癌症的检测，比如肾癌。有机结合才是未Ct DNA及CTC检测与NSCLC的靶向治疗疗效的相关性AcB40()sLLd Plasma EGFR mut(N=4)Plasma EGFR wt(N=20)P=0.039Time(mo)PR/CR and decreased CTCs(N=6)Time(mo)1.检测EGFR突变时，ctDN A比CTCs更为灵敏，而且与原位肿瘤的一致性更高。2.CTC数量的减少更适宜用于作为快速评价疗效反应的标记物。Clin Cancer Res,2012,AprilORIGINAL ARTICLEAnalysis of Circulating Tumor DNA to Monitor Metastatic Breast CancerRESULTSCirculating tumor DNA was successfully detected in 29 of the 30 women(97%)in whom somatic genomic alterations were identified；CA 15-3 and circulating tumor cells were detected in 21 of 27 women(78%)and 26 of 30 women(87%),respectively.Circulating tumor DNA levels showed a greater dynamic range,and greater correlation with changes in tumor burden,than did CA 15-3 or circulating tumor cells.Among the measures tested,circulating tumor DNA provided the earliest measure of treatment response in 10 of 19 women(53%).文章主要通过数字PCR比较CtDNA、肿瘤标记物及循环肿瘤细胞三个方法 的比较，其中CtDNA灵敏度为97%,循环肿瘤细胞87%,肿瘤标记物灵敏度 为 78%,oNEJM,2013,March通过ctDNA及CTC检测监测转移性乳腺癌病情进展A Patient 17B Patient 8击 M.le3v.luM.EAJ2nu.huctDNA CA15-3 CTCDaysC Patient 20D Patient 6e u lo 2MURJSnEuDays)NA15-3与肿瘤标志物检测相比，CTC及ctDNA检测更能反映病情的进展。某些病例里，ctDNA检测与病情更一致；某些病例里，CTC检测与病情进展更一致;总结与展望“液态活检”的检测技术越来越丰富，“液态活检”研 究将会给临床诊断带来革命性的突破；“液态活检”是现有病理检测技术的必要和有效的补充;“液态活检”的准确性有待更多的临床数据进一步确认;病理科室理应成为“液态活检”的领军科室。27