基于RNA干扰的杀菌剂开发及其对化学杀菌剂的影响.pdf

3031M市场纵横 Market基于 RNA 干扰的杀菌剂开发及其对化学杀菌剂的影响口/南京农业大学 植物保护学院 宋修仕 高静 周明国*引 言RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指由RNA（细胞内源或外源）诱发的基因沉默现象，其机制是短的反义 RNA通过阻碍与其有互补序列基因的转录或翻译来抑制基因的表达。近年来，基于 RNAi 机制的有害生物防治策略发展迅速，用于防治有害生物的 RNA 分子制剂被称为核酸农药。相比于传统的小分子农药，核酸农药靶标特异性强，无残留，且开发成本远低于化学农药，符合当今社会对于环境友好型农药的要求。2018 年，美国食品药品监督管理局批准了第 1 个基于 RNAi 的药物ONPATTRO，该药物可治疗伴有多发性神经疾病的遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR），这标志着 RNAi 技术的应用进入一个新时代。在农业领域，首个在美国国家环境保护署（EPA）获批的核酸农药产品是表达 DvSnf7双链 RNA 的转基因玉米，用以防治西方玉米根虫 Diabrotica virgifera LeConte（western corn rootworm，WCR），该产 品 计 划 于 2024 上 市（https:/ RNAi 技术生产的 VT4PRO玉米也获得了 EPA 的商业登记，最早将于2024 年在美国上市。虽然 RNAi 防治有害生物的技术正处于商业开发的热点阶段，但若实现其大规模应用还需要解决一些阻碍，例如 RNA 递送至靶细胞的效率问题、靶标基因的沉默效率问题、剂量限制性毒性和干扰效率不足以及 RNA 分子的稳定性和持效性等。就防治病原微生物的核酸杀菌剂而言，虽然已有文章报道在实验室条件下，体外或体内应用合成的长双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）或小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）可以下调微生物中靶标必须基因的表达，从而实现防控卵菌、真菌和病毒病原体，但是其防治效果与稳定性方面表现得较为复杂。本文拟从 RNAi 的发展历程中探寻那些改变核酸杀菌剂发展方向的重要事件，从理论M市场纵横 Market与技术角度分析核酸杀菌剂目前存在的问题与障碍，通过比较化学杀菌剂与核酸杀菌剂的优缺点阐述核酸杀菌剂的发展对化学杀菌剂市场的影响。1 RNAi 研究的发展历程RNAi 现象是 Fire 等在对秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans 的研究中发现并揭示的。该生物现象的发现解释了之前在植物、真菌和动物中观察到的令人困惑的基因沉默现象。随后，RNAi 现象被证实在多种生物中广泛存在，但是不同物种间 RNAi 核心元件的起源和生物合成存在较大差异，这引发了科研人员的研究兴趣。目前人们普遍认为 19 30nt的非编码小 RNA（small RNAs,sRNAs）在 RNAi 过程中发挥着重要作用。sRNAs 根据来源、结构和生物作用可分为 3 类：小干扰 RNAs（siRNAs）、微小 RNAs（microRNAs，miRNAs）和piwiRNAs（piwi-interacting RNAs，piRNAs）。大多数真菌的 sRNAs 为 siRNAs。生物体内的 RNAi 过程大致可分为起始、效应和级联放大 3 部分。2001 年，科研工作者发现 Dicer 酶是 RNAi 起始步骤的关键酶，Dicer 将长 dsRNA 剪切加工为成熟的 siRNA；然后，siRNA 单链被加载到具有核酸内切活性的Argonaute 蛋白上，形成 RNA 诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。siRNA 与 互 补 的 信 使 RNA（messenger RNA,mRNA）结合后，靶标 mRNA 会被 Argonaute直接剪切或介导 RISC 对 mRNA 的翻译抑制。研究者随后发现，RNA 依赖性 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerase，RdRP）参与次级小 RNA 的产生与复制，进一步增强和放大了沉默效应。在植物和秀丽隐杆线虫 C.elegans 中，RdRP 可在靶 RNA 模板上形成合成 sRNA 或 dsRNA 的扩增环，起到级联放大的作用。随着研究的逐渐深入，RNAi 成为哺乳动物、植物、线虫、真菌和卵菌基因功能研究的重要工具。RNA 在生物体内有效的传递与运输是 RNAi 应用于医药和农业领域的前提。大量研究表明，sRNA可以在相互作用的生物体内传递（例如植物-真菌），进而诱导彼此的基因沉默，该机制被称为跨界 RNA干扰。dsRNA 或 sRNA 只有进入细胞中才能发挥出高效的沉默效率，不同生物对 dsRNA 或 sRNA 的摄取机制存在差异。在秀丽隐杆线虫 C.elegans 中，dsRNA 的吸收主要是通过 SID 跨膜蛋白家族。SID-2 基因编码一种跨膜蛋白，通过内吞作用十分缓慢地摄取 dsRNA，而 SID-1 基因产物与内吞作用无关，主要参与质膜中快速转运和通道的形成。昆虫细胞摄取 dsRNA 的机制现已基本确定为网格蛋白依赖性内吞作用。棉铃象鼻虫Anthonomus grandis中dsRNA的细胞摄取与大胞饮作用相关。到目前为止，虽然有文章报道网格蛋白介导的内吞作用参与了核盘菌对 dsRNA 的摄取，但真菌吸收 dsRNA 或 sRNA 的具体机制仍不清楚。这也限制了核酸农药在真菌防控方面的发展。RNAi 药物首先在医药领域得到发展。2003 年，siRNA 首次作为药物应用于哺乳动物，其治疗潜力一度成为多家公司的研究热点。然而，首批 siRNAs 临床试验 RNAi 效果不显著并伴随不确定的干扰效应，试验中也出现了与免疫相关的毒性，最终以失败告终；随后第 2 波的临床试验研究发现，系统应用 siRNA 纳米制剂能对人体产生效果，但是药效一般，同时表现出明显的剂量限制性毒性和疗效不足的问题。鉴于RNAi 药物的负面作用，21 世纪 10 年代初大型制药公司退出了 RNAi 药物研究领域，这对该行业造成极大的打击。但是，一些较小的 RNAi 药物公司和科研人员一直坚持改进 siRNA 的递送、序列选择、化学配方和输送机制等技术，并取得了一定的进展。2018 年，RNAi 药物 ONPATTRO（patisiran）得到美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的批准，该类新 siRNA 药物主要用于治疗遗传性转甲状腺素淀粉样变性病。最近，FDA 和 EMA 批准吉夫拉里（Givlaari）作为第 2 个 RNAi 药物用于治疗急性肝卟啉症（AHP）成人患者。多种适用于肝脏、肾脏和眼部疾病的候选药物正处于、和期临床试验中，RNAi 医药重新成为研究焦点。基因工程（genetic engineering，GE）的迅速发展使得RNAi 相关药品在农业领域中发展迅速，核酸农药应运而生。针对有害生物的 RNAi 技术可以通过不同的方式实现，包括通过宿主诱导的基因沉默（host-induced genesilencing，3031M市场纵横 Market基于 RNA 干扰的杀菌剂开发及其对化学杀菌剂的影响口/南京农业大学 植物保护学院 宋修仕 高静 周明国*引 言RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指由RNA（细胞内源或外源）诱发的基因沉默现象，其机制是短的反义 RNA通过阻碍与其有互补序列基因的转录或翻译来抑制基因的表达。近年来，基于 RNAi 机制的有害生物防治策略发展迅速，用于防治有害生物的 RNA 分子制剂被称为核酸农药。相比于传统的小分子农药，核酸农药靶标特异性强，无残留，且开发成本远低于化学农药，符合当今社会对于环境友好型农药的要求。2018 年，美国食品药品监督管理局批准了第 1 个基于 RNAi 的药物ONPATTRO，该药物可治疗伴有多发性神经疾病的遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR），这标志着 RNAi 技术的应用进入一个新时代。在农业领域，首个在美国国家环境保护署（EPA）获批的核酸农药产品是表达 DvSnf7双链 RNA 的转基因玉米，用以防治西方玉米根虫 Diabrotica virgifera LeConte（western corn rootworm，WCR），该产 品 计 划 于 2024 上 市（https:/ RNAi 技术生产的 VT4PRO玉米也获得了 EPA 的商业登记，最早将于2024 年在美国上市。虽然 RNAi 防治有害生物的技术正处于商业开发的热点阶段，但若实现其大规模应用还需要解决一些阻碍，例如 RNA 递送至靶细胞的效率问题、靶标基因的沉默效率问题、剂量限制性毒性和干扰效率不足以及 RNA 分子的稳定性和持效性等。就防治病原微生物的核酸杀菌剂而言，虽然已有文章报道在实验室条件下，体外或体内应用合成的长双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）或小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）可以下调微生物中靶标必须基因的表达，从而实现防控卵菌、真菌和病毒病原体，但是其防治效果与稳定性方面表现得较为复杂。本文拟从 RNAi 的发展历程中探寻那些改变核酸杀菌剂发展方向的重要事件，从理论M市场纵横 Market与技术角度分析核酸杀菌剂目前存在的问题与障碍，通过比较化学杀菌剂与核酸杀菌剂的优缺点阐述核酸杀菌剂的发展对化学杀菌剂市场的影响。1 RNAi 研究的发展历程RNAi 现象是 Fire 等在对秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans 的研究中发现并揭示的。该生物现象的发现解释了之前在植物、真菌和动物中观察到的令人困惑的基因沉默现象。随后，RNAi 现象被证实在多种生物中广泛存在，但是不同物种间 RNAi 核心元件的起源和生物合成存在较大差异，这引发了科研人员的研究兴趣。目前人们普遍认为 19 30nt的非编码小 RNA（small RNAs,sRNAs）在 RNAi 过程中发挥着重要作用。sRNAs 根据来源、结构和生物作用可分为 3 类：小干扰 RNAs（siRNAs）、微小 RNAs（microRNAs，miRNAs）和piwiRNAs（piwi-interacting RNAs，piRNAs）。大多数真菌的 sRNAs 为 siRNAs。生物体内的 RNAi 过程大致可分为起始、效应和级联放大 3 部分。2001 年，科研工作者发现 Dicer 酶是 RNAi 起始步骤的关键酶，Dicer 将长 dsRNA 剪切加工为成熟的 siRNA；然后，siRNA 单链被加载到具有核酸内切活性的Argonaute 蛋白上，形成 RNA 诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。siRNA 与 互 补 的 信 使 RNA（messenger RNA,mRNA）结合后，靶标 mRNA 会被 Argonaute直接剪切或介导 RISC 对 mRNA 的翻译抑制。研究者随后发现，RNA 依赖性 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerase，RdRP）参与次级小 RNA 的产生与复制，进一步增强和放大了沉默效应。在植物和秀丽隐杆线虫 C.elegans 中，RdRP 可在靶 RNA 模板上形成合成 sRNA 或 dsRNA 的扩增环，起到级联放大的作用。随着研究的逐渐深入，RNAi 成为哺乳动物、植物、线虫、真菌和卵菌基因功能研究的重要工具。RNA 在生物体内有效的传递与运输是 RNAi 应用于医药和农业领域的前提。大量研究表明，sRNA可以在相互作用的生物体内传递（例如植物-真菌），进而诱导彼此的基因沉默，该机制被称为跨界 RNA干扰。dsRNA 或 sRNA 只有进入细胞中才能发挥出高效的沉默效率，不同生物对 dsRNA 或 sRNA 的摄取机制存在差异。在秀丽隐杆线虫 C.elegans 中，dsRNA 的吸收主要是通过 SID 跨膜蛋白家族。SID-2 基因编码一种跨膜蛋白，通过内吞作用十分缓慢地摄取 dsRNA，而 SID-1 基因产物与内吞作用无关，主要参与质膜中快速转运和通道的形成。昆虫细胞摄取 dsRNA 的机制现已基本确定为网格蛋白依赖性内吞作用。棉铃象鼻虫Anthonomus grandis中dsRNA的细胞摄取与大胞饮作用相关。到目前为止，虽然有文章报道网格蛋白介导的内吞作用参与了核盘菌对 dsRNA 的摄取，但真菌吸收 dsRNA 或 sRNA 的具体机制仍不清楚。这也限制了核酸农药在真菌防控方面的发展。RNAi 药物首先在医药领域得到发展。2003 年，siRNA 首次作为药物应用于哺乳动物，其治疗潜力一度成为多家公司的研究热点。然而，首批 siRNAs 临床试验 RNAi 效果不显著并伴随不确定的干扰效应，试验中也出现了与免疫相关的毒性，最终以失败告终；随后第 2 波的临床试验研究发现，系统应用 siRNA 纳米制剂能对人体产生效果，但是药效一般，同时表现出明显的剂量限制性毒性和疗效不足的问题。鉴于RNAi 药物的负面作用，21 世纪 10 年代初大型制药公司退出了 RNAi 药物研究领域，这对该行业造成极大的打击。但是，一些较小的 RNAi 药物公司和科研人员一直坚持改进 siRNA 的递送、序列选择、化学配方和输送机制等技术，并取得了一定的进展。2018 年，RNAi 药物 ONPATTRO（patisiran）得到美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的批准，该类新 siRNA 药物主要用于治疗遗传性转甲状腺素淀粉样变性病。最近，FDA 和 EMA 批准吉夫拉里（Givlaari）作为第 2 个 RNAi 药物用于治疗急性肝卟啉症（AHP）成人患者。多种适用于肝脏、肾脏和眼部疾病的候选药物正处于、和期临床试验中，RNAi 医药重新成为研究焦点。基因工程（genetic engineering，GE）的迅速发展使得RNAi 相关药品在农业领域中发展迅速，核酸农药应运而生。针对有害生物的 RNAi 技术可以通过不同的方式实现，包括通过宿主诱导的基因沉默（host-induced genesilencing，3233M市场纵横 MarketHIGS）、喷 雾 诱 导 的 基 因 沉 默（spray-induced gene silencing，SIGS）以及病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）。农业领域首个商业化 RNAi 产品是可以表达 dsRNA 的转基因玉米，通过表达靶向 Snf7 基因的发夹 dsRNA 来控制西方玉米根虫。该商品于 2017 年获得 EPA 批准，已经以商品名 SmartStax Pro 在 2022 年上市（https:/ 5 编码基因（PSMB5）的长链 dsRNA 生物农药活性成分，名为 Ledprona，即将获得美国登记。2 核酸杀菌剂在植物病害防控中的应用与瓶颈在 RNAi 被用于病害防控的最初阶段，RNAi 对病毒性病害的防控是众多研究者探究的热点内容。科研人员分别开发了4 类基于 RNAi 的抗病毒技术：正义链诱导的转录后基因沉默（S-PTGS）、发夹 RNA 诱导的 PTGS（hp-PTGS）、人工 miRNA诱导的 PTGS（AMIR）和反式作用 siRNA 诱导的 PTGS（TAS）。利用上述技术培育了可以表达 sRNA 的转基因植株，并分别在实验室和田间条件下进行了测试，发现部分转基因植物获得了对病毒的持久抗性。据国际农业生物技术应用收购服务（ISAAA）网站报道，数十种使用 RNAi 基因工程开发的抗病毒转基因作物已获准商业发行（http:/www.isaaa.org/）。在过去 10 年中，已有成功应用 RNAi 控制病原真菌和卵菌的报道。2010 年，研究人员首次通过在转基因烟草植株中表达 dsRNA，成功沉默轮枝镰刀菌 Fusarium verticillioides转基因菌株的-glucuronidase（GUS）报告基因。随后，有文章报道，在应用 HIGS 技术生产的转基因小麦、大麦和拟南芥中小麦白粉病菌 Blumeria graminis 和禾谷镰刀菌Fusarium graminearum 的侵染速度变慢，采用同样的方法还可抑制尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 对香蕉的侵染。在疫霉的 RNAi 研究中，转基因 dsRNA 序列的稳定表达成功沉默了致病疫霉 Phytophthora infestans 和寄生疫霉 Phytophthora parasitic 的靶基因。但是，也有 RNAi 未起作用的报道，在表达 PnPMA1 dsRNA 的转基因拟南芥中，HIGS 介导的寄生疫霉沉默未能成功启动。由于转基因植株培育时间较长，不需培育转基因植株的喷雾诱导基因沉默（SIGS）逐渐步入人们视野。随后，SIGS 被 证 明 可 有 效 防 治 禾 谷 镰 刀 菌 F.graminearum、灰霉 病 菌 Botrytis cinerea 和 油 菜 菌 核 病 菌 Sclerotinia sclerotiorum 等。研究发现，外源喷施 dsRNA 对于防治灰霉病菌、菌核病菌、立枯丝核菌 Rhizoctonia solani、黑曲霉Aspergillus niger 和大丽轮枝菌 Verticillium dahliae 效果较好，但对于卵菌（如致病疫霉）效果一般。dsRNA 可以通过根或树干进入植物维管系统（木质部和韧皮部），但其通过不同植物组织的吸收效率不同。南京农业大学杀菌剂生物学团队证明了小麦胚芽鞘完整表面较难吸收 dsRNA，而创面则能有效吸收 dsRNA。尽管有关 RNAi 技术的基础研究热度不断提升，但是其大规模应用仍有很多需要克服的难关。常见的阻碍有脱靶效应、RNA 分子的稳定性和成本等。本文将着重分析影响 RNAi 效率的因素，虽然这些观点与前人的观点存在些许差异，但是可以解释 RNAi 杀菌剂商业化难的原因。由于作用机制不同，我们将分开讨论 HIGS 和 SIGS 中 RNAi 效率影响因素。首先介绍 HIGS 中 RNAi 效率的影响因素。HIGS 中，RNA分子是由转基因植株产生的，因此其 siRNA 浓度是由植物RNAi 系统相关酶及 dsRNA 的表达程度决定的。许多因素可以影响植物中 dsRNA 的表达，如启动子强度、dsRNA 的长度和结构以及植物基因组的特征。在大多数研究中，科研工作者采用组成型强启动子转录 dsRNA，并利用内含子间隔正义和反义RNA 序列，形成发卡结构 RNA（HairpinRNA,hpRNA），以期高效表达 dsRNA。然而，有研究发现，这种传统的 hpRNA 设计会造成 dsRNA 转录的自沉默，而用胸腺嘧啶替代胞嘧啶可以防止自沉默，且不影响 hpRNA 的形成，达到高效沉默的目的。值得注意的是，不同真核生物的 Dicer 蛋白家族在结构域的结构和分子功能上表现出明显的多样性。不同物种中的 DicerM市场纵横 Market和 DCL（Dicer-like protein）在 RNA 靶标偏好、siRNA 产物长度和特定相互作用对象方面也存在差异。因此，尽管 dsRNA相同，植物细胞与真菌细胞体内切割产生的 siRNA 却不同。所以，当植物产生的 siRNA 被真菌吸收并利用真菌 Argonaute蛋白诱导 RNA 沉默时，RNAi 效率可能会降低（图 1）。有报道称，靶向相同基因的 dsRNA 和 siRNA 都可以降低基因表达，但在赤拟谷盗 Tribolium castaneum Herbs 中，只有使用 dsRNA 才能观察到 RNAi 介导的表型变化。事实上，高浓度siRNA 并不代表拥有高效率 RNAi。这是因为 HIGS 的触发主要决定于 siRNA 的吸收浓度。虽然植物可以通过细胞外囊泡向宿主诱导的基因沉默（HIGS）中，植物细胞核中产生发夹（hpRNA），经DCL1切割后产生siRNA，siRNA进入真菌细胞后发挥作用。喷雾诱导基因沉默（SIGS）中，一部分的 dsRNA 进入植物细胞中，经 DCL2/4（具体机制未知）切割后产生 siRNA，siRNA 同样进入真菌细胞中发挥作用；另一部分的dsRNA经胞吞作用直接进入真菌细胞中，经Dicer切割后产生siRNA，siRNA与互补的mRNA结合后，靶标 mRNA 会被沉默复合体（RISC）剪切，最终 mRNA 降解。影响 RNAi 效率的主要因素：真菌菌丝主要通过菌丝顶端的内吞作用摄取 dsRNA，摄取效率有限；siRNAs 分子量较大，不可直接通过细胞壁细胞，可能通过细胞壁上的孔隙进入胞内，效率低；RNA依赖性 RNA 聚合酶（RdRP）参与次级小 RNA 的产生与复制，进一步增强和放大沉默效应。不同生物中 RdRP 扩增效率相差较大；真菌中存在其它可以影响 RNAi 效果稳定性的调节因子。（图 1 影响 RNAi 效率的因素）3233M市场纵横 MarketHIGS）、喷 雾 诱 导 的 基 因 沉 默（spray-induced gene silencing，SIGS）以及病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）。农业领域首个商业化 RNAi 产品是可以表达 dsRNA 的转基因玉米，通过表达靶向 Snf7 基因的发夹 dsRNA 来控制西方玉米根虫。该商品于 2017 年获得 EPA 批准，已经以商品名 SmartStax Pro 在 2022 年上市（https:/ 5 编码基因（PSMB5）的长链 dsRNA 生物农药活性成分，名为 Ledprona，即将获得美国登记。2 核酸杀菌剂在植物病害防控中的应用与瓶颈在 RNAi 被用于病害防控的最初阶段，RNAi 对病毒性病害的防控是众多研究者探究的热点内容。科研人员分别开发了4 类基于 RNAi 的抗病毒技术：正义链诱导的转录后基因沉默（S-PTGS）、发夹 RNA 诱导的 PTGS（hp-PTGS）、人工 miRNA诱导的 PTGS（AMIR）和反式作用 siRNA 诱导的 PTGS（TAS）。利用上述技术培育了可以表达 sRNA 的转基因植株，并分别在实验室和田间条件下进行了测试，发现部分转基因植物获得了对病毒的持久抗性。据国际农业生物技术应用收购服务（ISAAA）网站报道，数十种使用 RNAi 基因工程开发的抗病毒转基因作物已获准商业发行（http:/www.isaaa.org/）。在过去 10 年中，已有成功应用 RNAi 控制病原真菌和卵菌的报道。2010 年，研究人员首次通过在转基因烟草植株中表达 dsRNA，成功沉默轮枝镰刀菌 Fusarium verticillioides转基因菌株的-glucuronidase（GUS）报告基因。随后，有文章报道，在应用 HIGS 技术生产的转基因小麦、大麦和拟南芥中小麦白粉病菌 Blumeria graminis 和禾谷镰刀菌Fusarium graminearum 的侵染速度变慢，采用同样的方法还可抑制尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 对香蕉的侵染。在疫霉的 RNAi 研究中，转基因 dsRNA 序列的稳定表达成功沉默了致病疫霉 Phytophthora infestans 和寄生疫霉 Phytophthora parasitic 的靶基因。但是，也有 RNAi 未起作用的报道，在表达 PnPMA1 dsRNA 的转基因拟南芥中，HIGS 介导的寄生疫霉沉默未能成功启动。由于转基因植株培育时间较长，不需培育转基因植株的喷雾诱导基因沉默（SIGS）逐渐步入人们视野。随后，SIGS 被 证 明 可 有 效 防 治 禾 谷 镰 刀 菌 F.graminearum、灰霉 病 菌 Botrytis cinerea 和 油 菜 菌 核 病 菌 Sclerotinia sclerotiorum 等。研究发现，外源喷施 dsRNA 对于防治灰霉病菌、菌核病菌、立枯丝核菌 Rhizoctonia solani、黑曲霉Aspergillus niger 和大丽轮枝菌 Verticillium dahliae 效果较好，但对于卵菌（如致病疫霉）效果一般。dsRNA 可以通过根或树干进入植物维管系统（木质部和韧皮部），但其通过不同植物组织的吸收效率不同。南京农业大学杀菌剂生物学团队证明了小麦胚芽鞘完整表面较难吸收 dsRNA，而创面则能有效吸收 dsRNA。尽管有关 RNAi 技术的基础研究热度不断提升，但是其大规模应用仍有很多需要克服的难关。常见的阻碍有脱靶效应、RNA 分子的稳定性和成本等。本文将着重分析影响 RNAi 效率的因素，虽然这些观点与前人的观点存在些许差异，但是可以解释 RNAi 杀菌剂商业化难的原因。由于作用机制不同，我们将分开讨论 HIGS 和 SIGS 中 RNAi 效率影响因素。首先介绍 HIGS 中 RNAi 效率的影响因素。HIGS 中，RNA分子是由转基因植株产生的，因此其 siRNA 浓度是由植物RNAi 系统相关酶及 dsRNA 的表达程度决定的。许多因素可以影响植物中 dsRNA 的表达，如启动子强度、dsRNA 的长度和结构以及植物基因组的特征。在大多数研究中，科研工作者采用组成型强启动子转录 dsRNA，并利用内含子间隔正义和反义RNA 序列，形成发卡结构 RNA（HairpinRNA,hpRNA），以期高效表达 dsRNA。然而，有研究发现，这种传统的 hpRNA 设计会造成 dsRNA 转录的自沉默，而用胸腺嘧啶替代胞嘧啶可以防止自沉默，且不影响 hpRNA 的形成，达到高效沉默的目的。值得注意的是，不同真核生物的 Dicer 蛋白家族在结构域的结构和分子功能上表现出明显的多样性。不同物种中的 DicerM市场纵横 Market和 DCL（Dicer-like protein）在 RNA 靶标偏好、siRNA 产物长度和特定相互作用对象方面也存在差异。因此，尽管 dsRNA相同，植物细胞与真菌细胞体内切割产生的 siRNA 却不同。所以，当植物产生的 siRNA 被真菌吸收并利用真菌 Argonaute蛋白诱导 RNA 沉默时，RNAi 效率可能会降低（图 1）。有报道称，靶向相同基因的 dsRNA 和 siRNA 都可以降低基因表达，但在赤拟谷盗 Tribolium castaneum Herbs 中，只有使用 dsRNA 才能观察到 RNAi 介导的表型变化。事实上，高浓度siRNA 并不代表拥有高效率 RNAi。这是因为 HIGS 的触发主要决定于 siRNA 的吸收浓度。虽然植物可以通过细胞外囊泡向宿主诱导的基因沉默（HIGS）中，植物细胞核中产生发夹（hpRNA），经DCL1切割后产生siRNA，siRNA进入真菌细胞后发挥作用。喷雾诱导基因沉默（SIGS）中，一部分的 dsRNA 进入植物细胞中，经 DCL2/4（具体机制未知）切割后产生 siRNA，siRNA 同样进入真菌细胞中发挥作用；另一部分的dsRNA经胞吞作用直接进入真菌细胞中，经Dicer切割后产生siRNA，siRNA与互补的mRNA结合后，靶标 mRNA 会被沉默复合体（RISC）剪切，最终 mRNA 降解。影响 RNAi 效率的主要因素：真菌菌丝主要通过菌丝顶端的内吞作用摄取 dsRNA，摄取效率有限；siRNAs 分子量较大，不可直接通过细胞壁细胞，可能通过细胞壁上的孔隙进入胞内，效率低；RNA依赖性 RNA 聚合酶（RdRP）参与次级小 RNA 的产生与复制，进一步增强和放大沉默效应。不同生物中 RdRP 扩增效率相差较大；真菌中存在其它可以影响 RNAi 效果稳定性的调节因子。（图 1 影响 RNAi 效率的因素）3435M市场纵横 Market病原真菌运送 sRNA，但除此之外，真菌中的 RNAi 效率还会受到 siRNA 特性的影响。研究者发现，由于植物质体中不存在RNAi，因此在植物质体中表达 dsRNA 可以排除植物 RNA 干扰相关元件对 dsRNA 的切割，从而避免与不同物种间 RNAi 的差异性，这或许可以解决由 siRNA 差异导致的 RNAi 效率差的问题。除了技术因素之外，基于 HIGS 的转基因作物产业化还受到国家政策的限制。HIGS 类转基因作物在抗虫、抗病上存在较大优势，但也存在一些隐患，例如基因漂流、基因污染、抗生素标记基因转移等。因此，我国对转基因作物产业化十分谨慎，并制定了相关转基因法律法规和管理规范进行风险控制。最新研究表明，SIGS 中 RNAi 效率影响因素比 HIGS 中更复杂。喷施在植物表面的 dsRNA 分为直接和间接两种方式进入真菌体内：直接途径为 RNA 直接被真菌细胞吸收；间接途径为 RNA 首先被植物细胞吸收，然后运输到真菌细胞中。不同途径吸收的 RNA 以不同的机制发挥作用，真菌细胞直接吸收的 RNA 直接引发了真菌 RNAi 机制；而植物细胞吸收的 RNA先引发了植物 RNAi 机制，进而引发了真菌的 RNAi 机制（图1）。如前文所述，喷洒在胚芽鞘完整表面的 dsRNA 不能被胚芽鞘吸收，而可能是直接被真菌细胞吸收。因此，dsRNA 只可在短时间内发挥作用，并不能提高植物的抗病能力。南京农业大学杀菌剂生物学团队发现亚洲镰刀菌 F.asiaticum 中由 dsRNA 引发的 RNAi 效应仅可持续约 9h，这是因为亚洲镰刀菌无法扩增产生次级 siRNA。siRNA 在生物体内的二次扩增与 RdRP 直接相关，RdRP 通过将单链 RNA 转化为 dsRNA 或合成siRNA 来进一步增强和放大 RNAi 效果。迄今为止发现的所有RdRP 都是从一个祖先 RdRP 进化而来，在植物、真菌和部分动物中发现了许多同源物。在许多后生动物中也发现了 RdRP 的同源物，比如线虫纲（秀丽隐杆线虫）、刺胞动物门（水螅Hydra）、螯肢动物亚门（蜱 Tick）、半索动物门（囊舌虫Acornworm）、尾索动物亚门（海鞘 Seasquirt）；但在其他类群中，例如扁形动物门（涡虫 Planaria）、六足亚门（果蝇 Drosophila）或脊椎动物门（脊椎动物 Vertebrates）等基因组中却无发现。有趣的是，禾谷镰刀菌 F.graminearum中至少存在 5 个 RdRP，但其 siRNA 的二次扩增并不充分。此外，dsRNA 的递送效率和稳定性同样影响 RNAi 效率，这是因为 dsRNA 在递送至靶标生物的过程中十分容易受到酶或 pH 值等因素的影响而降解。为了解决此类问题，科研人员将核酸序列包埋在特定的材料中，形成核酸-材料复合体，不仅成功提高了核酸稳定性、增加了递送效率，有些材料还可以起到增效的作用。目前常见的包被系统为脂质体、病毒样颗粒、复合纳米颗粒和生物粘土，根据待递送的 RNA 类型、靶生物及其摄取机制选取合适的包被系统。从上文中我们不难看出，HIGS 和 SIGS 最终的关键步骤均为诱导真菌细胞的基因沉默。但是，dsRNA 或 sRNA 分子进入真菌时会被细胞壁和细胞膜阻隔。真菌细胞壁在真菌与环境的相互作用中发挥着重要作用。真菌细胞壁结构比较复杂，通常由几丁质、-1,3-和-1,6-葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质组成，不同真菌细胞壁组成成分差异较大。以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 为例，甘露糖蛋白是酵母细胞壁的重要组成成分，决定了细胞壁的孔隙度，研究表明，在分子自然折叠的情况下，酵母细胞壁可阻挡大于 600Da 的分子进入。20-nt siRNA 的分子质量约为 6569Da，在自然折叠的情况下，分子粒径远大于细胞壁的孔隙度。这也就意味着，dsRNA 或 sRNA 很难通过正常的细胞壁表面进入细胞内。之前的研究表明，除非使用转化技术，如原生质体介导的转化、农杆菌介导的转化、电穿孔、生物方法和冲击波介导的转化，否则几乎不可能将遗传信息（质粒或基因）运输到真菌细胞中。但是，这并不意味着 sRNA 或 dsRNA 绝对不能穿过细胞壁。研究表明，酿酒酵母表面分布有直径在 50 250nm 之间的孔隙。351 个核苷酸的 RNA 平均截面长度为（43.64.6）nm，头部直径测量为（17.03.6）nm。如此看来，短一些的 dsRNA 和sRNA 有可能通过孔隙进入真菌细胞（图 1），但是据我们观察这个效率极低。在许多真核生物中，胞吞作用也参与了 dsRNA 的摄取。最近的研究证实，核盘菌中 dsRNA 的摄取是通过网格蛋白介M市场纵横 Market导的内吞作用发生的。内吞作用是生物体内重要的生物活动，指的是通过质膜的变形运动将细胞外物质转运入细胞内的过程。强有力的证据表明，内吞作用在菌丝顶端占主导地位，在快速生长的菌丝中，肌动蛋白斑块集中在菌丝顶端，形成一个顶端下环，与分泌为主的尖端空间耦合。因此，快速延伸的菌丝顶端具有更有效的内吞作用。我们的研究结果与上述理论一致，Myo5-8dsRNA 诱导的表型出现在亚洲镰刀菌和禾谷镰刀菌菌丝顶端。据报道，RNAi 信号可以在植物不同细胞间转移，但在禾谷镰刀菌中，大多数 RNAi 相关表型仍表现在顶端细胞中。除此之外，真菌中还存在其他可以影响 RNAi 效率的因素。之前的研究表明，将 dsRNA 负载于纳米颗粒上可提高其稳定性和效果。但是，增强 dsRNA 的稳定性并不能完全提高 RNAi效率的稳定性，这是因为还存在另外可以降低 RNAi 效率的复杂机制。在这里，我们讨论的 RNAi 效率的稳定性并不是指体外合成的 dsRNA 或 sRNA 分子的稳定性，而是体内 RNA 干扰效率的稳定性，即对靶基因的沉默效率稳定性。RNAi 效率受多种因素影响，同一物种的不同转录本及基因型、同一转录本的不同区域，甚至是观察表型效果的不同时间都有可能观察到不同的 RNAi 效率。在精心控制试验变量的条件下，经常会得到重复率低甚至前后矛盾的结果。研究发现，靶标 mRNA 的表达调控、靶标mRNA的二级结构、sRNAs的数量与序列特异性，以及 dsRNA 效应因子等因素都可以影响 RNAi 效率。首先，不同的 mRNA 在丰度、表达时间和空间上存在显著差异。不难想象，如果靶标 mRNA 表达高且易变，那么它就不容易被沉默。对鳞翅目昆虫的 RNAi 试验分析显示，在 130 个被测试的基因中，高水平沉默的占 38%，低水平沉默的占 14%，完全没有沉默的占 48%。其次，基因沉默效率与靶标位点局部的 mRNA 结构呈负相关，该结构可以通过氢键（H-b）指数（结构因子的单一参数）来表征。这也就解释了为什么 dsRNA 或 siRNA 的基因沉默效率会因 mRNA 的靶向位置而产生巨大的差异。有趣的是，所有关于 dsRNA 位置效应的报道都有一个共同点没有在 dsRNA 同源区域之外发现 siRNA。再者，有效切割的必备条件为碱基配对序列的中间序列完全互补（种子序列），只有完全互补才能被 PIWI 域切割。这一点在同为小分子 RNA的 miRNA 动力学研究中被证实。通过 miRNA 动力学分析可得出，低丰度的 miRNA 一般不能产生有生物学意义的调控，因为它们的浓度低于核心匹配靶点的解离常数（Kd 值）（小鼠AGO2为 3.7pmol/L，果蝇 AGO2为 20pmol/L）。最后，RNAi 过程还受到其他因素的调控，如 siRNA 降解酶和 RNAi 调节因子ERI-1 至 ERI-9。到目前为止，尚不清楚调控 RNAi 效率变化的真正机制。3 核酸杀菌剂对传统杀菌剂的影响目前，生产中植物病原真菌的防治主要依靠化学杀菌剂，但因其使用时间长、使用范围广等，导致农药残留、抗药性等负面问题频发。基于 RNAi 的核酸农药特异性高、无残留，更符合当今社会对于环境友好农药的需求，因此成为潜在的新型绿色植保产品，引起了当前市场