DB65_T 3800-2015 马流产沙门氏菌微量凝集检验方法(新疆维吾尔自治区).pdf

L.ICS 11.220 B 41 新疆维吾尔自，.J口DB65 区地方标准DB 65/T3800-2015 马流产沙门氏菌微量凝集检验方法Protocol of micro-agglutination detection of antibody of Salmonella abortus equi in equme serur口2015-11-20发布2015-12-30实施新疆维吾尔自治区质量技术监督局发布D865/T3800-2015 目IJJ=I 本标准依据GB/T1.1-2009 标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写的要求编制。本标准由新疆农业大学提出。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。本标准起草单位:新疆农业大学，昭苏县畜牧兽医站。本标准主要起草人:苏艳，杨康，李海，包拉提吾木尔别克，邓海峰，冉多良，祁居中，马玉辉。I DB65/T3800-2015 马流产沙门氏菌微量;疑集检验方法1 范围本标准规定了马流产主j、门民菌的微量凝集检验方法的术语和定义、仪器、设备、试剂、检验方法、结果判定和判定结果。本标准适用于马血清中马流产沙门氏菌的检验。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1 马流产沙门氏菌salmonella abortus equi 一类革兰氏阴性杆菌，只侵害怀孕马属动物，能引起马属动物的急性和慢性感染，被感染的马属动物表现为娃振母马流产、早产、死胎或继发子宫炎，对公马致鬓甲瘦或皇丸炎，对幼驹致关节肿大、下病症状。2.2 微量凝集反应micro-agglutination马血清中的凝集素与抗原在微量反应板中进行的凝集反应。马感染马流产沙门氏菌后导致血掖或血清中马流产沙门民菌特异的凝集素水平升高，该凝集素可与抗原发生凝集，根据马血清中的凝集素与抗原的凝集价可确定马是否感染该病。3 仪器、设备和试剂3.1 仪器和设备天平(量程2100g，感量O.Olg)、恒温培养箱、微量凝集板专用震荡器、8道可调微量移液器(10L300L)、96子LU型板。3.2 试剂3.2.1 抗原从专业部门购置，使用时按说明书稀释倍数稀释。3.2.2 标准阳性血清保存有效期以内，供诊断时做阳性对照。3.2.3标准阴性血清l D865/T3800-2015 保存有效期以内，对马流产沙门氏菌抗原无凝集反应。3.2.4 被检血清对被检马匹按常规方法静脉采血液3mL5mL并分离血清，冷藏(2C8C)保存12天备用，被检血清不溶血或轻微搭血，未变质。4检验方法4.1 抗原工作液的稀释将抗原原液充分振摇泪匀，根据用量用O.5%的石炭酸生理盐水作1:20倍稀释备用。0.5%石炭酸生理盐水配制(分别称取O.85g NaCl(分析纯)和O.50g石炭酸(分析纯)，置入器皿中，加入100mL蒸馆水，溶解后过滤，高压灭菌。4.2 被检血清的稀释将被检血清用O.5%的石炭酸生理盐水作1:5，1:10，1:20，1:40，1:80的倍比稀释，96孔U型板第1孔中加入石炭酸生理盐水50L，第2，3,4,5孔各加石炭酸生理盐水30L，用移液枪吸取被检血清10L加入第1孔中混合均匀，然后吸取30L加入第2孔中，充分混合均匀，然后由第2孔中吸取30L加入第3孔中，然后依次类推稀释到第5孔中，最后将第5孔中多余的30L液体吸出弃去。4.3 对照标准阴性、阳性血清的稀释方法同4.1。4.4加抗原工作液从上述稀释完毕的血清(被检血清，标准阴性血清，标准阳性血清)的第1孔开始，每孔各加入1:20的抗原30L充分振荡混匀o4.5 抗原对照另选一孔空白孔，加入石炭酸生理盐水30L，再加入工作浓度的标准抗原30L混匀。4.6孵育将实验孔和对照孔于37C恒温箱孵育2h后取出观察结果，具体操作见表1。表1马流产沙门氏菌病微量;疑集试验操作方法力日样孔号血清稀释倍数O.5%石炭酸生理盐水(L)被检血清(L)1人J lllIT-i nU 唱EA唱EA1:20 O 2 3|4 I|1:40 5 空白对照60 2 D865/T3800-2015 O.5%石炭酸生理盐 3J:飞30 60 水(L)标准阳性血清对照、(L)10 30 30 30(弃掉)0.5%石炭酸生理盐O303:J四人30 60 71(L)标准阴性血清对照(L)10 30 30-30.,30 30(弃掉)1:20抗原(L)30 30 30 30 30 30 血清最终稀释倍数1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 凝集条件置3TC恒温箱孵育2h5 结果判定5.1 标准对照试验检查5.1.1 标准阳性血清对照管孔底有多量紧密且边缘整齐或不整齐的的凝集物，上部液体完全渣清透明(即100%菌体发生凝集),振摇后，管底沉淀呈颗粒状分布于液体中。5.1.2 标准阴性血清对照管孔底无任何凝集，液体完全混浊。5.1.3 抗原对照管孔底无任何凝集，液体完全混浊。5.1.4 空自对照管孔底无任何凝集，液体完全橙清。5.2疑集度标准5.2.1 100%菌体发生凝集孔底有多量紧密且边缘整齐或不整齐的的凝集物，上部液体完全澄清透明，振摇后，管底沉淀呈颗粒状分布于液体中。用+表示。5.2.2 75%菌体发生凝集孔底有多量紧密且边缘整齐或不整齐的的凝集物，上部液体稍泪浊。用+表示。5.2.3 50%菌体发生凝集孔底有中等量沉淀，呈颗粒状，液体呈中等程度混浊，沉淀易摇碎。用+表示。5.2.4 25%菌体发生;疑集3 0865/T3800一2015孔底有少量沉淀，颗粒微细，液体呈混浊。用+表示。5.2.5 凝聚反应阴性孔底无任何凝集，液体完全混浊。用一表示。6 判定结果6.1 血清最终稀释倍数为1:40，出现十+及以上凝集反应者，判定为阳性反应。6.2 血清最终稀释倍数为1:20，出现+及以上凝集反应者，判定为可疑反应。6.3 血清最终稀释倍数为1:20，出现+及以下凝集反应者判定为阴性反应。6.4 对初检为可疑的马匹，间隔4周按照本规程复检，复检结果为阳性或可疑者，判定为阳性马:复检结果为阴性者，再复检1次，连续2次复检结果为阴性且无临床症状者判定为阴性马。4