CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用.pdf

第 45卷 第1期2024 年 1月Vol.45 No.1January 2024中山大学学报（医学科学版）JOURNAL OF SUN YATSEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用胡雅婷1，6，高原2，伍华燕1，梁俣3，李晖4，徐金东5，刘宇鹏3，单志新1，6（1.华南理工大学医学院，广东 广州 510006；2.南方医科大学第二临床医学院，广东 广州 510280；3.广东省心血管病研究所心内科，广东 广州 510080；4.广东省人民医院检验科，广东 广州 510080；5.广东省人民医院麻醉科，广东 广州 510080；6.广东省临床药理学重点实验室/南方医科大学附属广东省人民医院/广东省医学科学院 广东 广州 510080）摘要：【目的】探究环形RNA circSLC8A1_005调控心肌成纤维细胞纤维化表型的作用及可能机制。【方法】利用腺病毒介导在小鼠心肌成纤维细胞（mCFs）中过表达circSLC8A1_005，并检测mCFs中纤维化相关因I型胶原1链（Col1a1）、型胶原1链（Col3a1）和平滑肌肌动蛋白2（Acta2）基因表达，通过EdU和划痕实验检测不同干预对mCFs的增殖和迁移能力的影响。双萤光素酶报告基因实验检测circSLC8A1_005包含的潜在核糖体进入序列（IRES）的活性。通过Western blot实验检测circSLC8A1_005翻译蛋白SLC8A1-605aa及其在细胞内分布情况。双萤光素酶报告基因实验检测SLC8A1-605aa对超氧化物歧化酶2（Sod2）的转录激活作用。通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验检测SLC8A1-605aa与Sod2 mRNA的结合作用。放线菌素D实验检测SLC8A1-605aa对Sod2 mRNA稳定性的影响。【结果】利用腺病毒可在mCFs中有效介导过表达circSLC8A1_005，过表达circSLC8A1_005可显著抑制 mCFs 中纤维化相关基因表达，抑制 mCFs 的增殖和迁移能力。双萤光素酶报告基因实验结果提示 circSLC8A1_005包含的2个IRES具有活性。Western blot检测结果显示circSLC8A1_005可翻译预期大小为70 ku的SLC8A1-605aa蛋白，并主要分布于细胞核内。过表达SLC8A1-605aa和circSLC8A1_005可一致地抑制mCFs的纤维化表型。SLC8A1-605aa可特异上调超氧化物歧化酶2（Sod2）表达，但并不能转录激活Sod2表达；RIP实验结果显示SLC8A1-605aa与Sod2 mRNA有特异结合作用，而放线菌素D实验结果显示SLC8A1-605aa能够增强Sod2 mRNA的稳定性。【结论】CircSLC8A1_005通过翻译蛋白 SLC8A1-605aa发挥抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用，SLC8A1-605aa可能是潜在的用于心肌纤维化治疗的靶点。关键词：心肌纤维化；环形RNA；circSLC8A1_005；翻译；心肌成纤维细胞中图分类号：R363.2 文献标志码：A 文章编号：1672-3554（2024）01-0035-10DOI：10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.2024.0106CircSLC8A1_005 Inhibits the Fibrotic Phenotype of Cardiac Fibroblasts by Encoding ProteinHU Yating1，6，GAO Yuan2，WU Huayan1，LIANG Yu3，LI Hui4，XU Jindong5，LIU Yupeng3，SHAN Zhixin1，6（1.School of Medicine，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；2.The Second School of Clinical Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510280，China；3.Department of Cardiology，Guangdong Cardiovascular Institute，Guangzhou 510080，China；4.Department of Clinical Laboratory，Guangdong Provincial Peoples Hospital，Guangzhou 510080，China；5.Department of Anesthesiology，Guangdong Provincial People s Hospital，Guangzhou 510080，China；6.Guangdong Provincial Key Laboratory of Clinical Pharmacology/Guangdong Provincial People s Hospital/Guangdong Academy of Medical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510080，China）Correspondence to：SHAN Zhixin；E-mail： 基础研究 收稿日期：2023-09-13 录用日期：2023-11-27基金项目：国家自然科学基金（82070254，82200325，82300277）；广东省自然科学基金（2023A1515010201，2022A1515012522，2022A1515012175，2021A1515220122）；广州市科技计划项目（202201011627，202102080093）作者简介：胡雅婷，第一作者，研究方向：心肌纤维化的分子机制，E-mail：；单志新，通信作者，研究员，博士生导师，研究方向：非编码RNA与心肌重构，E-mail：第45卷中山大学学报（医学科学版）Abstract：【Objective】To investigate the effect of circSLC8A1_005 on the fibrotic phenotype of cardiac fibroblasts and the potential mechanism involved.【Methods】The effect of adenovirus-mediated overexpression of circSLC8A1_005 on the expression of fibrosis-related genes，collagen type I alpha 1 chain（Col1a1），collagen type alpha 1 chain（Col3a1）and smooth muscle actin alpha 2（Acta2），in mouse cardiac fibroblasts（mCFs）were detected.The proliferation and migration activities of mCFs were detected by EdU and wound-healing assay，respectively.Dual luciferase reporter gene assay was performed to detect the activity of potential internal ribozyme entry site（IRES）in circSLC8A1_005.CircSLC8A1_005-translated protein，SLC8A1-605aa，and its intracellular distribution was identified by Western blot assay.The effect of SLC8A1-605aa protein on transcription activity of Sod2 gene was detected by the dual luciferase reporter gene assay.RNA binding protein immunoprecipitation（RIP）was utilized to verify the interaction between SLC8A1-605aa and superoxide dismutase 2（Sod2）mRNA.Actinomycin D treatment was used to detect the effect of SLC8A1-605aa on Sod2 mRNA stability in mCFs.【Results】An efficient adenovirus-mediated overexpression of circSLC8A1_005 was achieved in mCFs.The enforced expression of circSLC8A1_005 suppressed proliferation and migration of mCFs，and inhibited the expression of fibrosis-related genes in mCFs.The dual luciferase reporter gene assay revealed the activities of 2 IRES in circSLC8A1_005.Results of Western blot assay showed that circSLC8A1_005 could translate protein SLC8A1-605aa with the prospected molecular weight of 70 ku，which is predominantly distributed in the nucleus.Overexpression of the circSLC8A1_005 and SLC8A1-605aa could consistently inhibit the fibrotic phenotype of mCFs.SLC8A1-605aa could up-regulate superoxide dismutase 2（Sod2）expression，but not at the transcriptional level.RIP assay indicated that SLC8A1-605aa could specifically interact with Sod2 mRNA，and the results of actinomycin D assay showed that SLC8A1-605aa could enhance the stability of Sod2 mRNA in mCFs.【Conclusion】CircSLC8A1_005 inhibits the fibrotic phenotype of cardiac fibroblasts via translating SLC8A1-605aa protein，and SLC8A1-605aa may be a potential target for the treatment of myocardial fibrosis.Key words：cardiac fibrosis；circular RNA；circSLC8A1_005；translation；cardiac fibroblastJ SUN Yatsen Univ（Med Sci），2024，45（1）：35-44心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是一种几乎与所有形式的心脏疾病相关的病理变化，主要是由应激诱导的心肌成纤维细胞异常活化和向肌成纤维细胞转化引起，其特点是肌成纤维细胞中细胞外基质过度沉积和胶原蛋白的比例或成分变化，导致心脏重塑，严重将诱发心力衰竭、心肌梗死等多种心血管疾病1-2。近年来研究证实，多种非编码RNA参与调节心肌纤维化的发生过程，并可能成为潜在的抑制心肌纤维化的干预靶点 3-4。环状RNA（circRNAs）是一种共价闭合的单链RNA，由前体mRNA产生，具有序列组成丰富、稳定和保守的特性，并以组织、细胞类型特异性或发育阶段特异性方式表达5。根据所含序列的类型，目前发现的circRNAs序列主要来自宿主基因的外显子，并主要定位于细胞质中6。CircRNAs 具有不同的生物学功能，并往往与其亚细胞定位相关7。CircRNAs可在转录水平调节靶基因，包括亲本基因的转录，也可以作为微小RNA（miRNA）的“分子海绵”来调控其活性，与转录调控元件结合或与蛋白互作来调控基因的转录来参与调节相关疾病进程8。近期研究发现，一些circRNAs包含内核糖体结合位点（internal ribosome entry site，IRES）以帽非依赖性方式发挥蛋白翻译功能9-10。CircSLC8A1_005 是由其宿主基因溶质载体家族8成员1（solute carrier family 8 member1，SLC8A1）的第一个外显子通过反向剪接产生的环形 RNA，全长为 1832 nt。我们前期的circRNA表达谱分析结果显示，circSLC8A1_005在心衰病人心肌标本中表达显著升高，但其对心肌纤维化的调控作用尚不清楚。序列分析结果提示，该circRNA包含一个可能的开放阅读框（open reading frame，ORF）及两个IRES位点。本文旨在利用乳小鼠心肌成纤维细胞（mouse cardiac fibroblasts，mCFs）来研究 circSLC8A1_005 对纤维化表型的调节作用，并明确其是否能够翻译蛋白，并通过翻译的蛋白来发挥对mCFs纤维化表型的调节作用。36第1期胡雅婷，等.CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用1 材料与方法1.1实验动物出生 13 d 的 SPF 级 C57BL/6 乳小鼠（雌雄不限）均由广东省动物中心提供，生产许可证号为SCKK（粤）2013-0034，动物实验伦理审查批号为KY-N-2022-066-01。1.2主要试剂胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）（Gibco）；细胞培养基DMEM/F12和澳洲胎牛血清（Bio Ind）；胶回收试剂盒、RIPA裂解液和NP40裂解液（碧云天）；质粒提取试剂盒（Omega）；BCA蛋白定量试剂盒、IP试剂盒（Thermo）；逆转录试剂盒（Takara）；Trizol裂解液、转染试剂Lipo2000（Invitrogen）；1-型胶原蛋白（Collagen Type Alpha 1，COL1A1）抗体（Invitrogen）；平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin，-SMA）抗体（Abcam）；1-型胶原蛋白（Collagen Type Alpha 1，COL3A1）抗体（Protein Technology）；ANTI-FLAG M2 Affinity Gel（Sigma）；Flag-M2 抗体（Sigma）；ECL化学发光检测试剂盒（Millipore）；放线菌素D（生工有限公司）；核糖核酸外切酶（Ribonuclease R）（广州吉赛生物）；RIP试剂盒（广州伯信生物）。1.3主要方法1.3.1乳小鼠心肌成纤维细胞的分离、培养将刚出生13 d的 SPF级别的 C57BL/6小鼠（雌雄不限）浸入75%乙醇进行消毒处理，医用无菌眼科剪沿腋下剪开，镊子小心取出完整心脏，用预冷的PBS清洗，适当修剪心脏周围多余组织，加入胰蛋白酶-PBS混合液于50 mL离心管中消化16 h，终止消化后巴氏管吹散离心，弃去上清，多次消化重悬后加入到培养瓶中培养，并传代培养至P2代用于后续实验。1.3.2实时荧光定量 RT-qPCR 检测利用 trizol法从乳小鼠心肌成纤维细胞中提取总 RNA，以1.0 g总RNA为模板，使用ReverTra Ace qPCR RT Kit 按照说明书进行逆转录得到cDNA，合成引物用于检测 circSLC8A1_005、Sod2 及纤维化相关基因mRNA 的表达。使用 qTOWER 3G（德国，real time system）检测系统进行定量PCR反应。以2-Ct法计算 circSLC8A1_005 及其他编码基因的表达水平。本文所用RT-qPCR特异引物序列见表1。1.3.3蛋白免疫印迹Western blotPBS清洗后置细胞板于冰上，加入适量RIPA裂解液（含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂）静置 10 min待其裂解充分后刮板，收集细胞悬液离心后取上清。测定蛋白浓度后取15 g蛋白，加入SDS-PAGE Loading Buffer，金属浴中99 变性30 min。通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜。用5%牛奶封闭1 h，根据目的蛋白大小裁下相应膜条，利用特异性抗体 COL1A1（1：5 000）、COL3A1（1：5 000）、flag-M2（1：1 000）-SMA（1：2 500）和 GAPDH（1：5 000），4 孵育过夜，第二天37 孵育二抗1.5 h，最后用ECL印迹检测试剂进行显影。Image J 软件对目的蛋白进行灰度值分析。1.3.4重组腺病毒的制备CircSLC8A1_005序列源于其宿主基因SLC8A1的第1外显子序列。按课题组前期报道的方法，pAd-Track-cmv载体的多克隆位点中定向插入circSLC8A1_005-2flag序列，利用腺病毒骨架质粒 pAd-Easy-I 进行重组，Pac内切酶将其线性化后转入HEK293细胞中包装成重组腺病毒11。根据预测circSLC8A1_005翻译蛋白SLC8A1-605aa序列，合成了其对应的编码碱基序列，并构建其重组腺病毒。1.3.5细胞增殖实验将P2代mCFs均匀接种于confocal 皿中，培养24 h后在mCFs中加入适当剂量的病毒。24 h后换含有EdU增殖试剂盒中试剂A的培养基，孵育4 h，室温固定过夜。完成后弃去，PBS清洗一次，甘氨酸中和后加入0.5%Triton X-100通透，然后加入配好的Apollo染色工作液充分染色30 min，清洗后滴加4滴DAPI染液进行细胞核染色，激光共聚焦显微镜下观察拍照并进行分析。1.3.6细胞划痕实验将重悬好的乳小鼠成纤维细胞接种于6孔细胞板，细胞处理后用枪头垂直进行划痕，PBS缓冲液轻柔冲洗后加入新的培养基，显微镜下分别拍照记录 0 和 24 h 的划痕距离，用Image J软件分析并且计算细胞迁移率。1.3.7RNA结合蛋白免疫沉淀实验准备乳小鼠成纤维细胞铺于10 cm2皿中，稳定培养至密度80%后，rAd-SLC8A1-605aa 进行感染，培养 24 h。使用 RNA 结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation,RIP）试剂盒去除 DNA 后将细胞裂解样品分为SLC8A1-605aa、IgG组，将相应的细 胞 裂 解 液 与 5 g 对 照 IgG 抗 体 或 Flag 抗 体（SLC8A1-605aa与Flag标签融合表达）在4 旋转孵育过夜，随后加入磁珠进行免疫沉淀。提取总37第45卷中山大学学报（医学科学版）RNA用于RT-qPCR检测目的基因的表达。1.3.8双萤光素酶报告基因实验分别构建包含circSLC8A1_005潜在IRES序列及小鼠Sod2基因启动 子 区 的 重 组 萤 光 素 酶 报 告 基 因 质 粒。将HEK293细胞接种于24孔细胞板稳定生长后，使用Lipfectamine 2000将重组萤光素酶报告基因质粒和pRL-TK质粒共转染细胞。24 h后，用Dual-Luciferase Reporter Assay Kit（Promega）测定萤光素酶活性。结果显示为萤火虫萤光强度与海肾萤光强度的比值表示报告基因的相对表达水平。1.3.9放线菌素D实验在乳小鼠心肌成纤维细胞中感染适当剂量 rAd-SLC8A1-605aa，稳定培养24 h后在细胞培养基中加入2 g/mL放线菌素D，进行处理0、4、8、12、24 h，提取总RNA后，通过RT-qPCR分析Sod2 mRNA的稳定性。1.4统计学分析采用 Image J 和 GraphPad Prism9.0.0分析与作图，用 SPSS 21.0 进行统计分析。实验数据用均数标准差表示，当两组间作比较时，采用t检验；当多组间作比较时，采用单因素方差分析；在组间两两作比较时，则用Bonferroni校正的t检验。当P0.05时，则为数据间的差异具有统计学意义。2 结 果2.1CircSLC8A1_005抑制心肌成纤维细胞的纤维化相关基因表达CircSLC8A1_005序列来自于宿主基因SLC8A1的第一外显子，长度为 1 832 碱基（图 1A）。利用制 备 好 的 circSLC8A1_005 腺 病 毒 感 染 mCFs 24 h，RT-qPCR 结果提示该 circRNA 可在 mCFs 中有效过表达（图 1B），DNA 测序结果显示过表达的 circSLC8A1_005具有正确的接头序列（图 1C）。RT-qPCR 结果显示，在过表达 circSLC8A1_005 的mCFs中，心肌纤维化相关基因Col1a1（I型胶原蛋白）、Col3a1（型胶原蛋白）和 Acta2（肌动蛋白 2）的表达显著下调（图 1D）。Western blot 结果显示，过表达 circSLC8A1_005 可显著抑制 mCFs中 COL1A1、COL3A1和-SMA 的表达（图1E）。2.2CircSLC8A1_005抑制心肌成纤维细胞的增殖和迁移EdU实验结果显示，过表达circSLC8A1_005显著抑制mCFs的增殖能力（图2A），而细胞划痕实验显示，过表达circSLC8A1_005可明显抑制mCFs的迁移能力（图 2B），以上结果说明过表达 circSLC8A1_005可有效抑制mCFs的增殖和迁移。2.3CircSLC8A1_005编码蛋白SLC8A1-605aa通过数据库 circBank（http：/ circ_0001742相比，circSLC8A1_005所包含的两个IRES序列具有更显著的介导下游ORF翻译的作用（图3B）。利用腺病毒介导在mCFs中过表达带有Flag标签的融合蛋白SLC8A1-605aa-flag，Western blot 检测结果显示在表1PCR引物序列Table 1The PCR primers sequences GeneCol1a1Col3a1Acta2circSLC8A1_005Sod2Nqo1Txnrd1Sesn2GsrSrxn1GapdhThe primer sequence（5-3）F：CTGGTCCTGTTGGAAGTCGTR：CAGATGCACCTGTTTCTCCAF：CAATGTAAAGAAGTCTCTGAAGR：CAAACAGGGCCAATGTCCACF：CTGTGCTATGTCGCTCTGGAR：ATAGGTGGTTTCGTGGATGCF：TGAGAACATCTGGAGCTCGAR：TAAGAGACTCACAGTAACTAACF：ACGTGAACAATCTCAACGCCR：TCCAGCAACTCTCCTTTGGGF：AAGCTGCAGACCTGGTGATAR：AGAGTACATGGAGCCGCTACF：AAGCTGCAGACCTGGTGATAR：AGAGTACATGGAGCCGCTACF：TTACCCACTGCCACTCTCTGR：CTCTCCTGAAGCTGCCTCATF：GCTCACTGAAGACGAAGCTGR：CATGTGAATGCCAACCACCTF：GGAAGAGGTATGGGGCTACGR：ATGAGCACGGCGATTGGTAF：CAAGAAGGTGGTGAAGCAGGR：CCACCCTGTTGCTGTAGCCProduct（bp）20124019222718419424621116315520038第1期胡雅婷，等.CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用mCFs中表达出约 70 ku大小的特异蛋白（图 3C）。进一步的核质组分蛋白检测证实，表达的SLC8A1-605aa-flag主要分布于mCFs细胞核中（图3D）。2.4CircSLC8A1_005 通过编码蛋白抑制 mCFs中纤维化相关基因表达和mCFs增殖迁移能力分 别 用 circSLC8A1_005-flag 和 SLC8A1-605aa-flag的重组腺病毒感染mCFs，Western blot结果显示，过表达 circSLC8A1_005 和 SLC8A1-605aa可一致地抑制mCFs中纤维化相关蛋白（COL1A1、COL3A1和-SMA）表达（图4A）。EdU和细胞划痕实验显示，过表达circSLC8A1_005和SLC8A1-605aa均可有效抑制mCFs的增殖和迁移（图4B、4C）。2.5SOD2介导SLC8A1-605aa抑制心肌成纤维细胞的纤维化表型本文利用过表达SLC8A1-605aa的mCFs样本进行基因表达的 RNA-seq分析，结果显示过表达SLC8A1-605aa可引起 mCFs中一系列相关基因的差异表达变化（图5A）。差异表达基因的GO分析结果提示包括抗氧化通路在内的多个信号通路的基因表达发生明显改变（本文未示）。RT-qPCR验A:CircSLC8A1_005 sequence derives from exon 1 of SLC8A1 gene.B:Over-expression of circSLC8A1_005 in mCFs detected by RT-qPCR assay;C:Sanger sequencing results showed the correct junction sequence of the exogenously overexpressed circSLC8A1_005 in mCFs.D:MRNA expression of Col1a1,Col3a1 and Acta2 in mCFs with overexpression of circSLC8A1_005,Col1a1:t=4.199,*P=0.017 vs.Vector；Col3a1:t=2.898,*P=0.0442 vs.Vector；Acta2:t=5.374,*P=0.0058 vs.Vector.E:Protein expression of COL1A1,COL3A1 and-SMA in mCFs with overexpression of circSLC8A1_005，COL1A1:t=3.737,*P=0.0202 vs.Vector；COL3A1:t=4.374,*P=0.0119 vs.Vector；-SMA:t=4.500,*P=0.0108 vs.Vector.Data are shown as Mean SD.n=3.图1CircSLC8A1_005可抑制心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达Fig.1CircSLC8A1_005 suppresses fibrosis-related gene expression in cardiac fibroblasts39第45卷中山大学学报（医学科学版）A:Proliferaion activity of mCFs by Edu assay.t=3.811,*P=0.018 9 vs.Vector；B:Migration activity of mCFs by wound healing assay.t=8.751,*P=0.000 9 vs.Vector.Data are shown as Mean SD.n=3.图2CircSLC8A1_005抑制乳小鼠心肌成纤维细胞增殖和迁移Fig.2CircSLC8A1_005 inhibits proliferation and migration of cardiac fibroblastsA:The potential IRES and ORF sequences in circSLC8A1_005.B:The dual-luciferase reporter gene assay was performed to determine IRES activity of circSLC8A1_005.F=24.72,P=0.000 2,*P=0.017 3,*P=0.011 3 vs.circ_0001742-IRES；C:Expression of SLC8A1-605aa in mCFs with over-expression of circSLC8A1_005 by Western blot assay.D:SLC8A1-605aa cellular localization in mCFs with over-expression of circSLC8A1_005 demonstrated by Western blot assay.Data are shown as Mean SD.n=3.图3CircSLC8A1_005编码蛋白的鉴定Fig.3Identification of the protein translated by circSLC8A1_00540第1期胡雅婷，等.CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用A:Protein expression of fibrosis-related genes in mCFs with over-expression of circSLC8A1_005 and SLC8A1-605aa,respectively.COL1A1:F=82.87,P0.000 1,*P=0.000 2,*P0.000 1 vs.Vector；COL3A1:F=37.99,P=0.000 4,*P=0.002 4,*P=0.000 3 vs.Vector；-SMA:F=14.62,P=0.004 9,*P=0.005 1,*P=0.007 3 vs.Vector.B:Proliferaion activity of mCFs by Edu assay.F=77.82,P0.000 1,*P=0.000 3,*P0.000 1 vs.Vector；C:Migration activity of mCFs by wound healing assay.F=39.14,P=0.000 4,*P=0.002 0,*P=0.000 3 vs.Vector.Data are shown as Mean SD.n=3.图4CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制mCFs的纤维化表型Fig.4CircSLC8A1_005 suppresses the fibrotic phenotype of mCFs by encoding protein41第45卷中山大学学报（医学科学版）A:mRNA profiling of mCFs with overexpression of SLC8A1-605aa.The up-regulated and down-regulated genes over 2-fold change were indicated.B:MRNA expression of the antioxidant-related genes detected by RT-qPCR assay,t=3.541,*P=0.007 6 vs.Vector.C:Protein expression of fibrosis-related genes in mCFs by Western blot assay.COL1A1:F=31.02,P0.000 1,*P=0.001 5,*P0.000 1,*P=0.000 2 vs.Vector；COL3A1:F=29.63,P=0.000 1,*P0.000 1,*P=0.000 2,*P=0.004 1 vs.Vector；-SMA:F=33.50,P0.000 1,*P0.000 1,*P0.000 1,*P=0.000 8 vs.Vector；SOD2:F=55.10,P0.000 1,*P=0.003 8,*P0.000 1,*P0.000 1 vs.Vector.D:Identification of the effect of SLC8A1-605aa on Sod2 transcription activation by the dual luciferase reporter gene assay.E:RIP and RT-qPCR assay revealed the interaction between SLC8A1-605aa and Sod2 mRNA,t=3.738,*P=0.020 2 vs.Ig G；F:Sod2 mRNA level was measured by RT-qPCR assay in mCFs exposed to actinomycin D treatment at different time-points.t=2.844,*P=0.046 7 vs.Vector；t=3.450,*P=0.026 0 vs.Vector；t=4.257,*P=0.013 1 vs.Vector；t=3.451,*P=0.026 0 vs.Vector.Data are shown as Mean SD.n=3.图5SOD2介导SLC8A1-605aa发挥抑制mCFs中纤维化相关基因表达的作用Fig.5SOD2 mediates the inhibitory effect of SLC8A1-605aa on fibrosis-related genes expression in mCFs42第1期胡雅婷，等.CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用证结果显示，SLC8A1-605aa可上调mCFs中抗氧化相关基因表达，其中Sod2基因表达上调最显著（图5B）。Western blot结果显示，分别利用腺病毒介导过表达 circSLC8A1_005、SLC8A1-605aa 和 Sod2 可以一致性地抑制mCFs中纤维化相关基因表达（图5C）。双 萤 光 素 酶 报 告 基 因 实 验 提 示 过 表 达SLC8A1-605aa 不能特异激活 Sod2 基因转录表达（图 5D）。RIP 和 RT-qPCR 结果显示，SLC8A1-605aa与Sod2 mRNA具有特异的结合作用（图5E）。进一步的放线菌素D实验结果显示，mCFs中过表达SLC8A1-605aa 可明显增强 Sod2 mRNA 的稳定性（图5F）。3 讨 论心肌结构重塑的关键病理特征之一即心肌纤维化，其组织病理学变化的重要特点是胶原蛋白含量的增加，且比例失调，同时这也是导致许多心血管疾病的重要因素12。本文首先证实过表达circSLC8A1_005可抑制mCFs中纤维化相关基因表达的作用。鉴于心肌纤维化发生中心肌成纤维细胞的增殖和迁移能力增强1，本文的EdU和划痕实验结果证实过表达circSLC8A1_005可明显抑制mCFs的增殖和迁移能力，因此，过表达circSLC8A1_005具有抑制心肌成纤维细胞