GB∕T 30987-2020 植物中游离氨基酸的测定.pdf

ICS 07.080 A 40 喧嚣中华人民共和国国家标准GB/T 30987-2020 代替GB/T30987-2014 植物中游离氨基酸的测定2020-03-31发布Determination of free amino acids in plant 国家市场监督管理总局告京国家标准化管理委员会.(x.II 2020-03-31实施GB/I 30987-2020 目次前言.a.1 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.,.1 4 全自动氨基酸分析仪法(第一法).5 高效植相色谱法第二法6 液相色谱-串联质谱法第三法).9 附录A(资料性附录氨基酸化合物信息及定量限.13 附录B(资料性附录)21种氨基酸泪合标准工作榕液色谱图.14 附录C(资料性附录液相色谱-串联质谱参数参考条件.18 G/T 30987-2020 前本标准按照GB/T1.1-2009结出的规则起草。本标准代替GB/T30987-201498%。5.2.8 氨基酸标准品，见4.2.1505.2.9 快速定量植纸g5.2.10 0.45m水相撑腰。5.2.11 0.45m有机相撞膜。5.3 仪器设备5.3.1 高效植相色谱仪(HPLC):配备荧光桂测器。5.3.2 分析天平:感量0.0001 g和0.01mg.5.3.3 桶旋tm句器。5.3.4 草草擅器z量程分别为10L-100L.20L200L和100Ll000L.GB/T 30987-2020 5.4 样品见4.4，5.5 试瞌步骤5.5.1 理合氨基瞪标准工作禧液配制见4.5.1.2，5.5.2 衍生试剂的配制5.5.2.1 6-氨基睡体-N-捏基辅蛐酷亚脏基氨基甲酷醋语班称取6-氨基喳琳-N-是基玻菌曹先亚腊基氨基甲酸酶3.0mg，用1.0mL乙脯榕解，加盖密封，祸旋植合105，置于55C棋箱中加热，直到衍生试剂充分榕解，取出备用a5.5.2.2 衍生用缰呻嚣擅配制称取无水棚砂10.06g.加水需解并定容至250mL，用磷酸调节pH至8.8，0.45m水相撞膜过撞后，即得0.20mol/L的珊砂盐缓冲液，备用。5.5.3 流动相配制5.5.3.1 800 mmol/L瞩醋氢二铀储备班配制称取113.568g无水磷酸氢二铺，溶解于800mL水中，如热需解，冷却至室温后用水定容至1000mL,0.45m水相撞膜过滤后备用，溶液pH约为8.90，5.5.3.2 800 mmol/L瞩酷二氧锦储备擅配制称取108.872g无水磷酸二氢悍，需解于800mL水中，加热禧解，冷却至室温后用水定容至1000mL,0.45m水相撑腰过滤后备用，溶液pH约为4.28，5.5.3.3 1 mol/L的盐酸三Z脏水溶擅配制取137.650g盐酸三乙膛，用水需解并定容至1000 mL，0.45m水相滤膜过温后备用自5.5.3.4 甜甜相A(80mmol/L磷酷盐辑冲擅配制准确移取800mmol/L瞬酸二氢伺储备被95mL.800 mmol/L磷酸氢二锅储备掖5mL.1 mol/L 的盐酸三乙胶水禧液10mL,54 mL乙睛，于1000 mL容量瓶中，用水定容至1000 mL.混匀，超声脱气10min后备用。5.5.3.5 流动相8(80mmol/L酶酸盐锺冲班)Ii!制准确移取800mmol/L磷酸二氢饵储备液100mL到1000 mL容量瓶中，加入水250mL.加入乙睛500mL.用水定容至1000 mL.混匀，起声脱气10min后备用。5.5.4 试样提取见4.5.4。GB/T 30987-2020 5.5.5 衍生化操悻移取制备好的样品禧植或标准工作陪檀10L于洁净的玻璃内插管中，加入衍生用理冲禧擅70碎，然后加入衍生试剂20L.祸旋握合10s，:JJU盖密封于进样拖中，在室温下静置1min，转移至55C烘箱中加热10min，取出待测，5.5.6 测定5.5.6.1 章相色谱参考条件鞭相色谱参考条件如下:a)色谱柱:C18，5m，4.6mmX250 mm，或同等性能的色谱柱sb)流动相:具体梯度洗脱程序见表3;c)荧光检测器参数:撒发擅长250nr口，发射世长395nm;d)柱温:35C I e)流速:1mL/min;D 进样体租:5L.表3高效擅相色谱法洗脱程序流动相时间/minA/%。100.0 5 100.0 25 97.3 40 81.2 55 74.4 67 50.2 70 0.0 75。.077 100.0 5.5.6.2 结制幅准工作曲娃B/%0.0 0.0 2.7 18.8 25.6 49.8 100.0 100.0 0.0 启动高效植相色谱仪，设定工作参盘，待基钱稳定后，分别吸取不同榷度的系列f昆合氨基酸标准工作禧鞭，按照5.5.5规定进行衍生化操作.衙生化完毕后，注入高效液相色谱仪进行测定，分别得到21种氨基酸的峰面积。分到以各氨基酸峰面积为纵坐帽，融度为横坐标，建立标准工作曲线。通过保留时间识别各氨基酸出峰顺序。在上述色谱条件(见5.5.6.1)下，温合组基酸标准工作榕植色谱图参见附录B中图B.2o5.5.6.3 样晶测量样品禧擅与标准工作带砸在相同条件下进行荷生化和测定操作衙生完毕的样品建议在48 h内完成测定)，分别得到样品中各氨基酸色谱峰面积，代人标准工作曲线计算啻量，以水作为空白样品，在相同测定条件F进行衙生化和测定，计算空白样品中各氨基酸本底值。样品割定值扣除空白样品中各靠基酸本鹿值，即得各样品中氨基酸净含量。GB/T 30987-2020 5.5.6.4 方法定量限方法定量限参见附录A中表A.lo5.6 试瞌跑据处理样品中各游离氨基酸含量的计算见式(2):W.=(c-c)XVXMXI0 X 100.(2)m;飞ml式中:W2一一试样中各氨基酸组分的吉量，单位为毫克每100克(mg/l00g)0 c 一一试样禧檀中由括准工作曲线计算出的氨基酸榷度，单位为纳摩均可每毫升(nmol/mL)。Ck 空白试样禧被中由标准工作曲线计算出的氨基酸榷度，单位为纳摩如每毫升(nmol/mL)。V一一试样总体积，单位为毫升(mL)。M一一盘基酷的摩如质量，单位为克每摩尔(g/mol),m-一试样质量，单位为克(g).mj一一试样干物率，测定方法见GB/T8303.以两测定的算术平均值作为测定结果，结果精确至0.01mg/100 g.5.7 精密度在重复性条件下在得的两次拍立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的12%6 班相色晴-串联匮谱法(第三法6.1 原理样品经沸水漫泡提取后过墟，撞撞经稀释后进样，液相包谱-串联质谱仪测定，外标工作曲线法庭量。6.2 试押t材料除另有规定外，本方法所用试剂均为优辑纯。水为符合GB/T6682规定的一级水。6.2.1 甲酸髓。6.2.2 榷盐酸.6.2.3 甲醇z色谱纯，6.2.4 甲酸:色谱纯E6.2.5 乙脯z色谱纯o6.2.6 氨基酸标准晶，见4.2.1506.2.7 快速定量撞纸B6.2.8 0.45m水相撞膜。6.2.9 0.45m有机相撞膜。6.3 仪器设备6.3.1 掖相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS):配电喷雾离子拥(ESD0 6.3.2 电子天平z感量为0.0001 g和0.01mg.9 GB/T 30987-2020 6.3.3 高速离心机z最高转速大于或等于15000 r/min.6.3.4 涡旋棍句器。6.3.5 移植器z量程分别为10L-100L，20L-200L和100L-1000L.6.4 样晶见4.4.6.5 过瞌步骤6.5.1 溶灌配制6.5.1.1 0.1 mol/L盐噩噩擅取被盐酸9.0mL，倒人预先盛有适量水的试剂瓶中，用水稀悻至1000mL.温匀。6.5.1.2 50%Z脯禧灌取乙腊500mL，加水500mL，$.匀e6.5.1.3 理合氨基酷标准储备擅配制称取各氨基酸标准品适量(精确到0.01mg)，用0.1mol!L盐酸禧砸瞎解井配制成各氨基酸质量地度均为1000 mg/L的提合氨基酸栋准储备液，于o.C-4.C下保存，有效期为1个月。6.5.1.4 理合氨基酷标准中间灌配制准确咂取1.0mL tl昆合氨基酸标准储备植于10mL睿量瓶中，用0.1mol/L盐酸禧液稀释井定容至刻度，捏匀，配制成质量地度均为100mg/L的混合氨基酸标准中间鞭，现配现用E6.5.1.5 混合氨基醋悻准工作需班配制准确眼取1.0mL混合氨基酸标准中间被于10mL容量瓶中，用50%乙腊溶檀稀释井定睿至刻度，棍匀，即得第一份标准培植。将第一份标准椿掖用50%乙腊槽液逐级稀释，制成总共7个不同榷度的系列tli合标准工作溶液。7个故度的提合标准工作禧液中21种氨基酸的质量雄度均为10mg/L、5.0 mg/L、2.5mg/L、1.0mg/L、0.50mg/L、0.25mg/L、0.10mg/L，现配现用。6.5.2 流动相配制6.5.2.1 200 mmoI!L甲酷撞语班配制韩取12.612g甲酣髓，带解于1000mL*中，用甲酸调节pH至3.0.6.5.2.2 甜甜帽AC20mmol/L甲酷桂水嚣擅配制准确移取100mL 200 mmol/L甲酸镜串鞭，加入900mL水，混匀，6.5.2.3 施动相8(20mmol/L甲酷锺-z噩噩灌配制准确移取100mL 200 mmol!L甲酸佳禧液，加入900mL乙脯，捏句。6.5.3 谊样提E试样提取挂4.5.4规定执行自移取1mL提取罹于10mL容量瓶中，用50%乙腊梅液稀释井定容GB/T 30987-2020 至刻度，混匀，取2mL稀释被于4C 14 000 r/min下离心10min，取适量上清液待测。6.5.4 测定6.5.4.1 擅捆色谱参考条件被相色惜参考-条件如下za)色谱柱:HILIC-Z,2.7m，2.1 mmX150 mm，或同等性能的色谱柱Fb)流动相z具体梯度洗脱程序见表4;c)流速:0.5mL/min;d)柱温:25 C 1 巳进样量:1L。襄4遭相色谱串联质谱娃班脱程序时间/minO 11.5 12 30 6丘4.2质谱.考条件质谱参考条件如下=a)离子源z电喷雾离子源50:1:20 nU Fhu 岛湖一土10-20 士30运10土506.5.4.6 方法定量限方法定量限参见附录A中最A.1.6.6 试验敢据处理样品中各游离萤基酸啻量的计算见式(3):w.=ex V X 10-3 X 100 3-m X ml.(3)式中:Ws一一试样中各氨基酸组分的含量，单位为毫克每100克(mg/100g)。p 试样溶檀中由标准工作曲统计算出的氨基酸质量推度，单位为毫克每升(mg/L)V一一试样总体积，单位为毫升(mL)。m一一试样质量，单位为克(g)。叫一一试样干物率，测定方法见GBjT8303.以两次测定的算术平均值作为测定结果，结果精确至0.01mg/l00 g.6.7 精密度在重复性条件下班得的两!虫立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的12%。12 GB/T 30987-2020 附录A(资料性附景)氨基踵化合物信息及定量限量E基酸化合物信息及定量限见表A.lo表A.1 氨基酷化合物信息及定量限序号中文名称英文法第gbill、且-闯一-法限一第量一定?25.00 12.50 50.00 50.00 50.00 12.50 25.00 25.00 50.00 12.50 12.50 12.50 25.00 12.50 12.50 12.50 25.00 12.50 25.00 25.00 12.50 1 丙氨酸3.03。，-qs4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 u-H-m 17 何一些明一时-明18.81 18 9.27 7.83 19 Tyr Val 41.79 10.47 4.65 20 72-18-4 I C;HI NO!117.15 21 13。国4S吐|MDND理蛐(国主博毒蛐)MZ寄回脚嚣描昨带悟H寄晴雨田踏国国NH草脚制跚跚前昨带斋hh有瑞抽阳军滴l路防瑞EH固国-T蜻们捋愤畴围回国国-N蜡川醉PE咐斟围回国四-7申幽脚跚跚B响阳陆民菌-EH国国品JE四-20JHAM-.也d 岳。sn 11.547 Asp 川町吁UAmtm a-AF飞CtlE I呻晴GEnu-147 RU-huo ibj 白F盯句a币aoa l 暗A回国CMM由胁。g FJZ FMO HMm HOO 围困-M.已2H 8 37.040 Oly 38.920 Ala 43.013 Yal 14.087 Cy 46.293 Mel 50.033 IIc 51.980 Lc 53.9201yr 57.280111e 110.401 Arg 65.520 GA 89.340 Lys 35.427 42.900 0.也n 8 Dh吕吕 8.0 g 8 N4茸睛阳圆睁嗣昨前静H寄辅南军鸭l路障酣睡圃抽nT啦圆睁搏闸uek#00国目。-Er制钟脚跚跚哥阁Sue吕口国窜。吃自F).冒 N ClI 13.765-Asp 44.487100 66.04llhc c.o ClI 同=.8 NZ膏制圆睁描昨葡诽H寄副博嚣鸭H路回跑囤(拙nt端圈圈器问ueMDD国目。-昌和地W圃蜘蹲班hmsueg目目。-目巴GB/T 30987-2020 3 Leu的MRM圄5.113 min s 2.5 2 0.5 1.5。5.8 I/min hu 且,A哇1 na 咽1 06 L 哼a5.6 5.4 6.2 4 19 2。3 5.4 t/min 5.2 2 5.076 min I 5 XlOi 3 2.75 2.5 2.25 2 1.75 1.5 1.25 1 O.75 0.5 0.25 说明21一-Phe;3一一-Leu;4-Met;5一-Tyr，6一一一Val;运X1Q3组否2一一-Ile;4.8 固B.固B.4iS X 10 宝4日3.53 2.5 2 1.5 1 0.5 0 8 5 2 1。4 3 EE2。r/min 15 6 Val的MRM固5.8 5.6 5.4 圄B.9Tyr的MRM圄圈B.8Met的MRM固固B.7GB/T 30987-2020 SX104 5.840 min g型tF X104 号iFE 4 0.8 3。.62 0.4 0.2。1-寸5.6 5.8 6 6.2 rJ I11In 6.8 6.124 min E 6.2 6.4.I/mm 固B.10Pro的MRM圄固B.11GABA的 MRM 圄MU X S迪普g 型 苦x 1 04 2 6.476 min 型tSEX10B 2 6.624 min is azF xld z 1.75 3.5 2 E 1.5 2.5 4 1.25 z 3 1.5 0.75 2 0.5 1 0.5 0.25。6.2 6.4 6.6 6.B dmn 6.2 6.4 6.6 6.8 711min 圄B.13Ala的MRM固固8.14Thr的MRM圄S XIO ggtz ax lOE S|7.197 min 1=4 4 3 3 2 2。7.4 I/mm。6.B 7 r-l 7.2 7.4 I/m.in 6.8 7 7.2 圄8.16G恒的MRM圈固8.17Ser的 MRM 固罢x时1=5 4 3 2 s,XIO 、电f:3.5 7.418 min 8.120 min 3 2.5 2 1.5。.5。7 7.2 7.4 7.6 7.8 的nln7.6 7.8 8 8.2 8.4!/min 固8.19Glu的MRM圄圄8.20Asp的MRM圄16 0.8 0.6。.40.2 O 6.187 min 5.8 6 6.26.46.6 I/min 圄B.12The的MRM圄6.939 min 6.6 6.8 7 7.2 IIrrun 固8.15Gly的MRM圄s X 10 1 7.228 min f墨誓S XlOf 主1.20.8 一一-，7.4 7.6 I/min 0.6 0.4 0.2。7 7.2 圄8.18Asn的MRM圄9.076 min。nM户枫uaa古晶nJ-n.nunonunu 8.6 8.8 9 9.2 9.4 I/m;n 圄8.21His的 MRM 固s.X 10.型向窑49.492min 1.76 1.6 1.25 1 0.75 0.5 0.25 o 9 9.2 9.4 9.6 9.8.I/mln 圄8.22Arg的MRM圄S Xl!t!主87 6 5 4 3 z o 10.008 min 9.6 I 10 圄8.23Cys的MRM圄404 hHM-X 割去蕃I/min nO户Uaazo-AU.AUAUhunu GB/T 30987-2020 10.046 min 9.8 10 10.2 10.4 tlmin 圄B.24Lys的MRM圄17 GB/T 30987-2020 附景C(萤料性附景灌捆鱼谱串联质谱参盘参考矗件质谱事考条件如下za)离子掘z电啧霎离子拥(ESI)I M 扫描方式:正离子模式pc)幢四方式E多重反应监测(MRM);d)干操气(N2)温度:230C,e)干煤气流速:11.0L/min,f)辅气温度:390c I g)喃气流速:12.0L/min;h)勇化气(N2)压力:0.14 MPa(20 psi)I i)毛细管电压:1500 V;j)性离子对、定量离子对、掘内碎裂电压、碰撞气能量见表C.l.囊C.121种氨基酷的定量离于对、定性离子对、碎型电压和碰撞气能量英文保留时间应量离子对定性离于对源内碎裂序号中文名称简写电压口11日m/z mlz V 1 丙氨酸Ala 6.48 90.0/44.1 90.0/42.1;90.0/44.1 50 2 精氨酸Arg 9.49 175.1/70.1 175.1/70.1;175.1/116.1 95 3 天冬酷膀Asn 7.23 133.1/74.0 133.1/74.0,133.1/87.1 70 4 天冬氨酸Asp 8.12 134.0/74.0 134.0/74.0,134.0/88.0 65 5 胧氨酸Cys 10.01 241.1/152.。241.1/73.9;241.1/152.0 90 6 t氨基丁酸GABA 6.12 104.1/87.1 104.1/69.1;104.1/87.1 65 7 谷氨酸胶Gln 7.14 147.1/84.0 147.1/84.0;147.1/130 70 8 谷氨酸Glu 7.42 148.1/84.0 148.1(84.0;148.1/130.1 70 9 甘氨酸Gly 6.94 76.0/48.1 76.0/30.1;76.0(48.1 00 10 组氨酸His 9.08 156.1/110.0 156.1/83.1,156.1/110.0 80 11 异亮氨酸Ile 4.47 132.0/86.1 132.0/69.1;132.0/86.1 70 12 亮氨酸Leu 4.75 132.1/86.1 132.1/44.11132.1/86.1 70 13 赖氨酸Lys 10.05 147.1/84.1 147.1/84.1;147.1/13日.175 14 置氨酸Met 5.08 150.1/104.0 150.1/104.0;150.1/133 75 15 苯丙氨酸Phe 4.06 116.11120.1 166.1/103.1,116.1/120.1 75 16 脯氨酸Pro 5.84 116.1/70.1 116.1/43.1;116.1/70.1 75 17 丝氨酸Ser 7.20 106.1/60.1 106.1/42.11106.1/60.1 65 18 荼氨酸The 6.19 175.2/158.1 175.2/84;175.2/158.1 75 18 碰撞气能量V 40;1 17,5 7;1 5,1 20;2 7;1 10;1 7;1 1;1 20,5 10;1 15;1 10,1 1;1 22;5 25,7 15d 15;1.,.GBjT 30987-2020 表C.l(续源内碎型碰撞气英文保留时间定量离子对定性离子对序号中文名称电压能量简写m/z m/z 19 20 21 1卫mV V;自;氨酸Thr 6.62 120.1/74.1 120.1/56.1,120.1/74.1 65 7d 酷氨酸Tyr 5.51 182.1/136.1 182.1/136.1,182.1/165.1 70 2d 缴氨酸Val 5.71 118.1/72.1 118.1/55.1;118.1/72.1 70 15;1 注z袭C.l所列参数在Agilent6465质谱仪上完成，此处列出试验用仪椿型号仅供参考，使用者可尝试采用不同厂家或型号的仪器.