基于PD-L1_TIL的小鼠黑色素瘤模型的构建.pdf

（编校：张西敏）:4318.基于PD-L1/TIL的小鼠黑色素瘤模型的构建吴展帅suppresses proliferation and invasion of gastric cancer cells throughmiR-4295/PTEN axisJ.China Oncol,2022,32(4):298-308.6YU T,WANG Y,FAN Y,et al.CircRNAs in cancer metabolism:AreviewJ.J Hematol Oncol,2019,12(1):90-100.7WANC Z,WEI P,WEI D,et al.Effect of up-regulation ofcircMATR3 on the proliferation,metastasis,progression and surviv-al of hypopharyngeal carcinoma J.J Cell Mol Med,2020,24(8):4687 4697.8NOVAK D,HUSER L,ELTON JJ,et al.SOX2 in development andcancer biology J.Semin Cancer Biol,2020,67(Pt 1):74-82.9ZHANG T,TANG Y,JIN Y,et al.Downregulation of miRNA-429and upregulation of SOx2 were unfavorable to the prognosis of na-sopharyngeal carcinoma J.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2020,24(16):8402 8407.10YU D,HAN CH,ZHAO X,et al.MicroRNA-129-5p suppres-ses nasopharyngeal carcinoma lymphangiogenesis and lymph nodemetastasis by targeting ZIC2 J.Cell Oncol(Dordr),2020,43(2):249-261.11YUAN G,DING W,SUN B,et al.Upregulated circRNA_102231promotes gastric cancer progression and its clinical significanceJ.Bioengineered,2021,12(1):4936-4945.12王衬，胡荣.CircRNA在髓系白血病中的研究进展J.现代肿瘤医学,2 0 2 0,2 8(1):16 6-16 9.WANG C,HU R.Progress of CircRNA in myeloid leukemiaJ.Modern Oncology,2020,28(1):166-169.13LIU J,XUE N,GUO Y,et al.CircRNA_100367 regulated the ra-diation sensitivity of esophageal squamous cell carcinomas throughmiR-217/Wnt3 pathwayJ.Aging(Albany NY),2019,11(24):12412-12427.14KHAN AQ,AHMED EI,ELAREER NR,et al.Role of miRNA-regulated cancer stem cells in the pathogenesis of human malig-nanciesJ.Cells,2019,8(8):840.15PENG S,LIU C,FAN X,et al.Analysis of aberrant miRNA-mRNA interaction networks in prostate cancer to conjecture itsmolecular mechanismsJ.Cancer Biomark,2022,35(4):395-407.16YU J,ZHANG X,MA Y,et al.MiR-129-5p restrains apatinibresistance in human gastric cancer cells via downregulatingHOXC10J.Cancer Biother Radiopharm,2021,36(1):95-105.17FENG J,CUO J,WANG JP,et al.MiR-129-5p inhibits prolif-eration of gastric cancer cells through targeted inhibition onHMCB1 expression J.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2020,24(7):3665 3673.18 WANG X,CHEN Y,WANG X,et al.Stem cell factor SOX2 con-fers ferroptosis resistance in lung cancer via upregulation ofSLC7A11J.Cancer Res,2021,81(20):5217-5229.19XIE H,YAO J,WANG Y,et al.Exosome-transmitted circVMP1facilitates the progression and cisplatin resistance of non-smallcell lung cancer by targeting miR-524-5p-METTL3/SOX2axisJ.Drug Deliv,2022,29(1):1257-1271.基于PD-L1/TIL的小鼠黑色素瘤模型的构建吴展帅广西中医药大学，广西南宁530 2 0 0【摘要】目的：基于程序性细胞死亡配体1（programmedcelldeathligand1,PD-L1）和肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltratinglymphocytes,TIL)构建符合临床特征的PD-LI+/TIL*和PD-LI+/TIL-小鼠黑色素瘤模型。方法：采用流式细胞术从主要组织相容性复合体I类基因编码分子H-2Kb-的小鼠黑色素瘤细胞B16中筛选出H-2Kb*的细胞，使用动物试验、免疫组化、流式细胞术等方法研究H-2Kb*的细胞生长速度、成瘤快慢、细胞因子分泌、T淋巴细胞浸润和PD-L1的表达等。结果：筛选得到了8 株H-2Kb*的细胞,其中2 F10和2 G1两株细胞的H-2Kb表达持久稳定，细胞生长慢、成瘤慢，分泌MCP-1和IL-6，可在2 F10肿瘤组织中检测到T淋巴细胞浸润,肿瘤细胞和肿瘤组织均可检测到PD-L1表达。结论：利用H-2Kb+细胞构建出了符合临床黑色素瘤分型特征的PD-L1*/TIL*和PD-L1+/TIL-的小鼠黑色素瘤模型【关键词】黑色素瘤；程序性细胞死亡配体1；肿瘤浸润淋巴细胞;H-2Kb【中图分类号】R739.5【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.16724992.2023.23.005【文章编号】16 7 2-4992-（2 0 2 3)2 3-4318-0 8【收稿日期】2023-02-07【修回日期】2023-07-28【基金项目】广西自然科学基金青年科学基金项目（编号：2 0 2 0 GXNSFBA159064）【作者简介】吴展帅（198 9一），男，山东莱芜人，副教授，主要从事肿瘤免疫方向的研究。E-mail：z h a n s h u a i _w u 16 3.c o m:4319:MODERNONO31,No.232023年12 月现代肿瘤医学第31卷第2 3期Construction of mouse melanoma models based on PD-L1/TILWU ZhanshuaiGuangxi University of Chinese Medicine,Guangxi Nanning 530200,China.Abstract1 Objective:To construct PD-LI+/TIL+and PD-L1*/TIL-mouse melanoma models consistent withclinical characteristics based on programmed cell death ligand 1(PD-L1)and tumor infiltrating lymphocytes(TIL).Methods:The H-2Kb+cell lines,encoded by major histocompatibility complex class I gene,were screened fromH-2Kb-mouse melanoma cell B16 by flow cytometry.The growth rate,tumor formation rate,cytokine secretion,Tlymphocyte infiltration and PD-LI expression of these cell lines were investigated through animal experiment,immu-nohistochemistry and flow cytometry,and so on.Results:Eight H-2Kb*cell lines were selected,among which 2F10and 2G1 cell lines had sustained and stable expression of H-2Kb.They had slow growth rate and slow tumorigenationand secreted MCP-1 and IL-6.T lymphocytes infiltration could be detected after 2F10 tumor formation and PD-L1 expression could be detected in both cells and tumor tissues.Conclusion:PD-LI+/TIL+and PD-LI+/TILmouse melanoma models conforming to clinical characteristics were constructed using H-2Kb+cell lines.Key words melanoma,PD-L1,TIL,H-2KbModern Oncology 2023,31(23):4318-4325黑色素瘤是恶性皮肤肿瘤之一,在皮肤肿瘤中占比虽仅为5%，但却占据了皮肤癌总死亡率的8 0%，且具有很强的转移性。黑色素瘤是由黑色素生成细胞经不受控制的分裂而产生，并浸润到皮下形成结节和丘疹。2 0 2 0 年，全球约有32 50 0 0 例被确诊罹患黑色素瘤，约57 0 0 0 例死亡2 。美国癌症中心预测，2 0 2 3年全美将会新增97 6 10 例黑色素瘤患者,死亡7 990 例3。中国黑色素瘤发病率低于欧美国家，但是死亡率高。2 0 16 年我国癌症发病情况显示，黑色素瘤患者新增7 0 0 0 例，死亡38 0 0 例4。肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltratinglymphocytes，T IL），是浸润到肿瘤内部的淋巴细胞，其中包含着针对肿瘤抗原的特异性T淋巴细胞，经过分选、扩增、筛选等步骤，将TIL回输到患者体内，可以达到对肿瘤的杀伤作用。198 6 年，ROSENBERG教授从小鼠肿瘤内分离出TIL,在体外用IL-2培养后再回输到小鼠体内，发现TIL具有显著的抗肿瘤效应5。之后,对TIL的研究逐渐深入,并被用于黑色素瘤的治疗,取得了不错的效果。目前,TIL正被广泛应用于各种实体瘤的临床研究与治疗当中6-9主要组织相容性复合体（majorhistocompatibilitycom-plex,MHC）是编码主要组织相容性抗原（majorhistocompati-bilityantigen,MHA）的一群基因，在抗原提呈、激活T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫应答中具有非常重要的作用,MHC的缺失会导致肿瘤免疫逃逸。小鼠的MHC叫做H-2复合体，包括I、I、类基因10-,其中1类基因在小鼠T淋巴细胞激活中起重要作用。I类基因主要包括H-2K和H-2D,在一条染色体上K和D基因座存在的基因总和称为H-2单体型，不同品系小鼠的单体型用小写字母命名，C57BL/6小鼠的H-2单体型包括H-2Kb和H-2Db等。而H-2Kb可诱导较强的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicTlympho-cyte,CTL)活性,因此H-2Kb在T淋巴细胞杀伤肿瘤过程中具有重要意义12-13以靶向程序性死亡受体1（programmed death1,PD-1)抗体为代表的免疫检查点抑制剂疗法在黑色素瘤治疗中具有一定的效果,但是仍有部分肿瘤患者对PD-1抗体不敏感。研究发现,对PD-1抗体治疗敏感的肿瘤患者,其肿瘤组织内往往会有T淋巴细胞浸润，同时表达程序性细胞死亡配体 1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)14。基于这一特点，可以将黑色素瘤分为四种类型：PD-L1*/TIL*、PD-LI-/TIL*、PD -L1-/T IL 和 PD-L1*/TIL-15OPD-L1*/TIL*这一类型的黑色素瘤患者,对 PD-1抗体疗法敏感,效果显著,但是其他三类黑色素瘤患者对PD-1抗体疗法不响应，其机制目前还不是十分明确。本文以H-2Kb为筛选指标,从经培养的H-2Kb的小鼠黑色素瘤细胞B16中筛选H-2Kb*的细胞，构建能够模拟临床黑色素瘤分型的小鼠肿瘤模型,为深人研究黑色素瘤免疫逃逸机理和治疗新机制研究提供条件。1材料与方法1.1材料雌性6 8 周SPF级C57BL/6小鼠(18 2 0 g)购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司实验动物质量合格证编号：SCXK（湘）2 0 19-0 0 0 4，于广西中医药大学实验动物中心SPF级动物房饲养；B16细胞来源于耶鲁大学；小鼠H-2Kb、PD-L1流式抗体购于美国BD公司；小鼠多因子检测试剂盒CBA Mouse Inflammation Kit购于美国 BD公司;CTVision MII抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒购于上海基因科技有限公司；DMEM、RPM I16 40 培养基购于美国CellGrow公司；胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）、青链霉素购于美国Gibco公司;4羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液4（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid saline,HEPES、磷酸盐缓冲液（p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e,PBS）购于美国Corning公司；四型胶原酶（CollagenasetypeIV）购于美国Sigma公司；台盼蓝（T r y p a n b l u e）购于美国LifeTechnologies公司；二甲苯购于广州化学试剂厂；中性福尔马林固定液、苏木素伊红染液、中性树脂购于秀威公司；DAB显色剂购于迈新公司；D型胶原酶（CollagenaseD)购于瑞士Roche公司;PD-1和4-1BB（CD 137）单克隆抗体来自实验室生产1.2实验方法1.2.1H-2Kb+细胞的筛选复苏液氮冻存的B16细胞，培养2 代以后胰酶消化，制备单细胞悬液，按照110 个细胞/10 0 L加人戴帽流式管4320吴展帅基于PD-L1/TIL的小鼠黑色素瘤模型的构建中,加人抗小鼠H-2Kb抗体，孵育30 分钟。洗涤后，加人300LPBS,上流式分选仪分选H-2Kb*的细胞。将分选后的细胞通过有限稀释法转移至96 孔板中，保证每个孔一个细胞，置于细胞培养箱中培养，待细胞密度增大后，胰酶消化，取部分细胞加人抗小鼠H-2Kb抗体，孵育30 分钟后，流式细胞仪检测H-2Kb的表达情况。若H-2Kb高表达,则另一半细胞继续培养，每次传代时都进行H-2Kb的检测，若H-2Kb可长期稳定表达，则将细胞冻存备用。H-2Kb的细胞作为对照细胞进行冻存。1.2.2小鼠体内成瘤实验将 B16、H-2 K b*的细胞和H-2Kb-的细胞,以110 个细胞/10 0 L的浓度，分别接种C57BL/6小鼠，皮下成瘤。监测肿瘤生长情况，以肿瘤平均直径达到10 mm时为实验终点，同时记录小鼠生存时间。1.2.3细胞因子检测将B16、筛选出的H-2Kb+可长期稳定表达的两株细胞2F10和2 G1分别接种于48 孔板中，待细胞汇合度达到8 0%时收集细胞上清液，按照CBAMouseInflammationKit说明书的步骤进行操作,最后用流式细胞仪进行检测。2 F10和2 C1肿瘤组织按照1.2.5节中的方法制备单细胞悬液，收集裂解液检测细胞因子含量。1.2.4免疫组化检测T淋巴细胞取B16、H-2 K b*的2 F10和2 G1小鼠肿瘤，福尔马林固定48 小时，放人包埋盒中，置于7 0%乙醇中浸泡2 4小时，然后进行脱水、包埋、切片。制备好的切片进行水化、抗原修复、封闭，加入一抗（抗小鼠CD3抗体）孵育过夜，第二天进行显色、观察。1.2.5PD-L1 的检测CO2吸人处死小鼠,取肿瘤组织,PBS清洗后,放入组织匀浆器专用C-Tube中,加入组织消化液，置于组织匀浆器中匀浆,37 处理40 分钟。再次将C-Tube置于组织匀浆器中匀浆，加入DMEM完全培养基终止消化，过滤、离心，得到单细胞悬液。加人小鼠PD-L1抗体孵育30 分钟,洗涤后流式细胞仪检测1.2.6PD-1和4.CD137）单克隆抗体的制备TBBC将分泌靶向共抑制分子PD-1和共刺激分子41BB（CD 137）单克隆抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养，转移入滚瓶，置于滚瓶培养箱培养7 天，期间添加2 次RPMI1640培养基。培养结束后,将培养基经孔径0.45m的滤器过滤，滤液4保存。使用抗体结合柱结合两种滤液中的抗体，并进行洗脱、收集、透析，测定抗体浓度，分装后置于超低温冰箱中保存。1.2.7抗体治疗H-2Kb*的2 F10和2 C1肿瘤细胞按照110 个细胞/100L接种于C57BL/6小鼠皮下，肿瘤生长后，进行PD-1抗体和4一1BB(CD137）抗体的单独以及联合治疗，每种抗体用量为2 0 0 g。监测肿瘤生长和小鼠生存期。1.3统计学方法采用SPSS26软件处理数据，符合正态分布的计量资料采用xs表示，采用独立样本t检验和单因素方差分析进行分析。不符合正态分布的计量资料采用秩和检验进行分析。P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1H-2Kb+细胞的筛选结果我们采用流式细胞分选术，从H-2Kb-的B16细胞中分选出了8 株H-2Kb*的细胞，经有限稀释法培养，得到单个细胞的克隆,用流式细胞术检测H-2Kb的表达率（表1和图1A）。从图中可以看出，分选得到的8 株细胞H-2Kb相对于B16均高表达，后续检测发现,H-2Kb可持续稳定高表达的为2 F10和2 G1两株细胞,H-2Kb表达率长期稳定在95%以上(图1B-C)。表18 株细胞的H-2Kb表达率Tab.1Expression rate of H-2Kb of 8 cellsCellExpression rate of H-2Kb(%)1B1099.81C598.92E1282.02G199.82E899.62F296.82F1099.92A243.22.2H-2Kb*细胞成瘤速度慢在筛选H-2Kb*细胞的同时,也收集了H-2Kb的细胞,将B16、H-2 K b*和H-2Kb的细胞分别接种C57BL/6小鼠，观察肿瘤生长情况（图2）。数据显示，肿瘤平均直径达到10 mm时，H-2Kb*的细胞平均用时为30.14天，是B16(13天）的2.32 倍和H-2Kb细胞（17.5天）的1.7 2 倍(图2)。2.3H-2Kb*细胞的细胞因子分泌检测结果根据研究结果，我们选择了2 株H-2Kb表达稳定持久的细胞2 F10和2 G1进行后续研究。采用多因子检测方法检测了B16、2 F10 和2 G1细胞分泌的细胞因子。一共检测了IL-12p70、T NF、I FN-、M CP-1、I L-10 和IL-6六种细胞因子,其中B16细胞分泌少量MCP-1,2F10和2 G1细胞均可分泌MCP-1和IL-6,其他细胞因子分泌极少或不分泌（图3A-B）。此外,我们对2 F10和2 G1成瘤后的肿瘤组织进行裂解，检测裂解液中相应细胞因子的浓度（图3C-D）。肿瘤裂解液中,2 F10肿瘤组织分泌的IL-6和MCP-1浓度要远远小于肿瘤细胞,2 G1肿瘤组织分泌的MCP-1浓度小于肿瘤细胞，而IL-6的浓度没有差异。2.4H-2Kb*对肿瘤生长的影响将B16、2 F10 和2 G1细胞分别接种于C57BL/6小鼠，监测肿瘤生长情况。通过测量肿瘤平均直径发现，B16成瘤后在第12 天左右肿瘤平均直径达到10 mm,2F10成瘤后在第60天左右肿瘤平均直径达到10 mm,2G1成瘤后在第42 天左右肿瘤平均直径达到10 mm。B16 细胞接种小鼠后,肿瘤始终处于快速生长阶段,2 F10和2 G1细胞接种小鼠后，肿瘤大小在维持了一段时间后进人快速生长阶段（图4A）。2 G 1在30 天后生长速度加快，2 F10在40 天后生长速度加快。生存期方面，B16荷瘤小鼠在18 天左右全部死亡，6 0%的2 F10和2 G1荷瘤小鼠的生存期可以超过6 0 天（图4B）。4321MODERNONCOL31,No.232023年12 月现代肿瘤医学第31卷第2 3期A1B101C52E122G1150-150-150-150Tunon100-100-Junon1005050-50-50-00000101010010%4103106101103106010410510H-2KbH-2KbH-2KbH-2Kb2E82F22F102A2150-150150-150-nunoo100Junon100-1005015050-5010.00010410100104101001010510010410106H-2KbH-2KbH-2KbH-2KbBCSamplename2A2.fcs100-2F102E10.fcs2F2.fcs2G12E8.fcs2G1.fcs2E12.fcsiC5.fcs95-1B10.fcsJB16.fcs90-0F2468Days010410108H-2Kb图1筛选出的H-2Kb高表达的细胞株A:8株H-2Kb+细胞。黑线非填充直方图代表B16。B:8 株H-2Kb+细胞叠加图。C:2F10和2 G1细胞上H-2Kb的长期表达率。Fig.1The selected cell lines with high expression of H-2KbA:8 H-2Kb+cells.The unfilled histogram with black line is B16.B:Half ffset of 8 H-2Kb+cells.C:Long-term expression rate of H-2Kb of2F10 and 2G1 cells.H-2Kbtcells*H-2Kbcells*B16010203040Timeoftumorgrowth(d)图2 肿瘤平均直径达到10 mm时所需时间Fig.2The time of tumor reaching 10 mm*P0.001.2.5免疫组化检测H-2Kb*细胞成瘤后的T淋巴细胞浸润情况T淋巴细胞浸润是肿瘤能否治愈的关键因素之一,H-2Kb*的细胞成瘤速度慢,我们猜测这可能与T淋巴细胞的浸润有关。为此,我们对2 F10和2 G1成瘤后的组织进行了免疫组化检测,发现在2 F10肿瘤组织内有T淋巴细胞浸润（箭头指示方向）,2 G1肿瘤组织内则没有（图5）。2.6H-2Kb+细胞对疗的敏感性我们使用分泌靶向共抑制分子PD-1的单克隆抗体G4和靶向共刺激分子41BB（CD 137）的单克隆抗体2 A对2F10和2 G1肿瘤进行单独治疗和联合治疗（图6）。从图中可以看出,2 F10和2 G1肿瘤接受PD-1抗体和4-1BB（C D 137)抗体单独治疗后,肿瘤生长曲线与未接受抗体治疗的相比,未看到明显的差异，且使用抗体治疗后肿瘤生长速度有加快的趋势。当PD-1抗体和4-1BB抗体联合使用时,能够完全抑制2 G1肿瘤的生长。综合来看，肿瘤内有T淋巴细胞浸润的2 F10肿瘤，抗体单独和联合治疗均无效；肿瘤内无T淋巴细胞浸润的2 G1肿瘤，抗体单独治疗无效，联合治疗对其有效。这表明,肿瘤内是否有T淋巴细胞浸润并不是决定抗体治疗有效的唯一决定因素。2.7H-2Kb*细胞及肿瘤组织上PD-L1的表达H-2Kb*肿瘤抗体治疗效果不显著,可能与共抑制分子的表达有关。T淋巴细胞在肿瘤内的浸润,会释放IFN-，引起肿瘤细胞表达共抑制分子PD-1的配体PD-L1。我们检测了2 F10和2 G1成瘤后,肿瘤细胞上PD-L1的表达（图7A）。从图中可以看出,2 F10肿瘤细胞上PD-L1的表达率为4.41%,2 G1肿瘤细胞上PD-L1的表达率为4.7 6%,均有弱表达。综合来看,PD-L1在成瘤后的肿瘤细胞中的表达率约为4%（图7 B）。我们也检测了2 F10和2 G1细胞在接种小鼠前,PD-L1的表达情况（图7 C）,2 F10 细胞上PD-L1的表达率为6.48%,2 G1细胞上PD-Ll的表达率为31.6%。综合来看,成瘤前PD-L1在2 F10和2 G1细胞上的表达率分别为5%和2 5%左右（图7 D）。以上结果表明，PD-1抗体在阻断PD-1/PD-L1结合后,并没有抑制肿瘤生长，这可能意味着还有其他的共抑制分子在其中起作用。4322基于 PD-L1/TIL的小鼠黑色素瘤模型的构建吴展帅ABCD*8000-*150200-*8000-*6000-6000-150-100-4000-4000-50-50-2000-2000-0000B16 2F10 2G1B162F10 2G12F10cells2G1cells2F10cells2G1cells2F10tumorderivedcells2Gl tumorderivedcells2F10tumorderivedcells2Gl tumorderived cells图3B16、2 F10 和2 G1细胞分泌的IL-6和MCP-1浓度A:B16、2 F10 和2 G1细胞分泌的IL-6浓度;B:B16、2 F10 和2 G1细胞分泌的MCP-1浓度;C:2F10和2 G1细胞及其成瘤后的肿瘤细胞分泌的IL-6浓度;D:2F10和2 G细胞及其成瘤后的肿瘤细胞分泌的MCP-1浓度。*P0.05，*P 0.0 1。Fig.3Secreted IL-6 and MCP-1 concentration of B16,2F10 and 2G1A:IL-6 concentration of B16,2F10 and 2G1 cells.B:MCP-1 concentration of B16,2F10 and 2G1 cells.C:IL-6 concentration of 2F10 and 2G1cells and tumor derived cells.D:MCP-1 concentration of 2F10 and 2G1 cells and tumor derived cells.*P0.05,*P0.01.A20-B16B1002F1015-2G1一10-50-B1652F102G100010203040506070020406080DaysDays图4B16、2 F10 和2 C1肿瘤生长曲线和生存期A:B16、2 F10 和2 G1肿瘤平均直径到达10 mm时的生长曲线;B:B16、2 F10 和2 Gl荷瘤小鼠生存期。Fig.4Tumor growth curve and overall survival of B16,2F10 and 2G1A:Tumor growth curve when the average of B16,2F10 and 2G1 reaching 10 mm.B:Overall survival of B16,2F10 and 2G1 tumor-bearing mice.100400ABx100400 x100X400图5B16、2 F10 和2 G1肿瘤组织免疫组化检测A：B16 肿瘤组织免疫组化切片;B:2F10肿瘤组织免疫组化切片（红色箭头指示的为T淋巴细胞）;C:2G1肿瘤组织免疫组化切片Fig.5IHC of B16,2F10 and2G1 tumorsA:IHC of B16 tumor section.B:IHC of 2F10 tumor section(red arrow indicates T lymphocytes).C:IHC of 2G1 tumor section.3讨论C57BL/6小鼠来源的黑色素瘤细胞B16不表达H-2Kb,在IFN-刺激下,H-2Kb表达会升高。与此类似，JB/RH1黑色素瘤细胞由于H-2Kb和TAP-1基因的下调，也不表达H-2Kb分子16 。而通过转染H-2Kb基因,或者内源性方式提高H-2Kb分子的表达,均会改变黑色素瘤细4323MODERNONCO31,No.232023年12 月现代肿瘤医学第31卷第2 3期胞的表型特征,其中最主要的就是黑色素瘤相关抗原（mela-nomaa s s o c i a t e d a n t i g e n，M A A）表达的缺失，但这一过程与黑色素瘤特异的C型亲嗜性逆转录病毒无法产生关联17 。H-2Kb基因的转染可影响黑色素瘤的免疫和非免疫的效应,能够破坏整合素介导的黏附效应18 。H-2Kb基因的转染能够改变黑色素瘤的免疫原性，增加TILs19，也会增强NK细胞的敏感性2 0 。我们的研究结果表明,筛选出的H-2Kb*的肿瘤细胞成瘤后,能够在肿瘤组织内发现T淋巴细胞的浸润，且肿瘤的生长速度远远慢于B16肿瘤。A20-B202F10+4-1BBAb2G1+4-1BBAb2F102G1+PD-1Ab15-2F10+PD-1Ab2G12F10+PD-1+4-1BBAb10-10-2G1+PD-1+4-1BBAb55-0+0-0102030405060010203040DaysDays图6 2 F10和2 G1肿瘤接受抗体治疗后的生长曲线A：抗体治疗后2 F10肿瘤生长曲线；B：抗体治疗后2 C1肿瘤生长曲线。Fig.6Tumor growth curve after antibody therapy on 2F10 and 2G1 tumorsA:2F10 tumor growth curve after antibody therapy.B:2G1 tumor growth curve after antibody therapy.A2F10control2F10PD-L12Gl control2G1PD-L1101051010510101010*P101010103101010100000-10-10-10年-10201031041050101010010310410s010310410FITCFITCFITCFITCBC2F102G1D67407*30(%)IT-CdJO(%)IT-adJO4unoo6.48%31.6%202-10-0010310*10501010*10%02F102G12F102G1PD-L1PD-L1图72F10和2 G1肿瘤组织及细胞上PD-L1的表达率A:2F10和2 G1肿瘤组织上PD-LI的表达率;B:2F10和2 G1肿瘤组织上PD-L1表达率的统计结果;C:2F10和2 G1肿瘤细胞上PD-LI的表达率（灰色柱状图为对照）;D:2F10和2 G1肿瘤细胞上PD-L1表达率的统计结果。*P0.01。Fig.7Expression rate of PD-L1l in tumor tissues and cells of 2F10 and 2G1A:Expression rate of PD-L1 in 2F10 and 2G1 tumor tissues.B:Statistical result of expression rate of PD-L1 in 2F10 and 2GI tumor tssues.C:Expression rate of PD-LI in 2F10 and 2C1 tumor cells.The filled gray histogram is control.D:Statistical result of expression rate of PD-LI in2F10and 2Gl cells.*P0.01.黑色素瘤细胞B16本身不分泌MCP-1和IL-6,宿主来源的MCP-1能够通过促进淋巴细胞浸润杀伤B1621,MCP-1也能通过EP4/p38MAPK信号通路招募巨噬细胞2 。同时,MCP-1也能促进肿瘤血管生成和早期肿瘤生长2 3-2 4。而IL-6则部分通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)的活化起到抗肿瘤的作用2 5,部分通过sIL-6R介导肿瘤的生长停滞和分化2 6 。IL-6能够通过诱导CCR5表达，促进髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC)的活性2 7-2 8 ,也能促进细胞侵袭2 9。我们的研究结果发现,2 F10和2 G1细胞均能分泌MCP-1和IL-6,且MCP-1的分泌量远远大于IL-6。2 F10 和2 G1肿瘤组织裂解液中也可检测到MCP-1和IL-6的分泌，除了2 G1肿瘤组织裂解液分泌的IL-6与细胞分泌的没有差异之外，其余都是肿瘤组织裂解液中的细胞因子浓度小于细胞分泌的。MCP-1与IL-6的作用可能影响了肿瘤的生长以及T淋巴细胞的浸润。免疫检查点抑制剂疗法在肿瘤的治疗中发挥了重要作.4324.基于PD-吴展帅L1/TIL的小鼠黑色素瘤模型的构建用,特别是PD-1抗体，极大地提高了黑色素瘤的治疗疗效，但还是有部分患者对PD-1抗体不反应30 。也正是因为这一点，我们将肿瘤按照有无T淋巴细胞浸润和是否表达PD-L1分成了四类,通过构建小鼠模型,研究对PD-1抗体不应答的机制和增强T淋巴细胞浸润的机制。目前，临床上除了单独使用PD-1抗体以外，还会联合PDL1抗体、CTLA-4抗体、BRAF抑制剂、MEK抑制剂、化疗和放疗进行联合治疗31-34。我们的结果显示,2 F10和2 G1成瘤后进行PD-1 抗体治疗,相比对照组,肿瘤的生长速度在后期逐渐加快，表明PD-1抗体单独使用效果有限。除了PD-1抗体之外,我们也使用了4-1BB(CD137)抗体进行治疗。结果显示,2 F10肿瘤对4-1BB抗体不敏感,肿瘤的生长速度在后期逐渐加快;2 G1肿瘤在后期相比对照组生长速度减缓，但仍然具有上升趋势。已有的研究表明,4-1BB抗体治疗能够增强T淋巴细胞对肿瘤的浸润35-38 ,而我们的结果虽然也有T淋巴细胞浸润，但是肿瘤仍然在生长。当PD-1和4-1BB抗体联合使用后,2 G1肿瘤被完全抑制,2 F10肿瘤仍然在生长。这表明,2 G1肿瘤适合PD-1和41BB抗体联合治疗,2 F10则不适合，虽然2G1肿瘤内未