DB14_T 1946-2019 实验动物 中国地鼠生物学数据测定(山西省).pdf

ICS 65.020.30 B 44 DB14 山西省由巳ET圃，、万标准DB 14/T 1946-2019 实验动物中国地鼠生物学数据测定Laboratory animal Determination of biological data in Chinese hamster 2019-12-01发布2020-02-01实施山西省市场监督管理局发布DB14/T 1946-2019 目次前言.l 范围.1 2 规范性叶用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 遗传数据.2 6 生理数据.2 7 生化数据.3 8 解剖数据.3 附录A(规范性附录)染缸体数测定方法.5 附录B(规范性附录)精子采集.8 附录c(规范性附录)19G测定方法.9 附录o(规范性附录)血液样品采集要求.11 DB14/T 1946-2019 II 目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。本标准白山西省科学技术厅提出、归口并监督实施。本标准起草单位:山西医科大学。本标准主要起草人:宋国华、陈朝阳、庞文彪、刘茂林、樊林花、高继萍、王晓堂。DB14/T 1946-2019 实验动物中国地鼠生物学数据测定1 范围本标准规定了实验动物中国地鼠(以下简称实验中国地鼠)的遗传数据、生理数据、生化数据、解剖数据等4类生物学特性数据的测定方法。本标准适用于中国地鼠生物学特性数据质量的控制。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的号|用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBfT 14927.1-2008 实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测法DB 14fT 1942-2019 实验动物中国地鼠做卫星DNA检测方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 实验中国地鼠laboratory Chinese hamster 经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检定以及其它科学实验的中国地鼠(Cricetulusgriseus)。3.2 数据采集data collection 数据采集系统是结合基于计算机或者其他专用测试平台的测量软硬件产品来实现灵活的、用户自定义的测量系统。为了反映实验动物品种品系的生物学特征，需进行各种数据的采集及标准化的工作。3.3 数据测定data determination 是指借助于一定的测量工具或一定的测量标准而获得的数据。4 缩略语下列缩回各i吾适用于本文件。DB14/T 1946-2019 ALB:白蛋白ALT:丙氨酸氨基转移酶BUN:尿素CRE:月几回TGLU:血糖GRAN:中性粒细胞HCT:红细胞压积HGB:血红蛋白LYM:淋巴细胞MCH:平均红细胞血红蛋白量MCHC:平均红细胞血红蛋白浓度MON:单核细胞MPV:平均血小板体积PCT:血小板压积PLT:血小板RBC:红细胞计数CHOL:总胆固醇TG:甘油二脂TP:总蛋白WBC:臼细胞计数5 遗传数据5.1 生化标记检测生化标记检测应符合GB/T14927.1-2008第5章生化标记检测方法总则。5.2 染色体数测定染色体数测定按照本标准附录A执行。5.3 微卫星DNA标记检测做卫星DNA标记检测按照DBI4/T1942-2019规定检测。6 生理数据6.1 血液学6.1.1 采样要求麻醉状态下，腹主动脉采血适量，用0.9%EDTA抗i疑，室温条件下不超过4h测定。2 DB14/T 1946-2019 6.1.2 检测指标RBC、HCT、PLT、MPV、WBC、HGB、LYM、MON、GRAN、PCT、MCH、MCHCo其余指标可根据实验需要测定。6.2 精液6.2.1 精液采集精液采集详见本标准附录Bo6.2.2 精子活力用玻璃棒蘸取新鲜精液用0.9%氧化铀稀释精液，滴在玻片上，加上盖玻片，中间不要有气泡:在显微镜下用暗视野进行观察，统计精子3种活动(直线前进运动、旋转运动和振摆运动情况:计算直线前进运动精子数与精子总数的比值。6.2.3 精子计数用0.5%碳酸氢饷等倍数稀释精液，4%甲醒固定，混匀后滴入计数池，显微镜下计数。6.3 IgG测定IgG测定按照本标准附录C规定执行。7 生化数据7.1 血液生化指标7.1.1 采样要求中国地鼠禁食8h12 h，不禁水，采血按照本标准附录D规定执行。7.1.2 检测指标ALB、ALT、BUN、CRE、GLU、TG、TP其余指标可根据实验需要测定。7.2 尿液直用膀肮穿刺法或膀脱压迫法收集新鲜尿液，测定尿酸、尿比重、尿糖和j示蛋白O8 解剖数据8.1 动物准备动物解剖前应禁食8h12 h，不禁水，应在采血后采集内脏器官。8.2 脏器采集采集颊囊、心、肺、脾、肝、胃、膜腺、肠、肾、肾上腺、辜丸/卵巢、子宫、脑等，可根据实验3 DB14/T 1946-2019 需求采集其它脏器。8.3 脏器测量8.3.1 称重称重前应将脏器周围脂肪、结缔组织剔除，用滤纸吸去脏器表面的体液，迅速称重。根据脏器大小选用适宜精度的天平进行称重。8.3.2 肠道长度测量应从胃幽门处至1工门处剖取所有肠段。分别测量小肠、结肠、盲肠、直肠的长度，计量单位采用日1日104 A.1 器具附录A(规范性附录)染色体数测定方法DB14/T 1946-2019 注射器、4号针头、解剖盘、解剖剪、摄于、玻璃吸管、10mL刻度高心管、离心机、载玻片、盖玻片、显微镜、滤纸、擦镜纸、自纱布小块、量筒、玻璃板。A.2 药品0.02%秋水仙京、Giemsa染液。A.3 试剂A.3.1 0.075 mol/L氢化饵溶液准确称取0.559g氯化饵，溶于80mL蒸馆水中，定容至100mLA.3.2 固定液准确量取3份甲醇，1份冰醋酸，混合均匀配制而成。A.3.3 2%拧攘酸呐j容液准确称取2g拧棱酸铀，寄于80mL蒸馆水中，定容至100mLA.3.40.85%氢化纳溶液准确称取0.85g氧化铀溶于80mL蒸锢水中，定容至100mL。A.3.5 磷酸缓冲液(pH6.8)取甲液49.5mL，乙液50.5mL,1i昆匀即可。甲液1/15mollL磷酸氢二纳溶液，称耳又磷酸氢二号内9.48g，溶于900mL蒸馆水中，定容至1000mL乙液1/15mol/L磷酸二氢饵溶液，称取磷酸二氢饵9.07g，溶于900mL蒸馆水中，定容至1000 mL若磷酸氢二铀或磷酸二氢饵含有结晶水，则应根据结晶水的含量重新计算称取量。A.3.6 Giemsa原液称取Giemsa粉剂0.50g，量取丙三醇33mL，量取甲醇33mL。将Giemsa粉溶于少量丙三醇，在研钵内研磨00min)无颗粒为止，再将全部剩余丙三醇倒入。于560C温箱内2h后，再加入甲醇，将配好Giemsa原液置于棕色瓶中。3 DB14/T 1946-2019 A.4 操作A.4.1 预处理实验前3h4 h，取健康中国地鼠一只按每克体重4g秋水仙素，浓度为0.16mg/mL生理盐水的量将秋水仙京溶液注入腹腔(切勿损伤内脏)。A.4.2 取股骨用眼球后血管丛放血处死中国地鼠。处死后立即用剪刀剪开后腿上的皮毛，取出中国地鼠的股骨，剔掉股骨上的肌肉，并将一小块白纱布包在股骨上用于反复搓动，以除净股骨上肌肉碎渣和结缔组织。A.4.3 取骨髓细胞将生理盐水4mL，一次性卡介苗注射器通过4号针头注入骨髓腔，使骨髓细胞冲洗入10mL锥形离心管内，吸出杂质，管壁冲净。1000r/min离心5min。小心吸去大部分上清液，留0.5mL与沉淀物混匀。A.4.4低j参在离，心管中加入0.075mol/L氧化怦溶液6mL，用吸管将骨髓细胞吹打成细胞悬液，370C恒温水浴锅低渗23min(1 Omin时吹打4、5下)，立即加固定液，严格控制低渗时间。1000r/min离心10min后弃去上清液。在离，心前加入1mL固定液并用吸管吹匀进行预固定。A.4.5 预固定加入1mL新配制的固定液，吹气;包45下泪匀，5min后在吹气泡15次，立即以1000r/min离心lOmin，用吸管吸去全部上清液，轻弹离，心管底部，使沉淀呈糊状。A.4.6 第一次固定吸出上j青液，先加固定液1mL将沉淀物打碎，再加至4mL，H 15次，盖上胶塞，放入370C水浴20 min(10 min时吹打100次，管壁冲净)。离心，吸出上清液，加2mL固定液，吹打，带盖室温固定20min。第二次固定、第三次固定方法同第一次固定一样。A.4.7 滴片用摄子从冰水中取出预冷的载玻片，甩掉载玻片的冰水后迅速用吸管吸取细胞悬液滴在载玻片上23滴(滴片的高度30cm35 cm，滴面不要重复)，立即用嘴向同一方向吹，使细胞染色体散开，然后置于酒精灯上微微加热干燥或放在玻片架上室温下晾干。A.4.8 烤片将滴片置于700C烤箱烘烤30mino 6 DB14/T 1946-2019 A.4.9 染色将烤干的玻片放在玻片板上，将Giemsa染液滴力日在玻片上染色15min，用蒸t留水或自来水冲去玻片上的染液。滤纸吸干或晾干后待镜检。A.4.10 镜检将制备好的破片置于显微镜下，首先在低倍视野下寻找细胞和中期分裂相，然后用中倍镜和油镜观察染色体的形态，统计染色体的数目。A.5 结果判定染色体数目为2n二2207 DB14/T 1946-2019 B.1 分离组织附录B(规范性附录)精子采集通过外科手术从辜九中分离出附阜尾和输精管。B.2 游离精子用缓冲液冲洗高体附辜并小心去除血液和脂肪组织，随后将附阜尾置于含1mL缓冲液。TC)的平皿中，用精细手术剪剪碎附辜尾，继续于370C孵育10min让桔子游离出来。B.3 取精培育取300C预热的生理盐水按照1:5稀释，装入1.5mL离心管中，1 mLl管，加封口膜后插放在300C恒温金属浴器中。另取10L加入到190L预热好的培养液中，吹打后置入培养箱2min，持i十数用。B.4 计数用细胞计数仪计算精于数量。8 DB14/T 1946-2019。1材料附录C(规范性附录)IgG 测定方法鼠抗中国地鼠19G的单克隆抗体2%BSA封闭液:纯化的中国地自19G;兔抗中国地鼠19G的多克隆抗体:酶标羊抗兔抗体(HRP标记);TMB溶液。2主要仪器酶标仪、恒温水浴锅。3方法C.3.1 标准曲线制作。3.1.1 包被用含1:400鼠抗中国地鼠IgG单克隆抗体包被酶标板，100LI孔，3TC温育2h,40C过夜，PBST 300LI孔，重复洗涤3次，拍干。C.3.1.2 王才闭2%BSA封闭，200llLl孔，3TC温育2h;PBST 300LI孔，重复洗涤3次，拍干。C.3.1.3 加标准品力口不同稀释浓度(0.25g/mL、0.5Ilg/mL、1.0Ilg/mL、2.0Ilg/mL、3.0g/mU的标准品中国地鼠IgG，同时设阴性对照和空白对照孔，370C温育1h,PBST 300LI孔，重复洗涤3次，拍干。C.3.1.4 加抗体加1:2000兔抗中国地鼠19G多克隆抗体，IOOIlLl孔，370C温育lh，PBST 300LI孔，洗涤3次，拍干。C.3.1.5 加酶标抗体加1:8000 HRP标记抗体，100LI孔，3TC温育1ho PBST 300 IlLl孔，洗涤3次，拍干。C.3.1.6 显色、终止及读数加入TMB底物溶液，100LI孔，3TC避光温育15mino加入2MH2S04终止反应，100llLl孔，用酶标仪测定OD450值。9 DB14/T 1946-2019 C.3.1.7 回归方程以不同稀释浓度的标准品中国地鼠19G含量为横坐标，以相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。C.3.2 中国地鼠血浆中IgG含量检测C.3.2.1 包被用含1:400鼠抗中国地鼠19G单克隆抗体包被酶标板，100 f.lLl孔，37C温育2h,4C过夜，PBST 300LI孔，重复洗涤3次，拍干。C.3.2.2 封闭2%BSA封闭，200LI孔，3TC温育2h;PBST 300LI孔，重复洗涤3次，拍干。C.3.2.3 加样加1:5000持检中国地鼠血清/血浆，100 f.lLl孔，同时设阴性对照和空白对照，37C温育1h,PBST 300LI孔，重复洗涤3次，拍干。C.3.2.4 加抗体加1:2000兔抗中国地鼠19G多克隆抗体，100 LI孔，3TC温育1hoPBST 300LI孔，洗涤3次，拍干。C.3.2.5 加酶标抗体加1:8000 HRP标记抗体，100 LI孔，37C温育1ho PBST 300LI孔，洗涤3次，拍干。C.3.2.6 显色、终止及读数加入TMB底物溶液，100 LI孔，3TC避光温育15mino加入2MH2S04终止反应，100 LI孔，用酶标仪测定OD450值。C.3.3 结果判定根据标准曲线确定待测中国地鼠血清中19G的含量。10 O.1 采血前准备附录D(规范性附录)血液样品采集要求采血前一般要求禁食8h12 h，不禁水。O.2 采血途径麻醉状态下，选择腹主动脉采血。0.3 采血方法OB14/T 1946-2019 麻醉动物，将动物固定鼠架，从腹正中线皮肤切开腹腔，暴露腹主动脉，用注射器吸取出血液，防止溶血。0.4 指标测定血液生理测定需采血后4h内测完全部数据:血液生化测定需采血后应尽快分离血清(浆)。采血后在室温下静置o.弛，然后3000r/min离心5min得到血清(浆)。血清(浆)样本放4C保存，凝血指标最好2h内测完。否则，应放-20C-70C保存，一个月内测完。0.5 注意事项为了保证酶洁性，减少其他指标的阵解，应避免反复冻融。11