《蛋白互作研究方法》.ppt

蛋白质相互作用蛋白质相互作用研究方法研究方法王心宇王心宇College of Life Sciences1整理ppt1 研究蛋白质相互作用的意义研究蛋白质相互作用的意义 随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科蛋白质组学proteomicsproteomics应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,对于蛋白质相互作用interactomeinteractome的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一。2整理ppt2 蛋白质相互作用常用研究方法蛋白质相互作用常用研究方法1 酵母双杂交(Yeast two-hybrid,Y2H)2 pull-down3 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)4 双分子荧光互补技术(Biomolecular fluorescence complementation,BiFC or Split YFP)5 Far-western analysis3整理ppt3 酵母双杂交技术酵母双杂交技术3.1 原理原理DNA-binding and activating functions in a transcription factor may comprise independent domains of the protein.4整理pptThe two hybrid technique tests the ability of two proteins to interact by incorporating them into hybrid proteins where one has a DNA-binding domain and the other has a transcription-activating domain.5整理ppt3.2 酵母双杂交文库构建与筛选酵母双杂交文库构建与筛选BD Matchmaker Library Construction&Screening Kits6整理ppt诱饵蛋白载体构建诱饵蛋白载体构建7整理ppt8整理pptpGADT7-Rec Vector Information9整理ppt文库构建文库构建10整理ppt11整理pptConstructing AD fusion libraries by recombination-mediated cloning in yeast.12整理pptcDNA library of oilseed rape line RS-1 constructed in yeast13整理pptYeast cells that are mating.A zygote typically has three-lobed shape,the lobes representing the two haploid(parental)cells and the budding diploid cells.Library screening by mating14整理pptPositive clones confirmed on SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal15整理ppt检测特定两个蛋白是否互作检测特定两个蛋白是否互作16整理pptpGADT7 Vector Information17整理ppt3.3 膜蛋白互作研究方法膜蛋白互作研究方法基于泛素的酵母双杂交基于泛素的酵母双杂交体系体系(mating-based Split ubiquitin system mbSUS“)1）GAL4体系的缺点体系的缺点2)MbSUS 体系体系18整理pptmbSUS 原理原理19整理ppt20整理pptIn vivo cloning into mbSUS vectorsGATEWAY cloning method21整理ppt22整理ppt23整理ppt24整理ppt25整理ppt26整理ppt27整理ppt28整理ppt4 pull down1)原理原理29整理ppt30整理ppt2)试剂盒试剂盒31整理pptThe MagneGST.Pull-Down System32整理pptFigure 1.Overview of the MagneGST.Pull-Down System protocol.P=Prey Protein,M=MagneGST.Particle.33整理ppt5 免疫共沉淀免疫共沉淀Co-IP34整理ppt35整理ppt36整理ppt6 Far-western analysis37整理ppt 双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)分析技术，利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其突变体(YFP,CFP,BFP)的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义。7 双分子荧光互补技术双分子荧光互补技术 BiFCBiFC38整理pptPrinciple of the BiFC assay39整理pptGFPGFP的特性的特性 绿色荧光蛋白(GFP)来源于水母(Aequorea victoria)，分子质量约为27 kda，能在各种细胞中表达.受到激发时，不需要任何辅助因子，就能在活体中发出绿色荧光.1992 年，Prasher 等2克隆了GFP 基因.随后，GFP 作为一种研究基因表达和蛋白质定位的活体可遗传标记，在各种类型细胞的研究中得到了广泛的应用.40整理pptGFP 的一些定点突变能明显地改变其波长性质.产生的突变体,具有产生多色光的特性，如：GFP66 位的酪氨酸突变为色氨酸酪氨酸突变为色氨酸后成为青色荧光蛋白(cyan fluorescence protein，CFP)，203 位的苏氨酸突变为酪氨酸后成黄色荧光蛋白(yellow fluorescence protein，YFP)，145 位酪氨酸突变为苯丙氨酸后成蓝色荧光蛋白(blue fluorescence protein，BFP)3.2002 年Hu 等1 最先报道了用BiFC技术在活细胞中观察bZIP 和Rel 家族蛋白的相互作用，利用的就是YFP 作标记，在荧光显微镜下用525 nm 波长直接检测黄色荧光.41整理pptGFP及其各种突变体的片段互补特性及其各种突变体的片段互补特性42整理pptVisualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation43整理pptDetection of proteinprotein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementationDepartment of Plant Sciences,Tel Aviv University,Tel Aviv 69978,Israel44整理pptConfocal images of bimolecular fluorescence complementation(BiFC)studies45整理pptIPG735+PG73646整理pptIPG735+PG73647整理pptPpn20-735+PG73648整理pptPpn20-735+PG736,蛋白互作可能导致internalization49整理ppt多色荧光多色荧光互补技术互补技术50整理ppt