黄喉拟水龟Cathelicidin基因克隆及表达分析.pdf

5期1559黄喉拟水龟Cathelicidin基因克隆及表达分析魏华1，谭雯予1，吴志刚1，杨祖鹏1，张洪耀1，韩书煜2，施金谷2，黄德生3，梁静真1*，黄钧1*（1广西大学动物科学技术学院/广西水生动物病害诊断实验室/广西高校水生生物健康养殖与营养调控重点实验室，广西南宁530004；2广西水产技术推广站，广西南宁530022；3合浦县水产技术推广站，广西北海536199）摘要：【目的】克隆黄喉拟水龟（Mauremys mutica）Cathelicidin基因（MmCath）并分析其组织表达特征，为深入研究MmCath基因在黄喉拟水龟先天免疫中的潜在作用提供理论依据。【方法】运用RACE克隆黄喉拟水龟MmCath基因cDNA序列，利用生物信息学软件进行序列特征分析，并通过实时荧光定量PCR检测MmCath基因在黄喉拟水龟不同组织中的表达特征及细菌攻毒后的表达情况。【结果】MmCath基因cDNA序列全长777 bp，包括63 bp的5非编码区、483 bp的开放阅读框（ORF）和231 bp的3非编码区。MmCath基因编码160个氨基酸残基，包括N端的信号肽区，含有4个保守半胱氨酸（Cys）残基的Cathelin肽区和C端的成熟肽区，符合Cathelicidins蛋白家族典型特征。MmCath前体蛋白相对分子质量为17.74 kD，理论等电点（pI）为5.27，其二级结构中-螺旋占31.25%，无规则卷曲占20.63%，-折叠占48.12%。黄喉拟水龟MmCath前体蛋白氨基酸序列与西部锦龟（Chrysemys picta bellii）Cathelicidin氨基酸序列的相似性最高，达80.63%，亲缘关系最近。MmCath基因在黄喉拟水龟的表达具有组织差异性，以脾脏和肝脏中的相对表达量较高，在表皮、心脏、肾脏、肺脏、脑、肠道和肌肉等组织中的相对表达量较低；嗜水气单胞菌（Aeromonas hy-drophila）攻毒后MmCath基因表达上调，在攻毒后第3和第6 h其相对表达量极显著高于攻毒前（0 h）的相对表达量（P0.01，下同），之后有所下降，在攻毒后第36 h再极显著上升，随后下降。【结论】从黄喉拟水龟中克隆的MmCath基因属于Cathelicidins基因家族，参与了黄喉拟水龟抗病原感染过程，可为有效控制黄喉拟水龟细菌性疾病提供新思路。关键词：黄喉拟水龟；Cathelicidin基因；基因克隆；表达特征中图分类号：S947.1文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）05-1559-09收稿日期：2023-01-23基金项目：广西自然科学基金项目（2018GXNSFAA138167）通讯作者：梁静真（1986-），https:/orcid.org/0000-0002-6970-1548，博士，主要从事水产养殖及病害防治研究工作，E-mail：；黄钧（1957-），https:/orcid.org/0009-0003-6373-2057，教授，主要从事水生动物病害防控技术研究工作，E-mail：第一作者：魏华（1994-），https:/orcid.org/0009-0006-1083-3083，研究方向为水产养殖及病害防治，E-mail：727654648 南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（5）：1559-1567ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.05.028Cloning and expression analysis of Cathelicidin gene inMauremys muticaWEI Hua1，TAN Wen-yu1，WU Zhi-gang1，YANG Zu-peng1，ZHANG Hong-yao1，HAN Shu-yu2，SHI Jin-gu2，HUANG De-sheng3，LIANG Jing-zhen1*，HUANG Jun1*（1College ofAnimal Science and Technology，Guangxi University/Guangxi Laboratory ofAquaticAnimal DiseaseDiagnosis/Guangxi University Key Laboratory ofAquatic Healthy Breeding and Nutrition Regulation，Nanning，Guangxi 530004，China；2Guangxi General Station ofAquaculture Technology Extension，Nanning，Guangxi 530022，China；3Hepu Station ofAquaculture Technology Extension，Beihai，Guangxi 536199，China）Abstract：【Objective】The Cathelicidin gene of Mauremys mutica（MmCath）was cloned and its tissue expression pat-tern was analyzed，so as to provide theoretical foundation for further studying the potential function of MmCath gene inthe innate immunity of M.mutica.【Method】The cDNA sequence of the MmCath gene of M.mutica was cloned by RACE.Sequence analysis was conducted by bioinformatics software.The expression patternof MmCath gene in different tissuesof M.mutica and its expression change after bacterial challenge were identified by real-time fluorescence quantitativePCR.【Result】The full length of the cDNA sequence of MmCath gene was 777 bp，including a 5 noncoding region of 63bp，an open reading frame（ORF）of 483 bp，and a 3 noncoding region of 231 bp.The MmCath gene encoded 160 amino54卷南 方 农 业 学 报 15600引言【研究意义】黄喉拟水龟（Mauremys mutica）俗称石龟，隶属于龟科拟水龟属（马风娟等，2020），药用和经济价值均较高（牟超盛等，2021），自20世纪80年代开始人工养殖，目前在广西、广东和海南等地养殖量较大（李爵乾和杨火廖，2018）。在高密度饲养条件下，黄喉拟水龟病害不断暴发，给其养殖业带来巨大经济损失，而养殖户滥用或乱用抗生素极易引发细菌耐药及食品安全问题。Cathelicidins是脊椎动物特有的抗菌肽家族之一，也是动物先天免疫的重要组成部分，具有广谱抗微生物活性且不容易产生耐药性（Yacoub et al.，2016；王妍等，2021）。因此，克隆黄喉拟水龟Cathelicidin基因（MmCath）并分析其组织表达特征，对进一步了解黄喉拟水龟的先天免疫系统及促进黄喉拟水龟养殖业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】基因Cathelicidins最早发现于牛嗜中性粒细胞和猪骨髓细胞中（董锐等，2017），随后陆续在灵长类、有蹄类和啮齿类等哺乳类动物中发现（陈晨，2017），随着研究领域的不断扩大，近年来还在非哺乳类的鸟类、爬行类、两栖类和鱼类中发现Cathelicidins基因（Chang et al.，2006；甘同香，2008；陈晨，2017）。龟鳖类已发现Cathelicidins基因的物种包括黄沙鳖（Truogx sinensis）（马沙等，2019）、西部锦龟（Chrysemys picta bellii）、海龟（Che-lonia mydas）（Qiao et al.，2019）及中华鳖（Pelodis-cus sinensis）（Shi et al.，2019）等。各种来源的Cat-helicidins前体蛋白具有相似的结构特征，包含N端的信号肽区、有4个保守半胱氨酸残基的Cathelin肽区及C端高度特异的成熟肽区（王妍等，2021）。Cathe-licidin前体蛋白通常无生物活性，需经特定蛋白酶酶切作用后才能释放出具有活性的成熟肽（Sun et al.，2015）。Cathelin肽区含有数量较多并带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸残基，可中和富含正电荷的成熟肽区，使Cathelicidins前体蛋白维持无活性状态，避免损伤自身细胞（广慧娟，2013；王妍等，2021）。已有研究认为，富含正电荷的Cathelicidins成熟肽容易吸附在带负电荷细菌的细胞膜表面（王晨等，2017；彭练慈等，2022），通过与细菌细胞膜的阴离子磷脂或与革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖（LPS）相互作用以杀灭细菌，不易引起细菌耐药性（Bucki et al.，2004）。Cathelicidins成熟肽除具有抗菌活性外，还参与宿主的各种防御性生理进程，如抗氧化、抑制组织损伤和免疫调节等（王晨等，2017）。Tomasinsig等（2010）研究指出，牛Cathelicidin BMAPs成熟肽可诱导乳腺上皮细胞中TNF-a因子表达；Veldhuizen等（2014）研究表明，猪Cathelicidin PR-39成熟肽能诱导宿主细胞的白细胞介素-8和肿瘤坏死因子TNF-a表达，可抑制TNF-a因子引起的感染；杨俊（2019）研究认为，高原腹斑倭蛙（Nanorana ventripunctata）的Cathelicidin-NV成熟肽具有抑制组织损伤能力；罗暄巾（2021）研究发现，贵州疣螈（Tylototriton kweichowe-nsis）的Cathelicidin成熟肽（TK-CATH）能抗炎、抗氧化和促进伤口愈合。【本研究切入点】目前，关于黄喉拟水龟MmCath基因克隆及其基因表达特征的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过克隆MmCath基因并分析其在黄喉拟水龟组织的分布特征及细菌攻毒后的表达情况，探究MmCath基因在黄喉拟水龟先天免疫中的潜在作用，为促进黄喉拟水龟养殖业健康发展提供参考依据。acid residues，which contained the signaling peptide region at the N terminus，the Cathelin peptide region with 4 con-served cysteine（Cys）residues，and the mature peptide region at C terminus，in accordance with the typical family characte-risticsofCathelicidinsproteinfamily.MmCathprecursorproteinhadarelativemolecularweightof17.74kDaandtheoreticalisoelectric point（pI）of 5.27.In its secondary structure，-helix accounted for 31.25%，random coil 20.63%and-turn48.12%.The amino acid sequence of MmCath precursor protein shared a highest sequence similarity（80.63%）and closestgenetic relationship with the amino acid sequence of Cathelicidin in Chrysemys picta bellii.Expressions of MmCath genewere different in various tissues in M.mutica.Its higher relative expressions were shown in spleen and liver，while the re-lative expressions were lower in the tissues like skin，heart，kidney，lung，brain，intestine，and muscle.Up regulation ofexpression was shown in MmCath gene after the challenge of Aeromonas hydrophila.The relative expression levels at 3and 6 h were extremely significantly higher than that at before challenge（0 h）（P0.01，the same below），and thendecreased.It markedly increased again at 36 h post challenge and decreased afterwards.【Conclusion】The MmCath genecloned from M.mutica belongs to the Cathelicidins gene family.It involves in the process of resisting attack of invadingpathogen of M.mutica and can provide new ideas for effective control of bacterial diseases of M.mutica.Key words：M.mutica；Cathelicidin gene；gene cloning；expression patternFoundation items：Guangxi Natural Science Foundation（2018GXNSFAA138167）5期15611材料与方法1.1试验材料健康黄喉拟水龟购自广西凭祥市某龟鳖养殖场，体质量约69.420.1 g。经30 d养殖观察及抽样检测，确定黄喉拟水龟健康未携带病原后用于攻毒试验。攻毒试验采用的嗜水气单胞菌（Aeromonashydophila）分离自广西患病黄喉拟水龟，经鉴定后保存于-80 冰箱，在使用前再次进行生化鉴定和分子鉴定。TRIzol试剂和DNA聚合酶购自广西南宁博美生物科技有限公司；SMARTer RACE 5/3 Kit试剂盒和PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；实时荧光定量PCR混合酶2SYBR Green qPCR Mix购自北京康润诚业生物科技有限公司。1.2试验方法1.2.1RNA提取及cDNA合成采用TRIzol法提取总RNA，以紫外分光光度计测定其纯度和浓度。基因克隆使用SMARTer RACE 5/3 Kit试剂盒反转录合成cDNA；基因组织分布分析使用PrimeScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录。1.2.2引物设计及基因克隆首先，根据NCBI已公布的龟鳖类Cathelicidins基因序列，设计3端克隆引物MmCath-F1和MmCath-F2（表1）。然后，以1.2.1中的总RNA为模板，采用SMARTer RACE 5/3 Kit试剂盒进行3端反转录后对MmCath基因3端序列进行PCR扩增，扩增产物连接转化后送至北京六合华大基因科技有限公司测序。根据已获得的MmCath基因3端序列，设计引物MmCath-R1和MmCath-R2（表1），采用SMARTer RACE 5/3 Kit试剂盒进行5端反转录后以PCR扩增MmCath基因5端序列，序列片段经连接转化后测序。最后，将测序成功的上述片段拼接成完整cDNA序列。利用NCBI的ORFFinder查找开放阅读框（ORF），并以MmCath-ORF-F和MmCath-ORF-R为引物验证ORF。1.2.3MmCath基因在黄喉拟水龟不同组织中的表达分析随机剖检3只健康黄喉拟水龟，取其肝脏、脾脏、心脏、肺脏、肾脏、肠道、肌肉、脑和表皮的组织样品，按照1.2.1的方法进行总RNA提取和cDNA合成。以MmCath基因序列为依据设计实时荧光定量PCR引物MmCath-qPCR-F和MmCath-qPCR-R，根据NCBI已公布的黄喉拟水龟18S rRNA序列（登录号KP765693.1）设计内参基因18S rRNA引物Mm18S-F和Mm18S-R（表1）。通过实时荧光定量PCR检测MmCath基因的组织表达特异性，采用2-Ct法计算MmCath基因相对表达量。以肌肉组织中MmCath基因相对表达量为1，每个样品设3次重复，采用SPSS22.0中的Duncans新复极差法对MmCath基因的相对表达量进行统计分析。1.2.4MmCath基因在攻毒后的表达情况参考马沙（2019）、许飘尹等（2020）的方法，将嗜水气单胞菌接种于LB琼脂培养基上，28 培养20 h后，挑取适量菌苔重悬于无菌生理盐水以配制106CFU/mL菌悬液。设攻毒组和对照组，各组分别将制备好的菌悬液和无菌生理盐水以腹腔注射方法对健康黄喉拟水龟进行攻毒试验（0.2 mL/只），攻毒组注射嗜水气单胞菌菌悬液，对照组注射等量生理盐水。注射后将2组黄喉拟水龟置于不同养殖箱中进行正常养殖和观察，在注射前及注射后第3、6、12、24、36和48 h，从各组分别随机挑3只龟取其脾脏提取总RNA。参照1.2.3的方法检测MmCath基因的表达情况，每个样品设3次重复，采用 t 检验对其进行显著性分析。1.2.5生物信息学分析采用DNAMAN 10.0对Cathelicidins前体蛋白氨基酸序列进行多重比对，以DNASTAR 7.1分析氨基酸序列的相似性和蛋白理化性质，以ClustalX和MEGA 7.0基于Cathelicidins前体蛋白氨基酸序列构建系统发育进化树。分别采用TMHMM 2.0和SignaIP 5.0预测跨膜结构和信号肽，运用SWISS-MODEL网站构建蛋白三级结构模型，以PyMOL 2.1对该模型进行编辑。2结果与分析2.1黄喉拟水龟MmCath基因克隆及序列分析结果从图1可看出，MmCath基因cDNA全长777 bp，含有63 bp的5非编码区、483 bp的ORF和231 bp的3非编码区。从图2可看出，MmCath基因cDNA序列具有起始密码子ATG和终止密码子TAA，以及1个多聚腺苷酸化信号AATAAA和1个poly（A）尾，信息完整。MmCath基因编码160个氨基酸残基，包括16个氨基酸组成的信号肽区（第116位aa）、112个氨基酸组引物 PrimerMmCath-F1MmCath-F2MmCath-R1MmCath-R2MmCath-ORF-FMmCath-ORF-RMmCath-qPCR-FMmCath-qPCR-RMm18S-FMm18S-R引物序列 Primer sequence5-GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC-35-ATTCAAAGAAGACGGGCTGGTCAAAG-35-GCTACGTAACGGCATGACAGTG-35-AACAGGACCCCCCTTCCATCATTATC-35-ATGGAGACCTGCCTGAAAGTCCTG-35-TTATCCAAATATTTTGAGACCAGT-35-TTCAAAGAAGACGGGCTGGT-35-TCACAAGGAGTCGCTGGAAA-35-AAAGGAATTGACGGAAGGGCAC-35-GCTCCACCAACTAAGAACGG-3表 1扩增引物序列信息Table 1Amplification primers sequences魏华等：黄喉拟水龟Cathelicidin基因克隆及表达分析54卷南 方 农 业 学 报 1562成的Cathelin肽区（第17128位aa）和32个氨基酸组成的成熟肽区（第129160位aa）。经DNASTAR 7.1分析，MmCath前体蛋白的原子总数为2496个，相对分子量为17.74 kD，理论等电点（pI）为5.27，分子式为C791H1249N209O241S6，亲水性指数（GRAVY）为-0.237。MmCath前体蛋白由20种氨基酸组成，其中亮氨酸（L）和苏氨酸（T）数量较多，分别占9.40%和8.80%，组氨酸（H）和蛋氨酸（M）数量最少，均占0.60%；带正电荷和负电荷氨基酸所占比例分别为23.75%和13.12%。成熟肽区具有10个带正电荷的氨基酸 分别为6个精氨酸（R）和4个赖氨酸（K）和1个带负电荷的天冬氨酸（D），其中，带正电荷的氨基酸占31.25%，净正电荷量为9个正电荷。成熟肽相对分子量为3938.65 Da，pI为12.31（图2）。2.2MmCath前体蛋白序列比对及进化分析结果从图3可看出，在Cathelin肽区，MmCath前体蛋白氨基酸序列与其他物种Cathelicidins氨基酸序列有较高的相似性，均包含4个保守的半胱氨酸（C）残基，具有Cathelicidins蛋白家族典型特征；在成熟肽区，各种来源的Cathelicidins氨基酸序列差异较明显。系统发育进化树（图4）显示，MmCath前体蛋白氨基酸序列与西部锦龟相似性最高，达80.63%；其次是与中华鳖，相似性为72.50%。整体上，MmCath前体蛋白氨基酸序列首先与爬行动物的Cathelicidins图 1MmCath基因ORF的PCR扩增结果Fig.1PCR amplification result of ORF of MmCath geneM：DL1000 DNAMarker；1：阴性对照；2：MmCath基因ORF片段M：DL1000 DNA Marker；1：Negative control；2：Fragment of ORF ofMmCath gene图 2MmCath基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列Fig.2The nucleotide sequence of the MmCath gene and the deduced sequence of the amino acids推导氨基酸序列以粗体表示；起始密码子ATG以红色显示；信号肽区以黄色表示；成熟肽区以灰色表示；终止密码子TAA以星号表示；多聚腺苷酸化信号AATAAA由下划线表示The deduced amino acid sequences was indicated by the bold font；the initiation codonATG was indicated by red color；the signaling peptide regionwas indicated by yellow color；the mature peptide region was indicated by gray color；the termination codon TAAwas indicated by an asterisk；thepolyadenylation signalAATAAAwas indicated by underscoreM121000 bp700 bp500 bp400 bp300 bp200 bp100 bp483 bp5期1563氨基酸序列聚为一支，再与鸟类和哺乳动物的Cat-helicidins氨基酸序列聚为一个大支；鱼类的Catheli-cidins氨基酸序列单独聚为另一个大支，说明Cathe-licidins基因的进化符合物种进化关系。2.3MmCath前体蛋白结构预测结果通过TMHMM 2.0对MmCath前体蛋白进行跨膜结构预测，可知MmCath前体蛋白无跨膜结构域；以SignalP 5.0预测MmCath前体蛋白信号肽，可看出其由第116位氨基酸（METCLKVLLLVGVVTA）组成（图5），说明MmCath前体蛋白是一种分泌蛋白。二级结构预测结果显示，MmCath前体蛋白的-螺旋占31.25%，无规则卷曲占20.63%，-折叠占48.12%。运用SWISS-MODEL构建MmCath前体蛋白三级结构模型，结果（图6）显示，MmCath前体蛋白三级结构包含-螺旋、-折叠和无规则卷曲；Cathelin肽区4个保守的半胱氨酸残基可形成2对二硫键，即79Cys-90Cys和101Cys-118Cys，进一步证实所克隆的MmCath基因属于Cathelicidins基因家族。81100988710083100100100黄喉拟水龟 M.mutica MmCath西部锦龟 C.picta bellii XP 023965510.1中华鳖 P.sinensisAWW22373.1鬃狮蜥 P.vitticeps XP 020655918.1棱皮龟 D.coriacea XP 038246569.1鹤鹑 C.japonica XP 015708427.1红原鸡 G.gallus NP 001001605.1猕猴 M.mulatta NP 001028681.1智人 H.sapiens NP 004336.4倭黑猩猩 P.paniscus XP 003818474.1虹鳟 O.mykiss NP 001117935.1大西洋鲑 S.salar NP 001117058.10.20图 3不同来源Cathelicidins氨基酸序列比对分析结果Fig.3Alignment of amino acid sequences of Cathelicidins of various sources1：MmCath；2：西部锦龟（XP 023965510.1）；3：中华鳖（AWW22373.1）；4：棱皮龟（XP 038246569.1）；5：鹌鹑（XP 015708427.1）；6：红原鸡（NP 001001605.1）；7：猕猴（NP 001028681.1）；8：智人（NP 004336.4）；9：倭黑猩猩（XP 003818474.1）；10：鬃狮蜥（XP 020655918.1）1：MmCath；2：C.picta bellii（XP 023965510.1）；3：P.sinensis（AWW22373.1）；4：Dermochelys coriacea（XP 038246569.1）；5：Coturnix japonica（XP 015708427.1）；6：Gallus gallus（NP 001001605.1）；7：Macaca mulatta（NP 001028681.1）；8：Homo sapiens（NP 004336.4）；9：Pan paniscus（XP 003818474.1）；10：Pogona vitticeps（XP 020655918.1）图 4基于Cathelicidins前体蛋白氨基酸序列构建的系统发育进化树Fig.4Phylogenetic tree based on amino acid sequence of Cathelicidins precursor proteins魏华等：黄喉拟水龟Cathelicidin基因克隆及表达分析54卷南 方 农 业 学 报 15642.4MmCath基因的组织表达特异性图7显示，MmCath基因在健康黄喉拟水龟的表达具有组织表达特异性。其中，在脾脏中的相对表达量最高（是肌肉表达量的11.9倍），显著高于其他组织（P0.05，下同）。2.5攻毒后MmCath基因在黄喉拟水龟脾脏中的表达情况从图8可知，攻毒组黄喉拟水龟脾脏的MmCath基因在嗜水气单胞菌攻毒后呈上调表达，其相对表达量在攻毒后第3 h（14.8倍）和第6 h（16.7倍）极显著高于0 h的相对表达量（P0.01，下同），在第12和第24 h有所下降，至攻毒后第36 h再极显著上升（5.7倍），随后在第48 h开始下降。MmCath基因在攻毒后12、24和48 h的相对表达量与攻毒前（0 h）均无显著差异；对照组黄喉拟水龟脾脏的MmCath基因在注射生理盐水后各时间点的相对表达量与攻毒前（0 h）无显著差异。3讨论Cathelicidins是一类具有广谱抗微生物活性的多功能抗菌肽，在动物先天免疫系统中发挥着极其重要的作用（广慧娟，2013）。本研究克隆获得黄喉拟水龟MmCath基因的cDNA序列信息完整，与其他来源Cathelicidins前体蛋白具有相似的结构特征，属于Cathelicidins基因家族；多重序列比对分析结果显示，Cathelicidins前体蛋白在Cathelin肽区较保守，说明Cathelicidins基因家族成员可能来源于同一祖先基因；其在成熟肽区高度特异，可能与各物种为适应不同生存环境和病原而朝不同方向进化有关。系统发育进化树显示，MmCath前体蛋白与爬行动物的图 5MmCath前体蛋白的信号肽预测结果Fig.5Signaling peptide prediction result of MmCath precursorprotein图 6MmCath前体蛋白三级结构预测结果Fig.6TertiarystructurepredictionofMmCathprecursorprotein79Cys-90Cys-sheet101Cys-118Cys-helixRandom coil图 7MmCath基因在黄喉拟水龟不同组织中的表达特征Fig.7Expression pattern of MmCath gene in different tissuesof M.mutica图柱上不同小写字母表示差异显著（P0.05）Different lowercase letters on the bar represented significant difference（P0.05）0.80.40.0概率 Probability0204060位置 Position表皮 Skin心脏 Heart肝脏 Liver发脾脾脏 Spleen肾脏 Kidney肺脏 Lung脑 Brain肠道 Intestine肌肉 Muscle组织 Tissue相对表达量Relative expression15.010.05.00.0abccccccc图 8嗜水气单胞菌攻毒后MmCath基因在黄喉拟水龟脾脏中的表达情况Fig.8Expression changes of MmCath gene in the spleen ofM.mutica after the challenge ofA.hydrophila*表示差异极显著（P0.01）*represented extremely significant difference（P0.01）20.015.010.05.00.003612243648*攻毒后时数（h）Hours post injection相对表达量Relative expression攻毒组 Infection group对照组 CK group5期1565Cathelicidins氨基酸序列聚为一支，再与鸟类和哺乳动物的Cathelicidins氨基酸序列聚在同一大支，而鱼类Cathelicidins氨基酸序列单独聚在另一支，表明Cathelicidins基因在进化上虽然变异较大，但总体上符合物种进化规律。MmCath成熟肽净正电荷量为9个正电荷，推测富含正电荷的MmCath成熟肽能以静电吸附方式聚集在带负电荷细菌的细胞膜表面，使细菌细胞破损从而发挥抗菌作用，且不易引起耐药性（王晨等，2017；彭练慈等，2022）；MmCath前体蛋白Cathelin肽区的天冬氨酸和谷氨酸残基数量较多，推测这些带负电荷的氨基酸残基可在MmCath前体蛋白阶段和富含正电荷的成熟肽区使MmCath前体蛋白以无活性状态存在，以减少其对自身细胞的毒性（广慧娟，2013；王妍等，2021）。MmCath前体蛋白Cathelin肽区的C端包含由4个半胱氨酸残基，与已报道的其他Cathelicidins前体蛋白一致，可形成2对二硫键，该结构可能与维持MmCath前体蛋白构象的稳定有关（王妍等，2021）。总体上，MmCath成熟肽可能具有较强的抗菌活性，有望开发成为新型抗菌药。Cathelicidins基因在动物的许多组织中均有表达（王梅，2015），而不同物种Cathelicidins基因在各组织中的表达分布具有差异性（吴宝兰，2021）。鸡Cathelicidins基因主要在皮肤、呼吸道、胃肠道和淋巴器官中表达（Achanta et al.，2012）；安乐蜥（Anoliscarolinensis）的Ac-MmCath-3基因在肝脏、脾脏、肾脏和肺脏中均有大量表达，而在皮肤中几乎不表达（Dalla et al.，2013）；脆皮大头蛙（Limnonectes fragi-lis）的Cathelicidins基因（Lf-CATHs）在脾脏、肝脏和肾脏的表达量较高，在肺脏、皮肤和胃的表达量较低（Yu et al.，2013）；林麝（Moschus berezovskii）的Cat-helicidins基因在脾脏和肺脏表达量较高，其次是肝脏，在肌肉中的表达量最低（Zhang et al.，2019）；黄沙鳖Cathelicidin基因在脾脏和肝脏的相对表达量较高，其次是心脏，在脑、肾脏、肠道、肌肉、表皮和背甲的相对表达量较低（马沙等，2019）。不同物种Cat-helicidins基因在其各组织中的表达差异预示着其可能参与不同的生理进程。本研究中，MmCath基因在黄喉拟水龟不同组织中均有表达，其中在病原感染主要靶器官脾脏和肝脏的相对表达量较高，说明MmCath基因可能在抵抗致病微生物侵入过程中发挥着重要作用；在攻毒后的第3、6和36 h，黄喉拟水龟脾脏中的MmCath基因表达量显著上调，表明黄喉拟水龟在受到致病微生物感染时可诱导MmCath基因上调表达。已有研究表明，结核分枝杆菌（Myco-bacterium tuberculosis）能诱导人类Cathelicidin LL-37基因表达，此过程可能受NADPH/ROS信号通路的影响；调控元件NF-B、NF-IL-6和AP-1也可能参与调控结核分枝杆菌诱导LL-37基因表达（张志芳等，2022）。本研究中，嗜水气单胞菌诱导MmCath基因表达上调受何种信号通路介导仍需进一步探究；攻毒后，黄喉拟水龟脾脏中的MmCath基因表达先上调再下降，然后再度上调和下降，与黄沙鳖的Cathe-licidins基因在温和气单胞菌（A.sobria）感染后表达的变化趋势（马沙等，2019）相似，究其原因可能是：（1）MmCath基因5端启动子区域可能同时存在正向和负向调节的转录因子结合位点，如猪CathelicidinPR-39基因5端启动子区域既存在正向调控元件NF-B、NF-IL-6和IL-6-RE等，也存在可抑制PR-39基因表达的负向调节元件（雷剑等，2007），在攻毒后MmCath基因的表达可能受正向或负向转录因子调控而导致表达量上升或下降。（2）嗜水气单胞