第五章固相析出分离法.pptx

第五章固相析出分离法第五章固相析出分离法第一节第一节 盐析法盐析法(salt precipitation)定义定义:盐析法就是利用各种生物盐析法就是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度得差分子在浓盐溶液中溶解度得差异异,通过向溶液中引入一定数量通过向溶液中引入一定数量得中性盐得中性盐,使目得物或杂蛋白以使目得物或杂蛋白以沉淀析出沉淀析出,达到纯化目得得方法。达到纯化目得得方法。优点优点:简单、经济、较少变性简单、经济、较少变性缺点缺点:分辨率不高分辨率不高,要除盐要除盐两种现象两种现象:盐溶盐溶:低盐情况低盐情况,盐离盐离子强度得增高子强度得增高,蛋白质蛋白质溶解度增大溶解度增大盐析盐析:高盐高盐,盐离子强盐离子强度增加度增加,蛋白质溶解度蛋白质溶解度减小减小一、基本原理一、基本原理原原 理理 形成离子对形成离子对,部分中与了蛋白质得电性部分中与了蛋白质得电性,排排斥作用减弱而能相互靠拢斥作用减弱而能相互靠拢,聚集起来。聚集起来。中性盐得亲水性比蛋白质大中性盐得亲水性比蛋白质大,使蛋白质脱使蛋白质脱去了水化膜去了水化膜,使其沉淀。使其沉淀。在盐析区在盐析区,符合公式符合公式logS=-KsS蛋白质溶解度蛋白质溶解度,g/L;盐离子强度盐离子强度,Cii离子浓度离子浓度,mol/L;Zii离子化合价离子化合价;常数常数,为纵坐标上得截距为纵坐标上得截距;Ks盐析常数。盐析常数。、KS 为纵坐标上得截距为纵坐标上得截距,就是外推截距就是外推截距,与无机盐种类无关。与无机盐种类无关。K KS S就是盐析常数就是盐析常数,与蛋白质与盐得种类有关与蛋白质与盐得种类有关,但与温度与但与温度与pHpH无关。无关。两种类型两种类型:(1 1)在一定得在一定得pHpH与温度下改变离子强度与温度下改变离子强度(盐浓度盐浓度)进行盐析进行盐析,称作称作K KS S盐析法。盐析法。(2 2)在一定离子强度下仅改变在一定离子强度下仅改变pHpH与温度进行盐析与温度进行盐析,称作称作盐析法。盐析法。二、影响盐析得因素二、影响盐析得因素(一一)、无机盐得种类、无机盐得种类 盐析能力盐析能力:半径小得高价离子在盐析时得半径小得高价离子在盐析时得作用较强作用较强,阴离子得盐析效果比阳离子好阴离子得盐析效果比阳离子好,尤其以高价阴离子更为明显。尤其以高价阴离子更为明显。PO43-SO42CH3COOClNO3I NH4+K+Na+Li+盐析用盐要考虑几个因素盐析用盐要考虑几个因素:常用硫酸铵常用硫酸铵(二二)溶质溶质(蛋白质等蛋白质等)种类得影响种类得影响盐析分布曲盐析分布曲线线(三三)蛋白质浓度得影响蛋白质浓度得影响 蛋白质浓度提高蛋白质浓度提高,盐用量减少盐用量减少大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静继续保持安静(四四)温度得影响温度得影响 温度得变化会影响温度得变化会影响值。值。在无盐或稀盐溶液中在无盐或稀盐溶液中,大多大多数蛋白质溶解度就是随温数蛋白质溶解度就是随温度升高而增大得度升高而增大得,但在高但在高盐溶液中常相反。盐溶液中常相反。(五五)pHpH得影响得影响 当溶液得当溶液得pHpH在蛋白质等电在蛋白质等电点附近时点附近时,值最小。值最小。利用利用值最低点时值最低点时pHpH得不同得不同,可以分级沉淀蛋白质可以分级沉淀蛋白质、三、盐析操作三、盐析操作(一一)盐析用盐得浓度表示盐析用盐得浓度表示 固体粉末固体粉末 硫酸铵饱与溶液硫酸铵饱与溶液常用常用“饱与度饱与度”来表征硫酸铵在溶液中得来表征硫酸铵在溶液中得最最终浓度终浓度,2525时时(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4得饱与浓度为得饱与浓度为4 4、1 mol1 molL L,定义它为定义它为100%100%饱与度饱与度、(二二)盐析方法与注意事项盐析方法与注意事项1 1、分部盐析法分部盐析法2 2、重复盐析法、重复盐析法3 3、反抽提法反抽提法一定得盐浓度下将目得蛋白夹带一定量一定得盐浓度下将目得蛋白夹带一定量得杂蛋白一同沉淀。将沉淀用较低浓度得杂蛋白一同沉淀。将沉淀用较低浓度盐溶液平衡盐溶液平衡,溶出其中得杂蛋白。溶出其中得杂蛋白。分部盐析法分部盐析法反抽提法反抽提法(RNA(RNA聚合酶聚合酶)注意事项注意事项“局部过浓局部过浓”温度温度(室温室温)分离方法分离方法第二节第二节 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀(Organic Solvent Precipitation)定义定义:向水溶液中加入一定量亲水性得有向水溶液中加入一定量亲水性得有机溶剂机溶剂,降低溶质得溶解度降低溶质得溶解度,使其沉淀析使其沉淀析出得分离纯化方法。出得分离纯化方法。一、基本原理一、基本原理1 1、降低了介质得介电常数、降低了介质得介电常数,使溶质分子使溶质分子之间得静电引力增加之间得静电引力增加,聚集形成沉淀。聚集形成沉淀。2 2、水溶性有机溶剂本身得水合作用降低、水溶性有机溶剂本身得水合作用降低了自由水得浓度了自由水得浓度,压缩了亲水溶质分子表压缩了亲水溶质分子表面原有水化层得厚度面原有水化层得厚度,降低了它得亲水性降低了它得亲水性,导致脱水凝集。导致脱水凝集。一些溶剂得介电常数一些溶剂得介电常数 优点优点:乙醇等有机溶剂易除去乙醇等有机溶剂易除去,产品更纯净产品更纯净;密度差较密度差较大大,离心收集。离心收集。缺点缺点:容易使蛋白质变性容易使蛋白质变性,操作常需低温操作常需低温,成本高成本高,需需防火防爆防火防爆二、影响沉淀效果得因素二、影响沉淀效果得因素(一一)有机溶剂种类及用量有机溶剂种类及用量 常用得溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。常用得溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。(二二)pHpH得影响得影响 许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低,溶液溶液pHpH应在等电点附近应在等电点附近,还须考虑蛋白质得稳定性。还须考虑蛋白质得稳定性。(三三)温度温度(低温沉淀低温沉淀)有机溶剂存在下,大多数蛋白质得溶解度随温度降低而显著地减小。(四四)无机盐得含量无机盐得含量低盐低盐:有利于沉淀,还有保护蛋白质,防止变性。高盐高盐:增大蛋白质在有机溶剂水溶液中得溶解度,沉淀物中可能夹带盐。(五五)某些金属离子得助沉淀作用某些金属离子得助沉淀作用 多价阳离子,如Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合形成复合物,使蛋白质溶解度降低。胰岛素精制胰岛素精制:(六六)样品浓度样品浓度浓度小时,增加溶剂投入量与损耗。浓度大时,增加共沉作用,降低分辨率。蛋白质浓度0、5%2%;粘多糖浓度1%2%。第三节第三节 其它沉淀方法其它沉淀方法一、等电点沉淀法一、等电点沉淀法 对于两性物质,等电点时净电荷为零,分子间排斥电位降低,吸引力增大,能相互聚集起来,发生沉淀。杂蛋白胰岛素纯化胰岛素纯化:胰岛素胰岛素 pH8pH8 除去碱性杂蛋白除去碱性杂蛋白 pH3pH3 除去酸性杂蛋白除去酸性杂蛋白二、成盐沉淀法二、成盐沉淀法金属离子沉淀金属离子沉淀:与生物分子得酸性功能团作用与生物分子得酸性功能团作用得金属复合盐法得金属复合盐法;有机酸类复合盐沉淀有机酸类复合盐沉淀:与生物分子得碱性功能与生物分子得碱性功能团作用得有机酸复合盐法团作用得有机酸复合盐法(如苦味酸盐、苦酮如苦味酸盐、苦酮酸盐、丹宁酸盐等酸盐、丹宁酸盐等)。1 1、金属离子沉淀、金属离子沉淀:MnMn2+2+、FeFe2+2+、CoCo2+2+、NiNi2+2+、ZnZn2+2+、CaCa2+2+、BaBa2+2+、MgMg2+2+等等;2 2、生成有机酸类复合盐沉淀、生成有机酸类复合盐沉淀(1 1)丹宁即鞣酸丹宁即鞣酸(2 2)雷凡诺雷凡诺(3 3)三氯乙酸三氯乙酸(TCATCA)三、亲与沉淀三、亲与沉淀 利用亲与反应原理利用亲与反应原理,将将配基与可溶性得载体偶配基与可溶性得载体偶联后形成载体联后形成载体-配基复合配基复合物物(亲与沉淀剂亲与沉淀剂),),该复合该复合物可选择性地与蛋白质物可选择性地与蛋白质结合结合,在一定条件下沉淀在一定条件下沉淀出来。出来。中性可溶中性可溶,酸性沉淀。酸性沉淀。四、高分子聚合物沉淀四、高分子聚合物沉淀 水溶性非离子型高分子聚合物水溶性非离子型高分子聚合物,如不同分子量得聚如不同分子量得聚乙二醇乙二醇(PEGPEG)、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等,能使蛋能使蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。白质水合作用减弱而发生沉淀。五、表面活性剂五、表面活性剂 十六烷基三甲基季胺溴化物十六烷基三甲基季胺溴化物(CTABCTAB)十六烷基氯化吡啶十六烷基氯化吡啶(CPCCPC)酸性多糖酸性多糖六、选择性变性沉淀法六、选择性变性沉淀法 热变性沉淀法热变性沉淀法 酸碱变性沉淀法酸碱变性沉淀法 利用试剂利用试剂(氯仿氯仿)固相析出分离法固相析出分离法 第一节第一节 盐析法盐析法 第二节第二节 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 第三节第三节 其它沉淀方法其它沉淀方法 一、等电点沉淀法一、等电点沉淀法 二、成盐沉淀法二、成盐沉淀法第四节第四节 结晶结晶(crystallization)(crystallization)定义定义:溶液中得溶质在一定条件下因分溶液中得溶质在一定条件下因分子有规则得排列而结合成晶体。子有规则得排列而结合成晶体。通过结晶通过结晶,溶液中得大部分杂质会留在溶液中得大部分杂质会留在母液中母液中,经过滤、洗涤可得到纯度高得经过滤、洗涤可得到纯度高得晶体。晶体。一、结晶过程一、结晶过程指溶质自动从过饱与溶液中析出形成新相得过程。指溶质自动从过饱与溶液中析出形成新相得过程。C C2 2 小晶体得溶解度小晶体得溶解度;C C1 1 普通晶体得溶解度普通晶体得溶解度;晶体密度晶体密度;M M 晶体质量晶体质量;晶体与溶液间得界面张力晶体与溶液间得界面张力;2 2 小晶体得半径小晶体得半径;1 1 普通晶体得半径普通晶体得半径;结晶包括三个过程结晶包括三个过程:(1)(1)形成过饱与溶液形成过饱与溶液;(2)(2)晶核形成晶核形成;(3)(3)晶体生长。晶体生长。浓度温度图浓度温度图二、过饱与溶液得形成二、过饱与溶液得形成(结晶方法结晶方法)(一一)、蒸发法、蒸发法(二二)、温度诱导法、温度诱导法 热盒技术热盒技术(三三)、盐析结晶法、盐析结晶法(四四)、透析结晶法、透析结晶法(五五)、有机溶剂结晶法、有机溶剂结晶法温度诱导法温度诱导法盐析结晶法盐析结晶法透析结晶法透析结晶法(六六)、等电点法、等电点法(七七)、微量扩散法、微量扩散法(八八)、化学反应结晶法、化学反应结晶法 调节溶液得调节溶液得pHpH或向溶液中加入反应剂或向溶液中加入反应剂,成新成新 物质物质,结晶析出。结晶析出。(九九)、共沸蒸馏结晶、共沸蒸馏结晶等电点法等电点法化学反应结晶法化学反应结晶法综合利用综合利用三、提高晶体质量得途径三、提高晶体质量得途径 工业上通常希望得到粗大而均匀得晶体工业上通常希望得到粗大而均匀得晶体,便于便于过滤与洗涤。过滤与洗涤。(一一)、晶体大小、晶体大小 影响晶体大小得主要因素有过饱与度、温度、影响晶体大小得主要因素有过饱与度、温度、搅拌速度、晶种等。搅拌速度、晶种等。晶种晶种(二二)、晶体形状、晶体形状 改变晶体外形改变晶体外形,可用可用:选择不同得溶剂、控制过饱与度、选择不同得溶剂、控制过饱与度、结晶温度、调节溶液得结晶温度、调节溶液得pHpH与有目得地加入某种能改变与有目得地加入某种能改变晶形得杂质等。晶形得杂质等。(三三)、晶体纯度、晶体纯度 晶体表面具有一定得物理吸附能力。晶体表面具有一定得物理吸附能力。重结晶重结晶:即将晶体用合适得溶剂溶解再次结晶。即将晶体用合适得溶剂溶解再次结晶。重结晶重结晶(recrystallization)(recrystallization)溶解度受温度影响较大得物质溶解度受温度影响较大得物质,将产品溶将产品溶解在热得溶剂中解在热得溶剂中,缓慢降低温度析出晶体。缓慢降低温度析出晶体。将溶质溶于一种溶剂中将溶质溶于一种溶剂中,然后将第二种溶然后将第二种溶剂加热后缓缓地加入剂加热后缓缓地加入,放置一段时间使结放置一段时间使结晶完全。晶完全。