第十一章植物离体无性繁殖.doc

个人收集整理 勿做商业用途第十一章 植物离体无性繁殖1植物离体无性繁殖的概念和特点植物有两种基本生殖方式：有性生殖和无性生殖.有性生殖是经过雌、雄性细胞融合而发育成合子胚或种子，并用种子繁殖后代的，如小麦、水稻、玉米等的繁殖。无性生殖是不经过雌、雄性细胞融合而直接用营养体细胞繁殖后代，如甘蔗、甘薯、土豆等的繁殖。由于很多的植物是高度杂合的，如大多数果树和观赏植物、甘蔗、甘薯、马铃薯等,因此它们的种子后代不可能与原种完全相同.只有由无性繁殖产生的植株,在遗传上才能与其亲本植物完全相同，从而可使品种的特性代代相传。一个品种通过无性繁殖可产生在遗传上等同的多个拷贝，其中由一个个体通过无性繁殖产生的一个群体称为一个无性系(克隆)。在自然界中，无性繁殖的途径有二种:一是无融合生殖,即不经过减数分裂和受精而形成种子；二是营养繁殖，即由母株的营养体部分再生出新的植株。无融合生殖是指被子植物未经受精的卵或胚珠内某些细胞直接发育成胚的现象。它不经过雌、雄性细胞融合而直接由营养体细胞或卵细胞发育成无性胚或无性种子。包括:（1）孤雌生殖。卵细胞不经受精直接发育成胚的现象。孤雌生殖有两种类型：一种是由经过减数分裂的胚囊中的单倍体卵细胞发育成胚，这样的胚长成的植物体为单倍体，不能产生后代。这种类型在自然界罕见。另一种是由未经减数分裂的胚囊中的二倍体卵细胞发育成胚.如蒲公英。（2）无配子生殖。由胚囊内卵细胞以外的非生殖性细胞,如助细胞、反足细胞或极核等直接发育成胚的现象。见于韭、含羞草、鸢尾等植物。（3）无孢子生殖.由珠心或珠被细胞直接发育成胚的现象。见于柑桔属、高粱属等植物。由于无融合生殖只发生在少数几个物种,因此,人们一直采用营养繁殖的方法对入选品种进行无性繁殖。有些栽培植物，例如香蕉、葡萄、无花果、矮牵牛和菊花等的某些品种,很少产生或不产生有生活力的种子，所以营养繁殖是惟一的繁殖方法。作为植物营养繁殖的一个新手段，植物组织培养技术现正日益普及。利用植物组织培养技术,在无菌条件下对外植体进行离体培养,使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法称为植物离体无性繁殖(propagation in vitro）。植物离体无性繁殖又称植物快繁或微繁(micropropagation），它是植物组织培养技术在农业生产中应用最广泛、产生经济效益最大的研究领域，涉及的植物种类繁多，技术日益成熟并程序化，繁殖速度突破了植物自然繁殖的界限，成就了工厂化育苗的梦想。植物快繁与传统营养繁殖(vegetative propagation）相比,其特点表现在：繁殖效率高。由于不受季节和灾害性气候的影响，材料可周年繁殖。生长速度快，材料能以几何级数增殖。培养条件可控性强。培养材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下生长，便于对各种环境条件进行调控。占用空间小。一间30m2的培养室可同时存放1万多个培养瓶,培育数十万株苗木。管理方便,利于自动化控制。培养材料在人为环境中生长，省去了田问栽培的一些繁杂劳动,并可利用仪器进行自动化控制,便于工厂化生产。便于种质保存和交换。通过抑制生长或超低温贮存的方法，使培养材料长期保存，并保持其生活力,既节约了人力、物力和土地，还防止了有害病虫的传播，更便于种质资源的交换和转移。2植物快繁的器官形成方式 植物种类、外植体类型及培养基组成等都影响着接种材料的生长、分化和再生，使外植体的器官形成方式表现出一定的差异。根据器官形成方式的不同,将植物器官的再生分为五种类型，即短枝发生型、丛生芽发生型、不定芽发生型、胚状体发生型和原球茎发生型。2.1短枝发生型 短枝发生型是指外植体携带的带叶茎段，在适宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段,继代再成苗的繁殖方法。该方法与田间枝条的扦插繁殖方法类似,故又称为微型扦插。能一次成苗，遗传性状稳定，培养过程简单，移栽成活率高。许多花卉、葡萄、马铃薯等试管苗的繁殖常用此方法.2。2丛生芽发生型丛生芽发生型是指使外植体携带的顶芽或腋芽在适宜培养环境中可以不断发生腋芽而呈丛生状芽，将单个芽转人生根培养基中，诱导生根成苗的繁殖方法。携带侧芽和(或）茎尖的外植体在含有外源细胞分裂素的培养基中，可促使顶芽或侧芽萌动，形成微型的多枝多芽的小灌木丛状结构。将丛生苗分割成带芽茎段，继代培养，重复芽苗增殖培养，可获得大量无根小苗。无根小苗转移到生根培养基后，经培养得到完整小植株。2.3不定芽发生型 凡是在叶腋或茎尘以外任何其它地方所形成的芽统称为不定芽.严格地说，由愈伤组织分化形成的茎芽也应当视为不定芽。不定芽发生型(adventitous bud formation)是指外植体在适宜培养基和培养条件下,经过脱分化形成愈伤组织，然后经过再分化诱导愈伤组织产生不定芽，或外植体不形成愈伤组织而直接从其表面形成不定芽，将芽苗转移到生根培养中,经培养获得完整植株的繁殖方法。从愈伤组织途径再生不定芽的方式称为器官发生型，而将外植体直接再生不定芽的方式称为器官型。以不定芽发生型快繁的植物，外植体的类型可涉及多种器官，如茎段、叶、根、花组织等.对于植物的无性繁殖而言,由离体器官直接形成不定芽，比通过愈伤组织更好.不定芽发生型是许多植物快繁的主要方式。由于不定芽形成的数量与腋芽数目无关，其增殖率高于丛生芽发生型.但经过愈伤组织途径或多次继代培养后，易导致细胞分裂不正常，增加变异植株发生频率.如香蕉继代次数控制在8代之内,再生植株的变异率则可控制在3左右。需要注意的一点是，表现嵌合性状的植株通过不定芽方式再生时，往往导致嵌合性状发生分离，而失去原有价值.如观赏植物色彩镶嵌的叶子、带金边或银边的植物，通过不定芽途径再生植株时，可能会失去这些具有观赏价值的特征（花斑叶天竺葵品种Mme Salleron也是一个嵌合体，不经愈伤组织由叶柄节段直接形成的不定芽长成植株后或是绿的,或是白的,从不表现嵌合性.与此相反，所有由茎尖培养产生的植株都表现典型的花斑性状p259）。因此，这类植株快繁时,应通过丛生芽途径进行。2。4胚状体发生型胚状体发生型是指外植体在适宜培养环境中，经诱导产生体细胞胚的繁殖方法。外植体诱导产生的愈伤组织进一步发育成类似合子胚的体细胞胚(图111），或外植体表皮细胞直接发育成体细胞胚。体细胞胚由于具有胚芽和胚根的两极原基,不经生根培养即可直接形成完整小植株.图111愈伤组织经诱导形成的体细胞胚状体a.当归愈伤组织形成的胚状体b.葡萄愈伤组织产生的体细胞胚（引自Robert N.Trigiano，2000）胚状体发生途径具有成苗数量大、速度快、结构完整的特点，因而是外植体增殖系数最大的途径。但胚状体发生和发育情况复杂，通过胚状体途径快繁的植物种类，远没有丛生芽和不定芽涉及的广泛。体细胞胚再生的小植株与丛生芽或不定芽再生的小植株相比，具有两个显著差异：胚状体多起源于单细胞。体细胞胚很早就具有明显的根端和苗端的两极分化,极幼小时也是一个根、芽齐全的微型植物，无需诱导生根.生理隔离。胚状体发育的小植株与周围愈伤组织或母体组织间没有结构上的联系,出现生理隔离现象，小植株独立形成,易于分离.而丛生芽或不定芽发育的小植株，最初由分生细胞团形成单极性的生长点，发育成芽,致使芽苗与母体组织或愈伤组织紧密联系，如维管束组织、皮层和表皮组织等。转移生根时，需切割才能分开。2.5原球茎发生型 原球茎发生型是兰科植物的一种快繁方式，它是指茎尖或腋芽外植体经培养产生原球茎（即扁球状体、基部生假根）的繁殖类型。原球茎是短缩的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官，它可以增殖,形成原球茎丛。由茎尖或腋芽外植体诱导产生原球茎，切割原球茎进行增殖，或停止切割使其继续培养而转绿,产生毛状假根，叶原基发育成幼叶，将其转移培养生根，形成完整植株。原球茎繁殖体系是兰花惟一有效的大规模无性繁殖方法.该方法是1960年由法国学者G。Morel开创的，促使了兰花工业的形成，获得了巨大的经济效益.3植物快繁的程序离体无性繁殖是一个相当复杂的过程,包括好几个步骤或阶段。Murashige(1978）提出，可以把商业上进行无性繁殖的整个过程分为4个不同的阶段，即阶段无菌培养物的建立;阶段茎芽的增殖；阶段-芽苗的生根;阶段-小植株的移栽驯化.以上4个阶段中前3个都是在无菌条件下进行的，第4个则是在温室环境中完成的.后来，Debergh和Maene（1981)建议，在阶段之前再加上一个阶段O，其间要把供体植株在仔细监控的环境条件下栽种至少3个月，并且要采取措施减少供体植物的表面污染和内生菌污染。3。1阶段无菌培养物的建立这个阶段的任务包括母株和外植体的选取、无菌培养物的获得及外植体的启动生长,以利于离体材料在适宜培养环境中以某种器官发生类型进行增殖。阶段是植物快繁能否成功的重要一步。3.1.1母株和外植体的选取用来进行繁殖的材料，其母株(stock plant）应选择性状稳定、生长健壮、无病虫害的成年植株。如果田间母株污染严重，无菌培养物无法获得，可将其剪切后进行室内栽种培养，并喷洒毒虫剂和杀菌剂，待长出新枝后进行采样。虽然每种植物器官和组织都可以作为外植体进行植株快繁,但实际应用中，选用何种外植体多与被繁殖植物的种类有关。通常木本植物、较大的草本植物多采用带芽茎段、顶芽或腋芽作为快繁的外植体；易繁殖、矮小或具短缩茎的草本植物则多采用叶片、叶柄、花茎、花瓣等作为快繁的外植体。在一定程度上，用于离体繁殖的外植体的性质，是由所要采用的茎芽繁殖方法决定的。例如，为了增加腋生枝的数目，就应当使用带有营养芽的外植体。为了由受感染的个体生产脱毒植株，就必须使用不足1 mm长的茎尖做外植体.不过，倘若母株是无毒的，或是不需要脱毒，最适用的外植体则是带节的插条.根据一般经验，茎尖以下的较老节段对于杀菌剂毒性的忍耐力比顶端要强得多，但有些植物必须用顶芽来繁殖。如Miller和Murashige（1976）在铁树和龙血树的培养中使用的是顶芽，这是因为侧芽不能产生可供再培养的枝条。在对根状茎植物如草莓等进行微繁时，通常是使用匍匐枝的茎尖。在切取外植体的当时供体植株的生理状态,对于芽的反应能力有明显的影响.在生长季开始时由活跃生长的枝条上切取的外植体，通常能产生最好的效果。对于需要低温、高温或特殊的光周期才能打破休眠的鳞茎、球茎、块茎和其他器官,应当在取芽之前进行必要的处理。如由经过1l冷处理68周的水仙鳞茎上切取的茎尖,比由未经处理的鳞茎上切取的茎尖在离体培养中生长快，存活率高.在通过形成不定芽进行快繁的时候，无论是否要经历愈伤组织阶段，都可用根段、茎段或珠心做外植体。对于用做外植体源的器官的选择，是由其天然形成不定芽的能力决定的.在愈伤组织培养中，正确选择外植体对茎芽的分化也起很大作用。在柠檬桉中,只有起源于木质块茎（1ignotuber）的愈伤组织才能分化茎芽，由茎或根形成的愈伤组织没有这种能力.同样，在咖啡中，茎芽和小植株的分化只发生在直生茎(orthotrophic shoots)节段的培养物中。3.1.2无菌培养物的获得选取的各种外植体材料经适当、有效的灭菌处理后（如何减少污染？)，接种在基本培养基中，以检测每个材料的菌类污染情况.一般每一培养瓶中接种一块材料，避免相互污染。对接种15d以上仍未见污染并且成活的外植体，可转移至促使其启动生长的培养基中。3。1.3外植体的启动生长 不同外植体启动生长的方式不同，主要有:腋芽被刺激后进行生长；茎段、叶片、花芽、子叶和其他器官外植体的伤口处产生不定芽；外植体切口表面产生愈伤组织。启动生长所用的培养基随植物种类、栽培方式和外植体类型的不同而异。外植体启动生长培养基中,生长素和细胞分裂素的浓度最为重要，如刺激腋芽生长时，细胞分裂素（6-BA、KT或2ip）的适宜浓度是0.51.0 mgL，生长素的浓度水平则很低，为0.010.1 mgL；诱导不定芽形成时，需较高水平的细胞分裂素；诱导愈伤组织形成，增加生长素的浓度并补充一定浓度的细胞分裂素是十分必要的.通常，阶段I的完成需要46周，获得的培养产物转移到阶段中进行增殖。然而，有些外植体可能需要在阶段I中停留较长时间，这时，必须将外植体转移到新培养基上培养.如一些木本植物的阶段I完成需1年时间,此时，继代后具有正常茎芽的培养物才能稳定增殖，反之,则在发育中被抑制,无法增殖。3。2阶段-茎芽的增殖这个阶段的任务是对阶段I获得的培养材料进行增殖，不断分化产生新的丛生苗、不定芽或胚状体.3.2。1培养材料的增殖阶段I的培养物在阶段中以前述五种方式进行增殖。每种植物采用哪种方式进行快繁，既取决于培养目的，也取决于材料自身的可能性。一般大多数植物采用无菌短枝、腋芽萌发或诱导不定芽产生,再以芽繁殖芽的方式进行增殖；兰科植物、百合等则采用原球茎增殖途径，以保障繁殖材料的遗传稳定性。增殖后形成的丛生苗或单芽苗分割后,转移到新培养基中继代培养.在繁殖体增殖阶段，每48周继代一次。有时，芽苗随培养时间的延长而出现衰退，即不能生长、茎尖褐化、进入休眠甚至失去再生的潜能，降低培养基中生长调节剂的浓度和避免基部愈伤组织的产生等都可以降低芽苗的衰退。3。2。2增殖培养基增殖率是植株快速繁殖特别是商业性繁殖的重要指标。外植体在每次继代培养中，应能产生最大数量的有效繁殖体.因此，需进行适宜增殖培养基配方的确定。增殖培养基的确定因植物种类、品种和培养类型的不同而异。通常，基本培养基与阶段相同，而细胞分裂素和矿物元素的浓度水平则高于阶段，其最佳浓度的确定应通过实验进行.一般MS培养基适合许多种植物的培养.3.2.3增殖体的大小和切割方法为了保证每次继代培养能获得同样的快速增殖效果，增殖茎段应具有最小组织量，即携带一个茎节，但从初代培养物中切割的茎段一般都有24个茎节。这些茎段可以垂直插入培养基中，但插入的深度不应淹没茎节；或水平放入培养基表面，以刺激侧芽的萌动.初代培养物切割完茎段后，可以继续进行整块分割，再培养。如果出现顶芽发育而抑制其他腋芽增殖的现象,应将顶芽茎段切除，对其基部进行再培养。3。3阶段芽苗生根除了体细胞胚带有原先形成的胚根，可以直接发育成小植株外，在有细胞分裂素存在的情况下，由不定芽和腋芽长成的枝条一般都没有根。诱导无根苗生根的方法有以下2种：3。3。1离体生根离体生根也称试管内生根，即把大约1 cm长的小枝条逐个剪下,转插到生根培养基中.生根时所用基本培养基组成同阶段I，但需降低无机盐浓度，一般用12或14的量,并减少或除去细胞分裂素,增加生长素的浓度。对于大多数物种来说，诱导生根需要有适当的生长素，其中最常用的是NAA和IBA，浓度一般为0。110.0mgL。对有些植物，如果芽苗在含有生长素的培养基中生长12d,再转移至无生长素的培养基中,或芽苗在含生长素的生根溶液中浸蘸后直接插入无生长素的培养基中，其生根效果好；如果在生长素处理阶段辅以黑暗条件，则生根效果更好.在阶段和阶段之间,将增殖的芽苗转移至无或低浓度细胞分裂素的培养基中培养24周，或添（增)加赤霉素,降低细胞分裂素的作用，这种芽苗在阶段时，可直接转入无细胞分裂素和赤霉素的培养基中诱导生根。离体培养中的生根期也是前移栽期。因此，在这个时期必须使植物做好顺利通过移栽关的各种准备.在生根培养基中减少蔗糖浓度(如减到大约1)和增加光照强度（如增至3 00010 000 lx），能刺激小植株使之产生通过光合作用制造食物的能力，以便由异养型过渡到自养型.较强的光照也能促进根的发育，并使植株变得坚韧,从而对干燥和病害有较强的忍耐力.虽然在高光强下植株生长迟缓并轻微退绿，但当移人土中之后，这样的植株比在低光强下形成的又高又绿的植株容易成活。 枝条在离体条件下生根所需的时间不等。当根长至5 mm左右时移栽最为方便，更长的根在移栽时易断，因此会降低植株的成活率。3.3.2活体生根活体生根又称试管外生根。用此法生根时，芽苗可以先在生长素中快速浸蘸或在含有相对高浓度生长素的培养基中培养510d，诱导枝条形成根原基，然后再移栽土中，遮荫保湿,待其生根。在可能的情况下，试管外生根由于减少了一个无菌操作步骤，因而可降低成本.3.3。3无根苗的嫁接当试管内难于诱导枝条生根，或在市场拒绝自根苗的情况下，嫁接就成了完成离体快繁最后一步的必然选择。嫁接又可分为试管内嫁接和试管外嫁接两种情况： 试管内嫁接又叫微体嫁接，即以试管苗的0.10.2 mm长的茎尖为接穗，以在试管内预先培养出来的带根无菌苗为砧木，在无菌条件下借助显微镜进行嫁接，之后继续在试管内培养，愈合后成为完整植株再移人土中。这种嫁接方法技术难度高，不太容易掌握，但在苹果和柑橘脱毒苗生产中,已取得了一定进展。试管外嫁接方法在三倍体无籽西瓜试管苗生产中应用较早，当把上述试管苗嫁接到瓠子上后，在温度为2530，相对湿度基本饱和的条件下，3 d后伤口长出愈伤组织,1周后成活并长出新叶.苹果苗试管外嫁接的主要环节是:选取苗高2 cm，茎粗O。102 cm的试管苗为接穗,在室温下锻炼12 d后，劈接或皮接于大树新梢上，3周后愈合（杨玉梅,1986)。3。4阶段小植株的移栽驯化3.4.1壮苗和炼苗试管小植株的移栽驯化是试管苗从异养到自养的转变,有一个逐渐适应过程.由于试管苗生长在恒温、高湿、弱光、无菌和有完全营养供应的特殊条件下，虽有叶绿素,但异养生活，因此在形态解剖和生理特性上都有很大脆弱性，例如水分输导系统存在障碍，叶面无角质层或蜡质层，气孔开张过大且不具备关闭功能等。这样的试管苗若未经充分锻炼,一旦被移出试管,投人到一个变温、低湿、强光、有菌和缺少完全营养供应的条件下，会很快失水萎蔫，最后死亡。因此，为了确保移栽成功，在移栽之前必须先要培育壮苗和开瓶炼苗.壮苗是移栽成活的首要条件,但培育壮苗的方法则因材料和情况的不同而异。在培养基中加入一定数量的生长延缓剂如多效唑(PP333)，B9(比九）或矮壮素（CCC）等，在很多种植物中都是培育壮苗的一项有效措施。壮苗之后则须开瓶炼苗降低瓶中湿度,增强光照强度，以便促使叶表面逐渐形成角质，促使气孔逐渐建立开闭机制，促使叶片逐渐启动光合功能等。炼苗的具体措施则因苗的种类不同而异，有些单子叶草本植物,只要苗壮，炼苗方法十分简单：拿掉封口塑料膜，在培养基表面加上薄薄一层自来水，置于散射光下35 d即可。有些植物如霞草和刺槐试管苗极易萎蔫,封口膜在炼苗开始时只能半开,且要求炼苗环境有较高的相对湿度。喜光植物如枣和刺槐等可在全光下炼苗,耐荫植物如玉簪和白鹤芋等则须在较荫蔽的地方炼苗，萱草、月季、福禄考、油茶等可在5070的遮荫网下炼苗(李云,2001）。3。4。2移栽试管小植株移栽时，首先应洗去小植株根部附着的培养基,避免微生物的繁殖污染，造成小苗死亡。移栽前先将人工配制的混合培养基质进行消毒（0.3%0.5%高锰酸钾或用40福尔马林50100倍液)，然后浇透水，再后将小植株栽入其中.基质用保湿又透气的材料，如蛭石、珍珠岩、粗沙、泥炭、腐殖土等按比例混合，以利小植株生长。3。4。3驯化管理由于试管苗是在高湿（90100的相对湿度)环境中生长的，茎叶表面防止水分散失的角质层等几乎全无，根系又不发达,移栽后难以保证水分平衡，即使根系周围有足够的水分也不行。故移栽后初期要通过喷雾或罩上透明塑料以保持小植株周围的空气湿度较高 （90100），减少叶面蒸腾，这对移栽的成功是非常重要的。在塑料罩上可打些小孔，以利气体交换。在移栽时把小植株的一部分叶片剪掉也可能是有益的。随着时间的推移，应逐渐降低空气相对湿度，使移栽苗适应自然环境条件。移栽小植株还应注意光、温控制。试管苗是在营养丰富且含糖的培养基中进行异养生长的，移栽后要通过自身的光合作用来维持生存。因此，移栽初期光照强度应较弱，经过一段时间适应后，再增加光照强度。移栽小植株生长所需的适宜温度与植物种类有关，喜温性植物以25左右为宜，喜凉性植物则以1820为好。温度过高导致蒸腾作用加强，水分失衡，微生物滋生等;温度过低则使幼苗生长迟缓或不易存活。如使基质温度高于空气温度23，则有利于生根和促进根系发育，提高存活率。此外,在移栽小植株的驯化管理阶段，还应防止菌类滋生，适当喷一定浓度的杀菌剂可有效保护移栽小植株的正常生长.总之,移栽苗成活的必要条件是：空气湿度高，土壤通气好,太阳勿直照，温度要适宜.4影响植物离体快繁的因素4。1外植体起始的外植体状况如外植体的来源、发育阶段、大小及预处理等，是决定植株繁殖速率和再生植株质量的最重要因素。4.1。1外植体的来源在植物组织培养中,不是所有的培养细胞都同样分裂增殖,常常是细胞群中的一部分细胞进行旺盛的分裂形成细胞块，称为拟分生组织。尽管细胞全能性是所有植物细胞具有的特性,但全能性的表达常局限于某些特殊的细胞，即拟分生组织细胞,致使不同组织或器官的植株再生能力差异很大.具有拟分生组织的外植体如茎尖、带芽茎段等是最佳的植物快繁外植体，因其形态已基本建成，生长速度快,遗传性稳定。当所有其他组织作为外植体的植株再生工作都失败时，茎尖培养仍然可以获得成功.无拟分生组织的外植体如叶片、根段、花器、子房、子叶等,如果在适当刺激下能产生拟分生组织，也是植物快繁的合适材料.但是，由于培养技术和条件的限制,有些植物的一些组织或器官，如厚叶莲花掌的叶、非洲菊的花梗和花瓣，仍然无法获得再生植株，对这类植物进行快繁时,确定合适的外植体来源十分重要。有的植物可从多种组织或器官中获得再生植株，如香石竹等，这类植物的外植体种类的确定应以采集和灭菌是否容易为标准。4。1.2外植体生理年龄植物生理学的基本观点是同一植株的不同器官和同一器官的不同部位都具有不同的生理年龄。沿植物主轴，越近下部生理发育年龄越小，远离发育上的成熟，不易形成花器官,但易分化，再生能力强。越近顶端的器官，生理年龄越老，接近发育上的成熟，易形成花器官，但分化和再生能力弱。嫩叶再生能力高于老叶，木本植物幼树嫩枝、老树基部萌蘖枝再生能力强。4。1.3外植体大小培养成活的外植体数及其生长速率和繁殖率与外植体的起始大小密切相关。外植体越小，成活率和繁殖率就越低。茎尖离体成活的临界大小应为携带12个叶原基，为0。20。3mm;叶片、花瓣等约为5mm2；茎段则为0.5cm.因此，除非是进行脱病毒植株繁殖，否则不宜将外植体切割得太小.4.2培养基长期以来,根据培养的植物种类、组织或器官及培养目的的不同，已设计了许多培养基配方。4。2.1基本培养基MS培养基是植物组织培养中应用最广泛的一种培养基。这种培养基中的无机盐含量足以满足多种植物组织培养阶段I和阶段的营养需求。但对某些植物，如乌饭树（Vaccinium bracteatum）、越橘、捕虫堇(Pinguicula moranensis)等以及植物组织培养阶段，MS的无机盐含量就显得过高，应以14 MS或l2 MS为好。4.2。2碳源对多数植物来说，蔗糖和葡萄糖是良好的碳源，其浓度为24，可满足阶段I和阶段的需求，阶段所需糖浓度较低，为13.在植物大规模离体快繁时，常用白糖代替蔗糖，再生植株未见明显的差异，但可降低生产成本。4。2。3植物生长调节剂植物生长调节剂是完成阶段I、阶段和阶段过程所必需的物质,其浓度的高低及其种类的配合决定着植物的快繁过程能否顺利进行。高浓度(1。010。0mgL)的细胞分裂素和低浓度(0.11.0mgL)的生长素配合（或无需生长素），可以使腋芽和茎尖外植体在阶段I启动，形成丛生芽或单芽,并进行阶段的增殖.随着继代增殖次数的增加,应逐步降低细胞分裂素的浓度，甚至在进入阶段前，不用细胞分裂素。在含有丰富还原氮的培养基上，附加生长素，特别是2，4-D,可诱导外植体在阶段I启动，产生胚状体,将其转移到低或无生长素的培养基上使其成熟、萌发和生长。阶段常单独使用低浓度的生长素,或与低浓度细胞分裂素配合使用。此外,ABA、多效唑（paclorutrazol，PP333)、CCC等植物生长调节剂对促进试管苗生根、壮苗、提高成活率等均有一定的作用。4。2。4培养基的物理特性不同的培养材料可选用不同物理状态的培养基。以原球茎或胚状体方式增殖的材料，可选用液体培养基，但大多数材料的培养还是用固体培养基.培养基的pH一般为5。86.0.4。3培养条件影响植物快繁的培养条件主要有光照、温度和湿度。此外，培养瓶内的气体状况也对植株的生长和发育有一定影响。4.3。1光照光强烈地影响着植物培养组织的生长和器官发育，主要是光照强度和光照时间的影响。在植物快繁的阶段I和阶段期间，光照强度应为1 0003 000 lx，而阶段时，可将光照强度增至3 00010 000 1x。离体培养时增加光照强度可能阻滞培养材料生长，导致轻微减绿,但这种植株碳水化合物积累多，组织充实，易适应外界环境，移栽后比在低光强度下所得的植株成活率高。大多数植物每天1416h的光照、810h的黑暗即可满足其生长发育的需求，但连续光照对有些植物可起到促进苗增殖和健壮的作用,而块茎和其他贮藏器官的形成则可能要求较长的黑暗时期，因为它们在正常形成时是短日照。在大规模离体快繁时，也可以考虑利用自然光进行组培苗生产，以降低生产成本。4。3。2温度离体材料培养和快繁的温度要求应参照植物的原产地。高温(约27)适合热带品种,低温（约20)有利于高山植物的离体培养，多数植物在252都能正常地被诱导、增殖和生根，低于10会停止生长,高于35会抑制正常生长和发育。组织培养时,对外植体或试管苗进行低温或高温处理，可促进器官分化，提高诱导频率,增加无病毒植株的获得率。如先将植物原始材料置于较高温度(3540)条件下，经不同时期处理可以提高无病毒外植体的发生率；将试管内发育的鳞茎或球茎小植株在移栽前,预先进行46周2的低温处理，才能使之正常生长；在试管苗培养期间，在一定范围内降低温度，减慢其生长速度，可提高试管苗质量(如香石竹在1825范围内随温度降低,试管苗生长速度减慢，但其质量有所提高，玻璃化现象减少；但当温度高于25时,试管苗徒长细弱，玻璃化或半玻璃化苗明显增加）。4.3.3湿度培养环境的湿度对组培苗生长发育的影响相对较小,因试管苗是在较密闭容器中生长，容器内相对湿度几乎达100，可满足其生长发育。但如果培养环境中相对湿度过低，且所用封口膜为透气封口膜时，培养基易失水、干裂，故环境中的相对湿度应为70%80。4.3.4气体培养基经高温灭菌及试管苗生长，培养瓶中产生乙烯并积累，乙烯浓度过高（56lL）时，可抑制试管苗的生长。因此，需及时转接试管苗,并选择通透性好的封口材料；进行液体培养时，培养物浸没在液体中会导致缺氧，致使生长停止、死亡.因此，需进行振荡培养，促进氧气交换，达到培养物高效增殖的目的。4。4继代培养阶段以芽苗或不定芽方式增殖的植物,培养许多代后仍能保持其旺盛的增殖力,但会出现“驯化”现象，即开始继代培养时,需较高浓度生长调节物质,随继代时间延长，加人生长调节物质的量减少或不加入就可以使其生长。所以，在阶段中，应注意调整培养基激素浓度。对生长速度快或繁殖系数高的植物，继代时间应短(15d左右)；反之，继代时间应长(3040d）。阶段以培养细胞或愈伤组织方式继代增殖的植物，形态发生能力易随继代时间延长而减弱或丧失，原因是：愈伤组织培养时逐渐丧失了成器官中心(拟分生组织）；内源激素减少；染色体畸变积累。可通过外源生长调节物质的增加、筛选具有形态发生能力的细胞团、缩短继代时间等措施防止其再生能力的丧失，最好的办法是重新建立细胞系。此外，阶段中的增殖率、污染、玻璃化等因素也影响着试管苗生产的效率和经济效益.4。5移栽阶段的成功与否直接影响着植物快繁的成本、工作效率及经济效益。如葡萄试管苗移栽成本占总成本的5678。在高湿、恒温、弱光下生长的异养试管苗,出瓶移栽后易导致其死亡，盲目移栽驯化，将导致快繁工作前功尽弃.试管苗出瓶移栽后导致其死亡的因素包括：4.5。1根系结构根系结构不完善的试管苗移栽后，易造成死亡。死亡原因及克服方法为：不生根。一些植物，特别是木本植物的试管苗不生根，无法移栽,可采用嫁接法解决.根与输导系统不连接.从愈伤组织诱导产生的根与已分化芽的输导系统不相通。可将芽切割下来转移到生根培养基中,重新诱导根的形成。根无根毛或很少.许多试管植株再生根上无根毛，将小苗移栽前置人液体培养基中培养，有时可促进根毛发育.根无吸收功能或极低.有些试管苗再生根的吸收功能无或很低，移栽前将试管苗在培养液中培养一段时间（如1个月)，可恢复根的吸收功能。4.5。2叶表皮组织叶表皮组织不发达或结构不正常的试管苗,移栽后也易造成死亡。表现为：叶表角质层和蜡质层不发达或无.叶无表皮毛或极少。叶解剖结构稀疏。试管苗、温室苗和大田苗的叶栅栏细胞厚度和叶组织间隙存在明显差异。气孔开口大，不关闭。显微镜下观察发现，试管苗气孔始终处于开放状态，保卫细胞变圆，气孔开张很大.叶片存在排水孔.在长期高湿环境中，试管苗叶片出现排水孔，导致移栽后极易失水干枯。光合作用能力极低。试管苗栅栏组织少而小,细胞间隙大,影响叶肉细胞中二氧化碳的吸收和固定。 为了克服上述不利因素，可采用的措施有:驯化锻炼。使试管苗健壮、坚实，形成表皮正常组织结构，恢复气孔功能。试管苗的驯化锻炼过程为：出瓶移栽前先打开瓶口进行23d湿度锻炼,然后移栽到高湿、弱光、温度适宜并略低的环境中，逐步降低空气相对湿度，增加光照强度,直至小植株适应自然环境。瓶内培育壮苗.试管苗能否从异养过渡到自养，其自身生活力起决定作用。凡生活力强、健壮、有较发达根系的试管苗易移栽成活。在培养基内添加PP333、CCC等植物生长延缓剂，增加光照强度，适当降低培养温度等是培育壮苗的有效途径.5植物离体快繁的应用5.1提高繁殖系数,缩短新品种推广所用时间虽然通过离体培养方法可以既经济又安全地生产、保存、繁殖和运输无病毒植物，但当前微繁最主要的用途是替代传统的营养繁殖方法以增加繁殖系数。通过组织培养，由一块很小的、甚至是极微的植物组织，在12个月之内可以产生100万以上植株,如此之高的繁殖速度是用任何传统的无性繁殖方法所不能达到的。用组织培养方法进行植物繁殖的优点在于枝条的增殖周期很短(26周)，而每个周期都能导致枝条数的几何级数增长。此外，在组织培养中,植物的繁殖可以不受季节影响,一年到头连续进行。目前，有很多种园艺植物,如非洲紫罗兰、香蕉、桉树、蕨类植物、非洲菊、大岩桐、兰花和杜鹃花等，都正在大规模地用组织培养方法进行繁殖.在离体条件下植物繁殖系数的提高，必然会显著缩短一个新品种由选育到推广所需的时间。由于通过检疫的植物材料其数量一般都是有限的,因此，微繁也应当能够加速通过检疫之后新作物的引种。5.2保存种质资源，节约保存用地在存在着严重病害问题的情况下，植物离体繁殖方法比非无菌繁殖法有一个突出的优点：通过离体方法不仅可把无病原菌植物既可靠又经济地保存起来,而且一旦需要,无论什么季节都可立即进行快速繁殖。在苗圃中，通过组织培养可以最大限度地减少用于保存原种所需的土地面积，在一个大约3 m3 m5 m房间里的培养架上所放置的培养瓶，即可保存几十亿个植株。5.3在雌雄异株植物中有选择地繁殖所需性别的植株 在雌雄异株植物中,种子繁殖后代有50雄株和50雌株,但在有些情况下，生产上只希望种植其中一个性别的植株，因此营养繁殖就极为重要。例如在石刁柏中，雄株比雌株价值高,但现在还不能通过茎插条进行无性繁殖。Yang(1977）介绍了一种由嫩芽快速克隆这种植物的离体方法。木瓜是另一种雌雄异株植物，在靠种子进行繁殖的果园中，由于要淘汰大量雄株，而淘汰又只有在植株长到开花期时才能进行，因此造成的损失很大，若对雌株进行离体无性繁殖，就可以避免这种损失.6植物离体快繁中存在的一些问题6。1物种的局限性 离体无性繁殖是一种生产技术，现已被世界上很多苗圃用于各种各样的草本和木本植物.不过，很多难以用传统方法繁殖的重要树木,包括若干裸子植物，离体繁殖技术还未过关.为了克服这个局限性仍须进行大量的研究工作.6.2无性系变异(遗传不稳定)植物组织和细胞培养中，细胞、组织和再生植株均会出现各种变异，且具普遍性,涉及的植物性状也相当广泛。6.2.1影响遗传稳定性的因素影响培养材料遗传稳定性的因素有：基因型。培养材料的基因型不同，发生变异的频率也不相同。继代次数。试管苗继代培养次数和时间是造成遗传变异的关键因素,一般随继代次数和时间的增加，变异频率呈上升趋势.如香蕉诱导不定芽产生的过程中,继代5次时的变异率为2.14,10次为4。2%,20次后则为100，因而香蕉继代培养不能超过1年。蝴蝶兰连续培养4年后，植株退化,不开花，因此原球茎应2年更换一次茎尖。器官发生方式。离体器官5种发生方式中,以茎段、茎尖等形成的丛生芽、单芽的方式繁殖，不易发生变异或变异率极低。如葡萄茎段快繁,经过58年继代培养，其变异频率与常规方法相同，数万株中只有一株产生变异；菊花茎尖、腋芽培养,变异率较低，而花瓣诱导的变异率较高。6。2。2降低遗传变异的措施降低遗传变异发生的方法有：选用不易发生遗传变异的基因型材料；缩短继代时间，限制继代次数，继代一定时间后，重新开始外植体的继代培养；采用不易发生遗传变异的增殖途径；采用适当的生长调节物质和较低的浓度，减少或不使用易引起诱变的物质,及时剔除生理和形态异常苗。6。3培养物污染污染是指在组培过程中，由于真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器中滋生大量菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象.6.3.1污染发生原因污染通常是由下列原因引起:培养基、培养容器及各种接种器皿、器械灭菌不彻底；外植体灭菌不彻底；操作时人为带入；环境（接种室的环境、培养室的环境）不清洁;超净工作区域不清洁。在植物大规模微繁期间，即使外植体在一开始进行了严格的表面消毒，某些慢速生长的病原菌(特别是内生菌)可能依然存在，但只有在培养物经过多次继代之后，这些污染物才表现出来并被人们所发现。污染物的长期存在会引起试管苗生活力下降,叶片缺绿，甚至死亡。在培养基中添加抗生素或杀菌剂有可能控制这些污染物的进一步扩展，但不可能杀灭这些污染物。所以最好的办法还是要从未受病原菌侵染的或已经过脱毒检验的植株上切取外植体.6。3.2控制污染的措施针对引起污染的原因，控制的方法有：培养基及各种接种器皿的灭菌要彻底，严格遵守灭菌操作规程接种器具每次使用后应用酒精灼烧；污染的外植体材料应及时淘汰，如果种源有限，对外植体材料可进行二次灭菌;操作人员接种时应用75的酒精擦拭双手和培养瓶表面,操作区内不要放人过多待用培养瓶，防止气流被挡住；接种环境应定期用福尔马林等熏蒸灭菌，经常用紫外灯照射灭菌;超净工作台应定期对初过滤器清洗和更换,提前1520min打开，并用75酒精擦拭整个工作台.植物材料的表面消毒要彻底。培养室保持清洁。封口膜保持完好、密封。6.4玻璃化玻璃化现象(Vitrification)是植物组织培养过程中试管苗特有的一种生理失调或生理病变,多数发生在植物茎尖培养和离体快繁中。玻璃苗生长繁殖速度下降，最后甚至死亡。6.4.1玻璃苗特