DB3715∕T 11-2022 德州驴鲜精生产与保存技术规程(聊城市).pdf

ICS 65.020.30 CCS B 43 3715聊城市地方标准 DB 3715/T 112022 德州驴鲜精生产与保存技术规程 The technical protocol of production and preservation for fresh semen of dezhou donkey 2022-09-20 发布 2022-10-20 实施 聊城市市场监督管理局 发 布 DB 3715/T 112022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由聊城市农业农村局提出、组织实施并归口。本文件起草单位：聊城大学、东阿阿胶股份有限公司、中润牧业（山东）有限公司、聊城市农业技术推广服务中心、聊城市东昌府区畜牧兽医事业发展中心。本文件主要起草人：朱明霞、刘桂芹、尹桂军、王长法、韩营、赵志超、吴帅帅、刘冰、李敏、嵇传良、于杰、李玉华、王守山、刘文强、王涛、王延涛、仲旭琴、张云良、于学山、徐冰昕、申铜飞、侯国生。DB 3715/T 112022 1 德州驴鲜精生产与保存技术规程 1 范围 本文件规定了德州驴采精前准备、精液采集、精液品质检查、合格精液处理、保存以及所需仪器设备和耗材。本文件适用于德州驴鲜精生产与保存。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 24877-2010 德州驴 NY/T 1234-2018 牛冷冻精液生产技术规程 NY/T 3796-2020 马和驴冷冻精液 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 原精 raw semen 采集后未经离心、稀释的精液。3.2 鲜精 fresh semen 原精经离心及稀释处理后经检测符合保存条件的精液。3.3 精液稀释液 semen diluent 保护并延长精子存活时间、增加精液容量的液体。3.4 精液离心液 semen centrifugatation 保护精子在离心时不受损伤并延长存活时间的液体。3.5 DB 3715/T 112022 2 稀释比例 dilution rate 原精与稀释液的体积比。4 基本要求 4.1 供精公驴 采精训练成功的德州驴公驴。4.2 台畜 台畜应选择健壮、性情温顺、无疫病的发情母驴或者仿生假台畜。4.3 采精频率 每周23次。在采精过程中发现精子活力下降、精子密度降低、畸形率增加或公驴性欲下降时，应控制采精频率并查找原因。4.4 采精时间 以3月上旬7月上旬和8月下旬11月上旬为宜。4.5 采精场所 采精场所要保持宽敞安静、清洁干燥、空气流动平缓顺畅，地面防滑，有防护栏等安全保护措施。4.6 处理室 设置有精液质检区、平衡稀释区、分装区、鲜精保存区，室内温度22 25，避免光线直射。4.7 器材设备 设备运转正常，依据材质特点对器材做好清洗、消毒、烘干、保存处理，确保使用前洁净、干燥且与精液等温。4.8 工作人员 上岗前须经专业化培训，工作时着洁净工装，严格按照有关规章制度进行生产活动。5 器械清洗消毒 按照NY/T 1234-2018的附录A执行。6 离心液、稀释液配制 6.1 离心液、保存液配方 参见附录 A。6.2 离心液、保存液配制方法 DB 3715/T 112022 3 参见附录 A。7 采精 7.1 将待采精公驴牵到采精室内的台驴处，阻止其爬胯 23 次，使其阴茎充分勃起。7.2 将公驴阴茎用 38 左右温水清洗干净，用洁净棉布或无菌纸巾擦拭干净或自然晾干。7.3 将假阴道前段 1/3 处涂抹润滑剂，并依据公驴阴茎尺寸适当调整假阴道内部压力。7.4 采精员右手持假阴道，假阴道外口端斜朝向地面，站在公驴右前侧。待公驴爬跨时，左手轻扳阴茎，并与持假阴道的右手配合，迅速将阴茎引入假阴道中，公驴阴茎抽动并贴紧台驴臂部，尾根有节奏摆动即开始射精。完成射精后，公驴随即而跳下。此时，采精员右手紧握假阴道随公驴阴茎顺势而下，待公驴前肢落地时缓慢把假阴道脱出，同时，立即将假阴道外口向上抬起，打开气孔放水，使精液尽快流入集精杯内。然后小心地取下集精杯，迅速转移至精液处理室。安装好的假阴道只能使用一次，不得重复使用。8 精液处理 8.1 准备 接触精液的无菌器皿（包括离心、稀释用玻璃及塑料器材）应提前 2 h 放在 37 恒温箱中，离心液提前 2 h 放在 32 37 恒温水浴箱中备用，稀释液置于室温备用，所需仪器和用品参见附录 B。8.2 原精品质 原精液品质应符合表 1 的规定。表1 原精质量标准 项目 指标 颜色 乳（灰）白色、淡黄色 气味 无恶臭，略带腥味 射精量/mL 40 活率/%80 活力/%70 密度/（108个/mL）1 畸形率/%20 8.3 原精测定 精液外观、采精量、精子密度、精子活率和精子活力测定参照 NY/T 1234-2018 的 7.27.5 执行，精子畸形率测定参照 NY/T 3796-2020。8.4 记录 原精品质检测登记表参见附录 E。8.5 原精稀释 DB 3715/T 112022 4 8.5.1 精液采集后应尽快稀释，放置时间不超过 10 min。8.5.2 向原精液中按 1:1 的比例加入离心液，高倍稀释时，先低倍稀释（1:11:2），30 s 后再加入余下的稀释液。8.5.3 稀释好的精液在 22 条件下避光放置 10 min 后，按 1850 rpm/min（用 g/min 表示离心参数）离心 10min15 min。去除上清液，将各离心管中的粥状精液用保存液进行最后稀释。精液稀释按两步法进行：先加入最终稀释量的 1/4，经初步稀释的精液先在 22 条件下避光放置 10 min，然后，加入剩余的稀释液。8.5.4 稀释液总量以体积 V 计，数值以 mL 表示，按式（1）计算：V(mL)=Vm.X (1)式中：V0 采精量 mL；C 精子密度，单位为 108个每毫升（108个/mL）；m 精子快速前进活力%；0.7 精液离心后精子的回收系数；s 每个分装的精子数，单位为 108个/头份；V1 每头份的体积，单位为毫升（mL）9 精液分装 9.1 精液分装采用瓶装或者管装。9.2 装精液用的瓶或管选用对精子无毒且灭菌的一次性塑料制品。9.3 精液分装后，应将包装瓶或管中的空气排空，然后密封。9.4 标明公驴号、生产日期、生产单位和有效保存时间。10 精液保存 10.1 盛放精液的包装瓶或袋用 12 层15 层纱布（或干毛巾）包严，直接放入 4恒温箱内保存。10.2 保存的精液应每隔 12 h 摇动 1 次并作记录，摇动时应轻缓均匀。10.3 稀释后的精液应在 2 d 内用完，超过保质期的精液不能使用。10.4 每批精液应留样备查，同批号的精液在保质期内应抽样检查并记录，种公驴低温精液保存登记表见附录 D。DB 3715/T 112022 5 A A 附录A （资料性）离心液、保存液配方及配制方法 A.1 精液离心液 A 液配方成份 表A.1 离心液 A 液配方（总体积为 100ml）成份 含量 棉子糖 0.300g 乳糖 0.300g 葡萄糖 5.000g 柠檬酸钠 0.060g 柠檬酸钾 0.080g HEPES 0.952g 青霉素 15 万单位 链霉素 15 万单位 超纯水 100mL A.2 精液离心液配制方法 A.2.1 A液：用校准的电子天平依次称取所需药品，用灭菌超纯水定容至100mL，配置完成后经0.22 m滤器过滤除菌，4 保存，保存时间不超过14 d。A.2.2 B液：用电子天平称取6g脱脂奶粉，溶解定容至100 mL，115 高压灭菌10 min，冷却至室温，放冰箱4 保存备用，保存时间不超过14 d。A.2.3 A液B液1:1混合即为精液离心液。A.3 精液保存液配方及配制方法 A.3.1 选取新鲜无疫病鸡蛋，用75%酒精进行表面消毒，待酒精挥发完毕后抽取内部卵黄；A.3.2 卵黄与离心液1:4混合，2800 rpm/min离心1 h，去除沉淀，所得混合液为C液。A.3.3 C液：离心液=1:31:7混合，得精液保存液，4 保存，保存时间不超过14 d。DB 3715/T 112022 6 B B 附录B （资料性）驴精液质量检测主要仪器设备及耗材 表B.1 精液处理室配置仪器和用品 主要仪器耗材 用途 100mL 量筒、三角玻璃漏斗、高压灭菌医用纱布 射精量检测 显微成像装置或 CASA、恒温水浴锅、5.0 mL 试管、100 mL量筒、载玻片、盖玻片、移液枪。活力/活率检测 精子密度仪、比色皿、5 mL 移液枪、移液枪 密度测定 离心机、车载冰箱、5mL 移液枪、移液枪、50 mL试管 原精离心处理 4平衡柜、储精瓶/储精管、纱布/棉布 精液保存 DB 3715/T 112022 7 C C 附录C （资料性）精子畸形率检测 C.1 抹片 取稀释后精液一小滴，滴于洁净载玻片（B）一端，用另一边缘光滑的盖玻片（A）与有样品的载玻片呈 35夹角，将样品均匀地涂布于载玻片上，自然风干，每样品制作二个抹片。图C.1 抹片示意图 C.2 固定 在已风干的抹片上滴上 1.0 mL2.0 mL 中性福尔马林（浓度 3.2%）固定液（也可将风干后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把固定液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触固定液），固定 15 min 后用清水缓缓冲去固定液，吹干或自然风干。C.3 染色 将固定好后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触染液，染色 1.5 h 后用清水缓缓冲去染液，晾干待检。C.4 镜检 将制备好的抹片在显微镜（400 X600 X）下观察，每个抹片观察 200 个以上的精子（分左、右二个区），取二片的平均值，二片的变异系数不得大于 20%，若超过应重新制片。C.5 计算 精子畸形率（%）（畸形精子数/精子总数）100%。DB 3715/T 112022 8 附 录 D（资料性）精液品质检测登记表 表 D.1 精液品质检测登记表 驴号 品种 日期 采精员 射精量（mL）密度（亿/mL）活力（%）活率（%）畸形率（%）菌落数（CFU/mL）稀释量（mL）稀释后活力（%）分装份数 24h 活力（%）48h 活力（%）记录员