菌种的保藏方法.ppt

3 菌种保藏的原理和方法菌种保藏的原理和方法斜面保藏法穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷冻干燥保藏法液氮保藏法悬液保藏法低温保藏法1.菌种保藏的原理菌种保藏的原理根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使微生物处于代谢不活跃、生长繁殖受抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。菌种保藏的基本措施是寡营养、低温、干燥、真空。2.理想的菌种保藏方法理想的菌种保藏方法应应具具备备的条件的条件(1)经长期保藏后菌种存活健在。(2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)简便、经济，可广泛使用。3.斜面保藏法斜面保藏法是一种短期的保藏方法，广泛适用于细菌、放线菌、酵母、丝状真菌等的短期保藏。操作方法：斜面培养生长良好后，放入4冰箱（视菌种而异），一般可保存3-6个月。缺点：保藏时间短，需经常传代，易变异、污染、培养基干枯、菌体自溶。解决方法：减少培养基营养、密封、减少接菌量。4.穿刺保藏法穿刺保藏法操作：将菌种穿刺接种于半固体培养基上，然后覆盖23mm的液体石蜡，放入冰箱4保藏。一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏12年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。5.浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170下灭菌1-2h的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株23年也应做一次存活试验。6.沙土管干燥保藏法沙土管干燥保藏法适用于产生孢子的丝状真菌和放线菌，或形成芽孢的细菌。原理是造成干燥和寡营养的保藏条件。因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。7.真空冷真空冷冻冻干燥保藏干燥保藏法法 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。8.悬悬液保藏法液保藏法基本原理是寡营养保藏，将微生物悬浮在不含养分的溶液中，如蒸馏水、磷酸缓冲液或生理盐水中。注意密封性。适用于丝状真菌、酵母及肠道科细菌，在10 或室温下保藏比低温效果好。一般可保藏一年或更长。9.低温保藏法低温保藏法(-20)(-20)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞接到试管内，然后贮藏于温度范围在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力12年。10.应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。11.超低温保藏技超低温保藏技术术(-60(-60-80)-80)要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜；4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。12.如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。13.液氮冷液氮冷冻冻保藏技保藏技术术 冷冻保护剂 最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10、二甲亚砜5。所使用的甘油般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。14.基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。15.微生物活力和微生物活力和稳稳定性定性测测定定 在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。16.加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的稳定性。在一个给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测，预测菌种的稳定性。成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)。细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性。17.1 1、斜面冰箱保藏法、斜面冰箱保藏法 4 C ；3-6个月个月2 2、沙土管保藏法、沙土管保藏法 产孢产孢子或芽子或芽孢孢微生物，微生物，1年年3 3、菌、菌丝丝速速冻冻法法 甘油或二甲基甘油或二甲基亚砜亚砜作作为为保保护剂护剂，-20 C 4 4、石蜡油封存法、石蜡油封存法 1年左右年左右5 5、真空冷、真空冷冻冻干燥保藏法干燥保藏法 任何微生物；一般任何微生物；一般5年以上年以上6 6、液氮超低温保藏法、液氮超低温保藏法 -196 C；保；保护剂护剂；保存期；保存期长长18.国内外重要菌种保藏机构国内外重要菌种保藏机构1、ATCC (American Type Culture Collection)美国美国标标准菌种收藏所，准菌种收藏所，马马里里兰兰州，州，罗罗克克维维尔尔市市2、CSH (Cold Spring Harbor Laboratory)冷泉港研究室，冷泉港研究室，美国美国3、IAM (Institute of Applied Microbiology,University of Tokyo)日本日本东东京大学京大学应应用微生物研究所，用微生物研究所，日本日本东东京京4、IFO (Institute for Fermentation,Osaka)发发酵研究所，日本大阪酵研究所，日本大阪19.5、普通微生物菌种保藏管理中心、普通微生物菌种保藏管理中心 （CCGMC）中科院微生物所，北京中科院微生物所，北京6、工、工业业微生物菌种保藏管理中心微生物菌种保藏管理中心 (CICC)轻轻工部食品工部食品发发酵工酵工业业科学研究所，北京科学研究所，北京20.