DB15∕T 1939—2020 文冠果组织培养育苗技术规程(内蒙古自治区).pdf

TCS 65.020.20 B 05 DB15 内古军协古自主J口区地方标准DB 15/T 1939-2020 文冠果组织培养育苗技术规程Technical Regulation for Tissue Culture ofXanthoceras sorbifolia 2020-07-30发布2020-08-30实施内蒙古自治区市场监督管理局发布目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。本标准由内蒙古自治区林业和草原局提出井归口。本标准起草单位:内蒙古自治区林业科学研究院。本标准主要起草人:张文军、王美珍、黄卫丽、宁静。DB15/T 1939-2020 I DB15/T 1939-2020 文冠果组织培养育苗技术规程1 范围本标准规定了文冠果组织培养的术语和定义、环境及器具灭菌、培养基配制、外中直体及其灭菌、初代培养、增殖继代培养、壮苗培养、生根培养、组培瓶苗炼茵移栽和大四培育等基本内容及技术要求。本标准适用于文冠果组织培养育苗。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程OB15/T 1588 元宝枫组织培养育苗技术规程3 术语和定义LY/T 1882和OB15/1588界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 嫩茎Tenderstem 由腋芽经过初代诱导萌发长出的幼嫩枝条。3.2 壮苗Strongseed I i ng 组培过程中，嫩茎经再培养后形成的生长健壮、叶片舒展、口十色正常的微弱木质化枝条。4 环境及器具消毒灭菌4.1 准备室消毒每天用84消毒液等喷洒地面和实验台面，保持室内清洁。4.2 接种室消毒灭菌接种前用紫外汀照射30mi丑40min，消毒期间及关闭紫外灯20min内，人员不得进入。4.3 培养室消毒一个月左右进行1次，在使用前一天用二氧化氯消毒剂进行熏蒸，或用70%-75%酒精擦拭培养架。DB15/T 1939-2020 4.4 超;争工件台灭菌接种前应用紫外灯照射30min-40 min，开启无菌风40min后，操作前用70%-75%酒精喷洒台面:定期清洗超净工作台的过滤膜。4.5 器具灭菌4.5.1 接种工具灭菌接种前，将接种工具用滤纸包好，置于高温高压灭菌锅灭菌:使用前用酒精灯外焰灼烧20s以上，或用接种工具灭菌器直接灭菌。4.5.2 污染瓶(皿)灭菌、清洗将污染瓶用高温高压蒸汽灭菌锅灭菌后，去除污染物，再用洗沽精稀释液浸泡后清洗干净，晾干。4.6 操作人员入室要求进入接种室前，经风淋门进入缓冲室，穿戴经过消毒的工作服、帽子、口罩等。在操作前，用70%-75%酒精擦拭于部、臂部。5 培养基配制5.1 基本培养基的选择选择WPM和MS培养基为基本培养基。5.2 母液的配制和保存5.2.1 母液的配制MS培养基由几种化合物的混合母液配制。微量元素母液配制1000倍，铁盐和有机元素母液配制100倍，大量元素母液配制40倍，其中氧化钙和磷酸二氢饵单独配制成100倍母液，植物生长调节物质配制浓度0.21吨/mLMS培养基混合母液配制表参见附录A，植物生长调节物质的配制参见附录805.2.2 母液的保存母液配制后，贴标签，置于4oc环境下保存，并在3个月内使用，母液应无结晶无异色。标签需标明母液名称、倍数、配制时间和配制人等信息。5.3 基本培养基的配制5.3.1 准备配制前准备好蒸馆水、庶糖、琼月旨和各类母液，同时准备好移液检、容量瓶、量筒、量杯、天平、药匙、磁力搅拌器和国计等器具。5.3.2 f京脂自由化以配制1L培养基为例(下同)。加蒸馆水700mL左右，再加入5.8g琼脂，加热搅拌使琼脂融化。2 DB15/T 1939-2020 5.3.3 糖j容解琼脂融化后，加入30g、糖，搅拌使糖溶解。5.3.4 加母液和激素糖溶解后，加入母液，再根据不同培养基要求加入耐高温激素，充分搅拌。不耐高温的激素，如GA3、IBA,IAA、ABA等应在培养基高温高压灭菌后加入，加入前需过滤灭菌。5.3.5 定窑搅拌均匀后，加蒸悟水定容至1L 5.3.6 pH值测定和调节充分搅拌后，用pH计测定pH值，用1mo1/L的HCl或1mo1/L的NaOH调节至pH5.86.0。5.3.7 分装使用培养瓶定量分装，瓶中培养基厚度保持在1.5 cm2.0 cmo分装培养基时勿将培养基沾在培养瓶瓶口。分装后标注培养基种类代码。5.3.8封口盖紧瓶盖，或用封口膜封口O5.3.9 灭菌应用高温高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，通常在压力1.1 kg/cm2、温度121oc条件下保持20min30 min 即可。5.3.10 冷却灭菌后的培养基置于无菌接种室冷却，待完全凝固后使用。5.3.11 贮存灭菌后的培养基应标注配制日期。在无菌室温条件下贮存备用，贮存时间不应超过一个月。6 外植体及其灭菌6.1 外植体采集6-8月份，晴天10点至16点之间，j主取生长健壮、腋芽饱满、无病虫害的半木质化枝条。6.2 夕|、植体的灭菌将采集的枝条剪掉叶片，置于容器内用洗洁精饱和液浸泡10min，用软刷刷洗后，剪成长度810cm 的枝段，放入容器内，用1层纱布等网状物包裹容器口，用流水冲洗60min90 min后，置于超净工作台上灭菌:用70%酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用O.1%氧化末溶液浸泡5min，用无菌水冲洗58次，用灭菌滤纸吸附残留水分后接种。3 DB15/T 1939-2020 6.3 夕|、植体切段在超净工作台内，用灭菌后的剪刀和摄子将枝段均匀切分成长度2cm左右的外植体小段，每小段上部至少保留1个腋芽。7 初代培养7.1 初代培养基初代培养为WPM+6-BA 1.0 mg/L+NAA O.1mg/L+TDZ 0.05 mg/L+水解乳蛋白0.25g/L+肌醇0.2g/L 7.2 夕|、中直体的接种在超净工作台上，将外植体小段接种到初代培养基上，每瓶培养瓶接种l个外植体小段。小段下半部斜插入培养基内，封紧瓶口，标明接种日期。7.3 培养方法将接种后的培养瓶送到培养室，整齐摆放在组培架上，诱导腋芽萌发，培养15d-20 do培养室温度控制在25oC:!:2 oC，相对湿度保持在40%60%，光照强度控制在1500lx3000 lx，光照时间13 h/do 8 增殖继代培养8.1 继代培养基增值继代培养基为MS+6-BAO.3 mg/L+IBA O.8 mg/L+GA3 1.0 mg/L+AC O.1 mg/L+Ca(N03)2 1.0 g/L+琼脂6.0g/L+庶糖30.0 g/L。8.2 培养方法经初代培养，腋芽萌发的嫩茎生长到3cm5 cm时进行继代培养。在超净工作台上，将JJ代培养的嫩茎切成2cm左右且上部至少带有1个芽的茎段:每瓶培养基接种1个茎段，将茎段下半段插入培养基内，封紧瓶口，标注转接日期。将转接后的培养瓶送到培养室，整齐摆放在组培架上，20 d30 d继代1次。培养条件同7.309 l士苗培养9.1 l士苗培养基壮苗培养基为MS+6-BA0.1 mg/L+IBA 0.3 mg/L+AC 0.1 mg/L。9.2 培养方法将继代增殖中生长瘦弱、长度不足2cm的嫩茎整体转接到壮苗培养基中进行壮苗培养。培养20d 30 d。培养条件同7.30 4 DB15/T 1939-2020 10 生根培养10.1 生根培养基生根培养基为1/2MS+IBA O.5 mg/L。10.2 培养方法当继代增殖培养或经过士苗培养的嫩茎生长到2.0 cm5.0 cm时，剪取壮茵接种在生根培养基上进行生根培养，每个培养瓶接种1个壮苗。壮苗在培养基中的插入深度为5mm8mm，保持壮苗直立。培养20 d45 d可生根。培养条件同7.3011 组培瓶苗温室炼苗移栽11.1 炼苗当组培瓶苗达到23条长度1cm以上白色嫩根、35片正常绿叶、苗高5cm6 cm时，将其置于温度25oC:!:2 oC、湿度80%90%、光照强度1500lx2000 lx条件下的温室苗床上，锻炼3d后，去掉封口膜，再置于温室内小拱棚中，继续锻炼4do 11.2 移植11.2.1 基质处理采用体积比为松针土:珍珠岩:回国士为1:1:1混合物为基质。基质混合过程中均匀喷入多菌灵800倍液。11.2.2 移栽用慑子取出组培瓶苗，在流动水下洗去残留培养基，避免损伤苗根;在口径9cm、深12cm的营养钵内填装适量基质，将清洗后的组培瓶苗移栽到营养钵中，过程中避免伤根。移栽后置于小拱棚内C11.2.3 移栽后管理采用细喷雾喷水、遮阴网调节小拱棚内温湿度，保持湿度80%90%、昼温21oC29 C、夜温18 C21 C、基质湿润，1周后，逐渐降低湿度。11.2.4 有害生物防治移栽前对温室用百菌清烟雾剂熏蒸1次。移栽后每隔7d喷施1次多菌灵。12 大田育苗12.1 容器苗炼苗生长季节，将容器苗从温室移至大田炼苗。将容器苗整齐紧密摆放在苗圃背风处，先用80%透光率的遮阴网遮盖炼苗1用，然后在自然条件下炼苗1周。12.2 大田培育5 DB15/T 1939-2020 12.2.1 整地育苗地于前一年秋季深翻，并施入适量腐熟有机肥。12.2.2 栽植按株E30cm40cm、行距50cm挖穴，移栽时去掉营养钵带土移栽，移栽后要及时灌溉，一周后浇第二水灌溉。适时做好除草、松土、追肥、灌水等田间管理工作。6 DB15/T 1939-2020 附录A(资料性附录)MS 培养基混合母液配制表A.1 MS培养基混合母液配制表扩大后称母;夜走容体积配置培养基母液名称编号化试名称mg/L 扩大倍数吸取量mg mL mL/L NH4N01 1650 40 66000 A KN01 1900 40 76000 1000 25 大量元素MgS04 7H,O 370 40 14800 B CaCI2 2H20 440 100 44000 1000 10 C KH2PO,170 100 17000 1000 10 FeSO,7H20 27.8 100 2780 铁盐D 1000 10 NaDTA 2H,O 37.2 100 3720 MnS04.4H,O 22.3 100 2230 E ZnSO,7H,O 8.6 100 860 1000 10 HOl 6.2 100 620 微量兀素KI 0.83 100 83 Na,Mo04 2H,O o.25 100 25 F 1000 10 CuSO,5H,O o.025 100 2.5 CoCL 6H,O o.025 100 2.5 甘氨酸2 100 200 盐酸硫肢素B1o.1 100 10 G 1000 1 有机成分盐酸口比哆酸B6o.5 100 50 烟酸o.5 100 50 H 月几回事100 100 5000 500 10 7 DB15/T 1939-2020 附录B(资料性附录)常见植物生长调节物质母液配制表B.1 常见植物生长调节物质母液配制表市用浓度类别种类配置方法mg/L 6-BA 0.1-0.2 KT 先加少量水，然后滴加少量O.lmol/L的盐酸(HCl)溶解，0.05-2.0 细胞分裂素ZT 然后加茶馆水定容。0.05-2.0 TDZ 0.01-0.05 IAA 0.1-1.0 IBA 0.05-1.0 生长素先用少量尤水乙醇浴解，然后加蒸馆水定容。NAA 0.01-0.5 2,4-D 0.01-2.0 赤霉素GA生先用少量无水乙醇浴解，然后加水定容。0.01-0.5 8