基于PI3K_Akt信号通路探讨宣痹通瘀方对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的保护作用.pdf

老林中医药2023年11月第43卷第11期Jilin Journal of Chinese Medicine Nov.2023 Vol.43 No.11实验研究1321.DOI:10.13463/ki.jlzyy.2023.11.018基于PI3K/Akt信号通路探讨宣痹通瘀方对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的保护作用黄玉容，刘爱东，吕喜月，成光宇，李双娣，刘迎辉*（长春中医药大学，长春130 117）摘要：目的研究宣痹通瘀方对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法冠脉结扎法制备急性心肌缺血大鼠模型（假手术组只置手术线而不结扎）。造模成功的大鼠随机分为阳性对照组、心肌缺血模型组、宣痹通瘀方低、中、高剂量组以及宣痹通瘀方高剂量加LY294002（PI 3K 抑制剂，以下简称为LY）组。造模次日开始给药，宣痹通瘀方高、中、低剂量组灌胃给药体积相同、浓度不同。宣痹通瘀方高剂量加LY组除按照高剂量组给药方法灌胃给药以外，每日需皮下注射LY10mg/（k g d）。假手术组与模型组均给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠混悬液。对照组给予同体积麝香保心丸混悬液。每日灌胃给药1次，连续2 周。心肌组织取材，TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数；免疫组化法检测凋亡相关蛋白的表达；透射电镜下观察心肌细胞形态；WestermBlot检测磷酸化的PI3K、A k t 蛋白表达。结果宣痹通瘀方能够抑制心肌细胞凋亡（P0.01）；降低Caspase-9、Ca s p a s e-3、Bax蛋白表达（P0.01或P0.05），上调Bcl-2表达（均为P0.01）；保护心肌细胞超微结构；p-PI3K、p-A k t蛋白的表达显著增高（P0.01）。结论宣痹通瘀方可能通过调控PI3K/Akt信号通路抑制心肌细胞凋亡，从而对急性心肌缺血大鼠心肌发挥保护作用。关键词：PI3K/Akt；宣痹通瘀方；急性心肌缺血；心肌细胞凋亡中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：10 0 3-56 9 9(2 0 2 3)11-132 1-0 6Protective effect of Xuanbi Tongyu Recipe on myocardial cell apoptosis in rats with acutemyocardial ischemia based on PI3K/Akt signaling pathwayHUANG Yurong,LIU Aidong,LV Xiyue,CHENG Guangyu,LI Shuangdi,LIU Yinghui(Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)Abstract:Objective To study the effects of Xuanbi Tongyu Recipe on myocardial cell apoptosis in rats withacute myocardial ischemia.Methods A rat model of acute myocardial ischemia was established by coronary arteryligation(the sham operation group only set with surgical thread without ligation).The successfully modeled rats wererandomly divided into a positive control group,a myocardial ischemia model group,and low-,medium-,and high-dose groups of Xuanbi Tongyu Recipe,and a high-dose group of Xuanbi Tongyu Recipe+LY294002(PI3K inhibitor,hereinafter referred to as LY).The next day after modeling,the low-,medium-,and high-dose groups of XuanbiTongyu Recipe were administered by gavage with the medicine of the same volume yet different concentrations.The high-dose group of Xuanbi Tongyu Recipe+LY received a daily subcutaneous injection of LY(10 mg/kg/d),inaddition to a gavage administration according to the high-dose group administration method.Both the sham surgery基金项目：吉林省教育厅科研课题（JJKH20210947KJ）；吉林省中医药管理局科研课题（2 0 19 0 56）作者简介：黄玉容（19 9 8 一），女，硕士研究生，主要从事中医病因病机理论、中医药防治心血管疾病研究*通信作者：刘迎辉，电子信箱-10 2 9 9 0 6 143 1322group and the model group were given an equal volume of 0.5%sodium carboxymethyl cellulose suspension.Thecontrol group was given the same volume of Shexiang Baoxin Pills suspension.The medicines were given orallyonce a day for 2 consecutive weeks.Myocardial tissue samples were taken,and the apoptosis index of myocardialcells was detected by TUNEL method.Immunohistochemistry was used to detect the expression of apoptosis relatedproteins.The morphology of myocardial cells was observed under transmission electron microscope.Western blotwas used to detect the protein expressions of phosphorylated PI3K and Akt.Results Xuanbi Tongyu Recipe inhibitedthe cardiomyocyte apoptosis(P0.01),reduced the protein expressions of Caspase-9,Caspase-3 and Bax(P0.01or P0.05),and up-regulated the expression of Bcl-2(all P0.01),protected the ultrastructure of myocardial cells,significantly increased the protein expressions of p-PI3K and p-Akt(P0.01).Conclusion Xuanbi Tongyu Recipe mayinhibit the myocardial cell apoptosis by regulating the PI3K/Akt signaling pathway,thus playing a protective role onmyocardium in rats with acute myocardial ischemia.Keywords:PI3K/Akt;Xuanbi Tongyu Recipe;acute myocardial ischemia;myocardial cell apoptosis2022年美国心脏病学会杂志指出，心血管疾病仍是全球死亡的主要原因。缺血性心脏病在全球心血管疾病死亡原因中排名第一。仅2 0 2 1年缺血性心脏病就导致全球大约9 44万人死亡，而伤残调整寿命年约为1.8 5亿人年。中国心血管健康与疾病报告2021指出心血管疾病是我国城乡居民病死率最高的疾病。我国每5例死亡病例中就有2 例死于心血管疾病。据统计，我国现有心血管病患者大约3.3亿人，其中冠心病患者约为1139 万，仅次于脑卒中患者数量，排在第二位。西医治疗冠心病的方法主要包括药物治疗、手术治疗以及介入治疗等。手术治疗创伤较大，介入治疗容易出现支架后再狭窄等问题，且口服西药不良反应较大，治疗靶点相对单一，无法对疾病进行全方位的干预。中医药防治冠心病具有全方位、多靶点、不良反应小、安全可靠、灵活多样以及疗效确切等优势，积极开展中医药防治冠心病的研究具有积极意义。宣痹通瘀方由6 味中药组成，分别是人参、延胡索、川芎、郁金、三七和冰片。该方是吉林省名中医刘爱东教授根据多年临床经验总结而得。全方以“扶助正气，祛瘀生新”为治疗大法，经长期临床实践证明对辨治冠心病心绞痛疗效确切。本研究通过冠脉结扎法制备急性心肌缺血大鼠模型，以PI3K/Akt信号通路及心肌细胞调亡为机制研究的切入点，研究宣痹通瘀方对急性心肌缺血模型大鼠心肌的保护作用及机制，为防治冠心病提供新思路以及可靠的实验依据。1实验材料健康Wistar大鼠，购于辽宁长生生物技术有限公司，许可证编号：SCXK（辽）2 0 15-0 0 0 1。大鼠体质量为2 2 0 2 50 g。饲养于标准动物房。动物房温度2023 年 11 月第 43 卷第 11 期 Jlin Journal of Chinese Medine Nov.2023 Vol.43 No.11 去林中医药（2 3土2），相对湿度（45土10）%，通风换气采用导流风机与外界进行对流交换，昼夜自然光照。每笼饲养同一性别大鼠5只。自由饮食水。宣痹通瘀胶囊（长春中医药大学附属医院实验研究中心，批号：20141201），每粒胶囊含生药4.0 3g。麝香保心丸（上海和黄药业有限公司，国药准字：2 310 2 0 0 6 8），规格：每丸2 2.5mg。BL-42 0 S生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；正置显微镜（OLYMPUS公司）；摊片机（湖北康强公司）；切片机（徕卡公司）；IMS图像分析系统（武汉华联科公司）；HT7700透射电镜（日本日立公司）；电泳设备（BI O-R A D）；M K 3酶标仪（芬兰雷勃）；干式恒温器（杭州爽盛仪器）；离心机（德国Eppendorf）；全自动化学发光分析仪（上海天能）；超纯水器（法国MILIPORE）。LY2 9 40 0 2 抑制剂（S1105,selleckchem）；苏木素（PAB180015，Bi o s w a mp）；PBS（PA B18 0 0 0 3，Bi o s w a m p）；T U NE L细胞凋亡检测试剂盒（PAB180003，Bi o s w a mp）；D A B浓缩型试剂盒（PAB180021，Bi o s w a mp）；Ca s p a s-9 抗体（Ab52298，A b c a m）；Ca s p a s-3抗体（Ab4051,Abcam）；Ba x 抗体（Ab53154，A b c a m）；BC L-2抗体（Ab9348，A b c a m）；T E M E D（110-18-9,Sigma）；过硫酸铵（A6761，Si g m a）；PV D F转移膜（IPVH00010，m i l l i p o r e）；化学发光试剂(WBKLS0010,millipore）;T w e e n-2 0（P-137 9,Amresco）；R I PA（强）组织细胞快速裂解液（PA B18 0 0 0 6，b i o s w a mp）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（PAB180007，b i o s w a mp）；PBS磷酸盐缓冲液（PAB180003，b i o s w a mp）。老林中医药2023年11月第43卷第11期 Jilin Journal of Chinese Medicine Nov.2023Vol.43No.112实验方法2.1造模、分组及给药采用BL-420生物机能系统检测大鼠标准I导联心电图，筛选心电图大致正常的大鼠用于实验。采取快速开胸结扎冠状动脉前降支的方法进行造模，其中假手术组只置手术线而不结扎。实验动物结扎后采用BL-420生物机能系统检测大鼠的标准I导联心电图，观测ST段偏移幅度，以模型组大鼠心电图中ST段抬高0.2 mV作为造模成功的标志。手术完毕后，每只大鼠肌肉注射青霉素（4万u），连用3d，预防感染 3-4。随机将造模成功的大鼠分为：对照组、急性心肌缺血模型组、宣痹通瘀低剂量、中剂量、高剂量组以及宣痹通瘀高剂量加LY组。加上假手术组，一共7 组，每组8只，雌雄各半。各组于造模次日开始灌胃给药，每日1次，连续2周。宣痹通瘀方低、中、高剂量组给药浓度分别为 8 g/100 mL、16 g/10 0 mL、32 g/10 0 mL。对照组药物浓度为2 4mg/100mL。宣痹通瘀方高剂量加LY组除按照高剂量组给药方法给药以外，每日还需皮下注射 LY294002（PI 3K/A k t 抑制剂），10 mg/（k g d）5。急性心肌缺血模型组与假手术组给予0.5%CMCNa悬液灌胃。各组灌胃给药体积均为10 mL/kg。2.2实验指标检测2.2.1心肌细胞超微结构观察取大约1mm的心肌组织为样品。首先将样品在2.5%戊二醛中进行预固定，4固定30 min以上。再用0.1mol/LPBS缓冲液清洗3次，每次10 min。然后在1%钱酸中进行固定1h。再用0.1mol/LPBS缓冲液清洗3次，每次10 min。然后进行脱水。乙醇脱水：50%，5min;70%，5m in；8 0%，5m in；9 0%，5m in。丙酮脱水：90%，5m in；10 0%，4m in，共2 次。进行浸透和包埋，超薄切片机切片，染色。醋酸铀避光染色2 0 min，夹出铜网用双蒸水洗3次、吸干。枸橡酸铅避光染色15min，夹出载网，用双蒸水洗去多余铅液，滤纸吸干后即可。透射电镜下观察心肌细胞形态（50 0 0 10 000 倍）。2.2.2TUNEL法检测心肌细胞调亡指数采用原位缺口末端标记法（TdT-mediated dUTp nick endlabeling，TUNEL）检测心肌细胞凋亡指数。常规取材固定、洗涤脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，按照TUNEL细胞调亡检测试剂盒说明书操作进行。在样品上加入50 LTUNEL检测液，于37 避光环境下孵育6 0 min。1323.用PBS冲洗3次。加入50 L转化-POD于样品上，在湿盒中37 孵育30 min。用PBS冲洗3次。加入5010 0 LDAB底物，于152 5 孵育10 min。用PBS冲洗3次。苏木素复染脱水，透明，封片，显微镜下观察拍照，采用IMS图像分析系统分析相关样本部位。心肌细胞调亡率=调亡心肌细胞数/心肌细胞总数X100%。2.2.3免疫组化法检测调亡相关蛋白表达切取厚度约为0.2 0.3cm，大小约为1.5cm1.5cm0.3cm的心肌组织用于免疫组织化学检测。常规固定、包埋、切片、显色、封片。大鼠心肌细胞Caspase-3、Caspase-9、Ba x 和Bcl-2的阳性表达呈棕黄色定位于胞浆。通过显微镜拍照，IMS图像系统采集分析样本相关部位。分别计算 Caspase-3、Ca s p a s e-9、Ba x 和Bcl-2的表达水平。2.2.4Westerm Blot检测p-PI3K、p-A k t 蛋白表达提取心肌组织总蛋白，采用BCA法对蛋白浓度进行测定，制备SDS-PAGE胶，上样（每孔上样量为10 g蛋白），进行电泳。本实验采用湿转模。5%脱脂奶粉室温封闭2 h；一抗：根据说明书稀释抗体，4过夜孵育；二抗：孵育一抗的膜用PBST洗涤3次，每次5min。随后根据用量，按照1:10 0 0 0 稀释HRP标记的二抗，室温孵育1h。用PBST洗涤3次，每次5min。将膜置于全自动化发光分析仪中用ECL化学发光显色方法检测，通过TANONGIS软件读取相关条带灰度值。2.3统计学方法采用SPSS19.0软件进行统计分析，以均数土标准差（土s）表示实验数据，多组间数据比较采用单因素方差分析。3实验结果3.1宣痹通瘀方对各组大鼠心肌细胞超微结构的影响假手术组心肌细胞肌丝明暗带结构清楚，线粒体结构完整，岭饱满，内膜较多，排列有序，未见线粒体肿胀和空泡样变性。模型组心肌细胞肌丝明暗带消失，肌丝溶解，线粒体损伤比较严重，线粒体膜发生破裂肿胀，内膜出现大量断裂溶解，甚至出现空化。宣痹通瘀方高剂量组心肌细胞肌丝明暗带结构比较清楚，线粒体膜结构相对较完整，线粒体轻度肿胀，内膜有少量断裂溶解。宣痹通方中剂量组和低剂量组出现了肌丝的断裂溶解，线粒体膜出现少量破裂肿胀，内膜发生断裂溶解，1324.出现了空化，其中宣痹通瘀方低剂量组的心肌细胞超微结构破坏更加明显。宣痹通瘀方高剂量加LY组心肌细胞肌丝明暗带出现溶解消失，线粒体水肿较2023年11月第43卷第11期 Jilin Journal of Chinese Medicine Nov.2023Vol.43No.11老林中医药明显，线粒体膜发生破裂肿胀，线粒体断裂、水肿、出现空泡变性。阳性对照组心肌细胞结构基本正常。见图1。假手术组模型组宣痹通瘀方高剂量加LY组宣痹通瘀方高剂量组3.2宣痹通痧方对各组大鼠心肌细胞凋亡指数的影响宣痹通瘀方高、中、低剂量组及宣痹通瘀方高剂量加LY组大鼠心肌细胞调亡率与模型组比较，存在显著差异（P0.01）。宣痹通瘀方高剂量组与宣痹通瘀方高剂量加LY组大鼠的心肌细胞调亡率比较，差异性显著（P0.01）。各实验组心肌细胞调亡率见表1。表1各实验组大鼠心肌细胞调亡率比较（x土S，n=8）%组别假手术组模型组宣痹通瘀方高剂量加LY组宣痹通瘀方高剂量组宣痹通瘀方中剂量组宣痹通瘀方低剂量组阳性对照组注：与假手术组比较，拼P0.01；与模型组比较，P0.01；与宣痹通瘀方高剂量加LY组比较，P0.013.3宣痹通瘀方对各组大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白的影响与模型组比较，宣痹通瘀方高、中、低剂量组Caspase-9、Ca s p a s e-3、Ba x、Bc l-2 积分光密度值存在显著差异性（P0.01）。宣痹通瘀方高剂量加LY组Caspase-9、Ba x 积分光密度值与模型组比较，差异性显著（P0.01）；Bc l-2 积分光密度值与模型组比较，差异性显著（P0.05）；Ca s p a s e-3积分光密度值与宣痹通瘀方中剂量组图1电镜检测各组大鼠心肌细胞超微结构（50 0 0 10 0 0 0 倍）调亡率0.000.0054.732.51#46.299.25410.89 4.84 44414.80 5.11 420.594.356.21 3.43 44宣痹通瘀方低剂量组模型组比较，没有显著差异性。宣痹通瘀方高剂量组与宣痹通瘀方高剂量加LY组模型大鼠Caspase-9、Caspase-3、Ba x、Bc l-2 积分光密度值比较，两者差异性显著（P0.01）。见表2。3.4Westernblot检测磷酸化PI3K、A k t 蛋白表达3.4.1Westernblot检测磷酸化PI3K蛋白表达与模型组比较，宣痹通瘀方高、中、低剂量组的p-PI3K的表达均明显升高（P0.01）。宣痹通瘀方高剂量组p-PI3K表达与宣痹通瘀方高剂量加LY组比较，存在显著性差异（P0.01）。见图2。p-PI3K蛋白表达灰度值见图4。3.4.2Western blot检测磷酸化 Akt蛋白表达与模型组比较，宣痹通瘀方高、中剂量组p-Akt的表达均明显升高（P0.01）。宣痹通瘀方高剂量组p-Akt表达与宣痹通瘀方高剂量加LY组比较，存在显著性差异（P0.01）。见图3。p-AKT蛋白表达灰度值见图4。4讨论细胞凋亡与心血管疾病的相关性研究已成为研究的热点问题。大量研究资料表明，在缺血缺氧的条件下，细胞调亡是心肌细胞死亡的主要方式之一。在心肌缺血梗死的全过程之中，均有心肌细胞调亡的参与，并且心肌细胞凋亡的程度与心肌梗死的程度密切相关 18 1。阳性对照组老林中医药2023年11月第43卷第11期 Jilin Journal of Chinese Medicine Nov.2023Vol.43No.11表2 各实验组大鼠心肌组织切片Caspase-9、Ca s p a s e-3、Ba x、Bc l-2 积分光密度值比较（XS，n=8）组别假手术组模型组宜痹通瘀方高剂量加LY组2 16 59.8 337 2 7.8 9宣痹通瘀方高剂量组17 538.78 893.93 宣痹通瘀方中剂量组16 796.46 744.12 4宣痹通瘀方低剂量组20.971.77 408.88 阳性对照组14 840.51 719.29 4注：与假手术组比较，#P0.01；与模型组比较，P0.05，P P0.011.010.8Yeldyld-d0.6-0.40.2-0.0-假手术组模型组高剂量加LY组1325.Caspase-9Caspase-314 360.36305.8116 024.77 440.3425 521.67 2.920.73#24 847.44 1 674.83#24 614.581 147.1818 082.85 1 028.6644 19 547.03 1 029.664 23 865.63 457.95 4421 045.98815.95422 260.68 2 143.02 23 749.17 831.17 25 213.35 831.1718 013.43 1 116.75 419 477.61 1 116.75 44大量研究结果表明，PI3K/Akt信号通路在调控细胞的生长与增殖，以及抑制细胞凋亡、维持细胞生存的机制中起到重要的调节作用 2 15。众多研究证据表明，PI3K/Akt信号通路与多种心血管疾病的发病机制#相关，其研究重点主要集中在与心肌细胞调亡的密切相关性 16-17。Akt蛋白激酶具有抑制细胞凋亡的作用，Akt的磷酸化是PI3K/Akt信号通路抑制细胞凋亡的中心环节。活化的Akt能够进一步调控其下游的调亡蛋白，起到抑制心肌细胞凋亡的作用 18 。目前，关高剂量组中剂量组低剂量组阳性对照组Bax17346.09189.1528025.833281.85#26 507.33 997.19 422 510.18 815.974于PI3K/Akt信号通路保护机制研究较多的下游靶点主Bcl-223 897.802677.9420 026.18 811.83#19 508.97 431.94 22 097.96 1 365.48 422 863.61 1 212.26 44注：与假手术组比较，#P0.01；与模型组比较，P0.01；与宣痹通瘀方高剂量加LY组比较，P0.01图2 磷酸化PI3K蛋白表达1.010.8-0.60.4-0.20.0假手术组要包括Bcl-2蛋白家族、Caspase家族、糖原合成酶激酶3及一氧化氮合成酶等。Caspase家族的Caspase-3蛋白酶作为细胞凋亡的启动因子，在心肌细胞凋亡中起到关键作用，被公认为是细胞调亡过程的真正执行者19。Caspase-3 能够启动凋亡程序，使细胞以一种有序的形式产生解体。通过截断周围细胞和凋亡细胞之间的联系，关闭DNA复制和修复的程序，从而阻碍#RNA的剪接，使DNA发生降解，使细胞核结构的完整性遭到严重破坏，进而诱导细胞向外界发出信号，并使其被周围细胞所吞噬，被吞噬的细胞被解体、包低剂量高剂摄加L组裹进而形成调亡小体，最终形成细胞调亡。Bcl-2家阳性对照组注：与假手术组比较，#P0.01；与模型组比较，P0.01；与宣痹通方高剂量加LY组比较，P0.01图3磷酸化Akt蛋白表达假手术组模型组高剂量加LX组高剂量组中剂量组低剂量阳性对照组P-PI3KPI3KP-AKTAKTGAPDH图 4Westerm Blot 检测磷酸化 PI3K、A k t族蛋白参与细胞调亡的主要靶点在线粒体膜上。促调亡蛋白Bax能够使线粒体MPTP开放性增加，释放Cyt-C，从而激活Caspase-9，产生级联反应，促使细胞发生凋亡 2 0-2 1。LY294002 是一种人工合成的具有特异性的PI3K抑制剂，它能够通透细胞，抑制PI3K/Akt信号通路，从而抑制Akt的磷酸化 2 。本实验采用透射电镜下观察心肌细胞形态，TUNEL法检测各组心肌细胞凋亡的情况，免疫组化法检测凋亡相关蛋白的表达情况，Westernblot法检测磷酸化的PI3K、A k t蛋白表达。结果显示宣痹通瘀方能够保护急性心肌缺血大鼠心肌细胞的超微结构；抑制Caspase-3、Ca s p a s e-9、Ba x 蛋白的表达，促进抑制调亡-1326的蛋白Bcl-2的表达；能够促进p-PI3K、p-A k t 蛋白的表达。综上所述，经过宣痹通瘀方的干预治疗，大鼠心肌细胞调亡率明显下降。宣痹通瘀方保护心肌细胞，抑制心肌细胞调亡，调节调亡相关蛋白表达，促进p-PI3K、p-A k t 蛋白表达的治疗效果与用药剂量成正比。宣痹通瘀方高剂量组加入PI3K/Akt通路抑制剂后则治疗效果不显著。因此，宣痹通瘀方对急性心肌缺血模型大鼠心肌保护作用的机制，与激活PI3K/Akt信号通路，抑制心肌细胞调亡有关。参考文献：1数据“说”全球心血管疾病负担 .实用心脑肺血管病杂志，2023,31(3):5.2马丽媛，王增武,樊静，等.中国心血管健康与疾病报告2 0 2 1要点解读 .中国全科医学，2 0 2 2,2 5(2 7):3331-3346.3陈孝良，黄秀峰,张文荣,等.LINC00339在急性心肌梗死大鼠中表达及其对心肌细胞调亡、炎症反应和Rockl、NLRP3表达的影响 J.中国老年学杂志，2 0 2 2,42(2 1):5354-5358.4李双娣，成光宇，刘迎辉，等.宣痹通瘀方对急性冠脉缺血大鼠心脏的保护作用及机制 1.中国老年学杂志，2 0 18,38(19):4741-4743.5刘迎辉，成光宇，李双娣，等宣痹通瘀胶囊对实验性大鼠血液流变学及血栓形成的影响 .世界科学技术-中医药现代化,2 0 19,2 1(7):1399-140 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