关于细菌抗氧化应激反应的研究现状.doc

(完整版)关于细菌抗氧化应激反应的研究现状关于细菌抗氧化应激反应的研究现状姓 名: 王芳 2011 年 3 月 9 日关于细菌抗氧化应激反应的研究现状1.前言蛋白质组（proteome）的概念1由澳大利亚学者Wilkins于1994年提出，指由一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白，也可以说是指细胞或组织或机体全部蛋白质的存在及其活动方式。蛋白质组学(proteomics)是以蛋白质组为研究对象，旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科，其内容包括蛋白质的表达水平、翻译后修饰、结构、功能和相互作用研究等.蛋白质组学的关键研究技术包括双向凝胶电泳（2-DE)2，3、多维液相层析(MDLC）、生物质谱技术（MALDI-TOF/ESI MS）4、蛋白质芯片、生物信息学以及蛋白质免疫印迹技术5等.这些研究技术将随着蛋白质组学及免疫学的发展而不断的改进和完善。而且新发展的研究方法也将进一步完善免疫蛋白质组学的技术体系6.活性氧(reactive oxygen species,ROS）7是一组化学物质，具有还原性和不稳定等特点。在植物细胞正常代谢过程中，氧分子作为重要的电子受体，同时还伴随着部分电子逃逸出氧化还原系统，产生具有毒害作用的高能量活性氧，其中包括超氧阴离子(superoxideanion，O2-)、单线态氧(singlet oxygen, O2）、H2O2、羟自由基(hydroxyl radical，HO-）,还包括脂质过氧化的中间产物LO、LOO、LOOH8。活性氧是一种广谱杀菌剂，可杀灭细菌繁殖体、细菌芽孢、病毒、真菌，对原虫及其卵囊也有很好的杀灭作用，还可破坏细菌毒素、乙肝表面抗原等。活性氧是宿主抗菌作用的有效方式.但是细菌在长期的进化中自然发展出多种对策来抵抗宿主的免疫杀菌作用9，由于目前对于细菌抗氧化应激的研究主要集中在胞浆蛋白，而膜蛋白为细菌与各种氧化物质直接接触，通过对正常条件下和氧化应激条件下培养的大肠杆菌膜蛋白进行蛋白质组学分析来进一步阐明细菌抗氧化的作用机制。2.正文2.1金黄色葡萄球菌的蛋白质组学分析Danchenko等10用LC-MS/MS技术对分别经H2O2处理后的RN6390和UAMS1两种金葡菌菌株蛋白质特征进行分析，发现了157种UAMS1菌株特有的蛋白，其中78种是未知的;有131种RN6390菌株特有的蛋白，其中17种是未知蛋白。这些特有的蛋白将有助于对涉及去氧化毒性和毒力的相关机制进一步研究。Weber等11利用高分辨率的2-DE与MALDI技术分析了金葡菌COL菌株对氧化应激的特点。在指数生长期加入H2O2后，细菌出现生长停滞,甘油醛-3磷酸脱氢酶(Gap)、还原酶(AhpC)和酶(MvaS)的等电点明显改变。由于氧化应激的条件下ATP水平和Gap活性密切相关，因此H2O2引起的Gap活性失活可能是其生长停滞的原因之一。相反,Throup等12用2-DE研究了缺氧时srhSR基因突变株蛋白表达特征，发现srhSR剔除后导致了涉及到能量代谢和其他代谢过程如精氨酸分解、黄嘌呤分解以及细胞形态学的蛋白改变,提示葡萄球菌srhSR体系在应答氧获得性发生改变时能量转移的调节起重要作用。2。2枯草芽孢杆菌的蛋白质组学分析Mostertz等13对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在过氧化物刺激及超氧化物刺激下的应激反应进行了转录组学和蛋白质组学研究，结果发现氧化压力下的反应蛋白可以分为2类:一类是在2种氧化压力下具有相似表达模式的蛋白，如PerR和Fur调控元中的成员；另一类是仅对其中一种刺激敏感的反应蛋白,如SOS调控元中的成员在过氧化物刺激下会表达上调，而参与硫酸盐同化过程及甲硫氨酸生物合成的蛋白仅在超氧化物刺激下诱导表达。在嗜热脂肪芽孢杆菌氧化应激的蛋白质组学研究中，氧化压力能够诱导过氧化物酶的表达发生变化14。此酶在凝胶上的位置不同， 表现为4种异构体形式（Prx、Prx、Prx、Prx )，它们都具有相同的相对分子质量（27000)，却具有不同的等电点（分别是5。0、4。87、4。81和4.79）。H2O2能诱导Prx、Prx、Prx蛋白的丰度增加，却使Prx的丰度减少。另外，延长氧化压力的作用时间不能改变这些异构体的表达水平。因此，这种异构体丰度之间的转化，可能是一种翻译后修饰现象造成的。此外，变异链球菌在氧化压力下,也有69个蛋白的表达量升高,其中15个是特异性感受氧化压力的应激蛋白；另外还有24个蛋白的表达量降低15。2。3革兰阴性菌的蛋白质组学分析Okano16等对革兰阴性菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis）进行了有氧压力下的蛋白质组学分析。虽然牙龈卟啉单胞菌是一种厌氧病原菌, 但仍具有一定的氧耐受能力，因此能够引起慢性牙周炎。为了研究这种耐氧机制,Okano等对比了该菌在有氧压力条件下和厌氧条件下培养的蛋白表达谱.结果发现,在有氧压力情况下很多蛋白的表达受到了影响，特别是HtpG、GroEL、DnaK、AhpC、含有TPR结构域的蛋白，以及引发因子的表达量都持续升高。从这些研究可以看出,厌氧菌与需氧菌的氧化应激研究策略也不相同:对于厌氧培养的细菌，有氧培养的条件就可以激发氧化应激反应；而对于有氧培养的细菌,则需要使用过氧化物来创造氧化压力条件，如本研究通过加H2O2来达到氧化压力作用。3总结以上这些实验基本上是通过对不同条件下培养的细菌进行蛋白质组学分析，发现了一些与氧化应激反应有关的蛋白质，由于这些实验细菌抗氧化应激的研究主要集中在胞浆蛋白,而膜蛋白为细菌与各种氧化物质直接接触,我们可以以这些实验中的材料数据和实验方法作为参考，设计出自己的实验方法。我们的实验方法是:正常及氧化应激条件下对肠致病性大肠杆菌的培养，差速离心法17提取膜蛋白，对已提取的蛋白质做Blue native/SDS 2DE18双向电泳，MALDITOF对差异蛋白进行鉴定分析。通过对正常及氧化应激条件下的差异蛋白质组分析，找到相关蛋白，通过对其功能分析来阐明细菌的应答作用机制。从而找到更好的抗菌方法。 参考文献 fields sProteomics in genomeland（JScience，2001，291：122112242廖翔，应天翼,王衡梁，等考马斯亮蓝染色双向电泳凝胶胶内酶切方法的改进J生物技术通讯，2003，14(6)：3133163 Kathryn S Lilley，David B FriedmanDifference gel electrophoresis DIGEJProteomics，2006，3：347-353 4 Tonge R，Shaw J,Middleton B，et alValidation and diferentialgel offluorescence electrophoresis technologyJProteomics，2001，377-3965 Luke H. Proteomic Analysis Identifies Oxidative Stress Induction by AdaphostinJ. Clin Cancer Res, 2007，13(12)： 36673680.6 潘建义，彭宣宪。 免疫蛋白质组学及疫苗靶位筛选J。 生命的化学，2007,27（2）：1011057 李建善。 活性氧自由基在动物机体内的生物学作用J。 动物医学进展,2006，27（10）:33-368 徐登献. 大肠杆菌过氧化氢酶katE基因的克隆及烟草的遗传转化J. 石河子大学学报,2009,27（2）:174-1779 杨芊. 细菌的氧化应激反应及其基因调控J。 国外医学：微生物分册 , 1998,21（2）:212410 Danchenko SC，Hart M，Beger RComparative proteomics of Staphylococcus aureus and the response to reactive oxygen speciesJFASEB J,2006，20：LB661 Weber H，Engelmann S，Becher D，et a1Oxidative stress triggers thiol oxidation in the glyceraldehydes-3phosphate dehydro-genase of staphylococcus aureusJMol Microbiol，2004，52(1)：13314012 Throup JP，Zappacosta F，Lunsford RD，et alThe srhSR gene pair from Staphy1ococcus aureus：genomic and proteomic approaches to the identification and characterization of gene functionJBiochemistry，2001，40(34）：103921040113 Mostertz J,Scharf C，Hecker M，et alTranscriptome and proteome analysis of Bacillus subtilis gene expression in response to superoxide and peroxide stressJMicrobiology，2004，150（pt 2)：497-499.14 Topanurak S,Sinchaikul S，Phutrakul S,et al.Proteomics viewed on stress response of thermophilic bacterium Bacillus stearothermophilus TLS33JProteomics,2005，5(14）：3722372515 Svensater G,Sjogreen B，Hamilton IRMultiple stress responses in Streptococcus mutans and the induction of general and stressspecific proteinsJMicrobiology,2000，146（Pt 1）：10716 Okano S，Shibata Y,Shiroza T，et alProteomics-based analysis of a counteroxidative stress system in Porphyromonas gingivalis J Proteomics20066(1):251-25517 那宏坤. 差速离心结合蛋白质组学技术研究受镉盐胁迫后的牙鲆肝差异蛋白质J。 分析化学, 2009，37（7): 1019-102418 Grog A,Obermaier C，Boguth G,et alThe current state of twodimensional electrophoresiswith immobilized pH gradient JElectrophoresis，2000，21(6）：103710535