槐角黄酮通过调控miR-4284表达对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响及其机制.pdf

世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，实验研究 ：基金项目：河南省医学科技攻关计划项目（）作者单位：安阳市人民医院消化内科，河南 安阳 ；安阳市人民医院呼吸内科，河南 安阳 通信作者：王少芳，：槐角黄酮通过调控 表达对结直肠癌 细胞增殖和凋亡的影响及其机制张海波黄宏春王秀敏王少芳【摘要】目的探讨槐角黄酮对结直肠癌 细胞增殖和凋亡的影响及分子机制。方法 细胞用 培养基常规培养，作为对照组，分别用浓度为 、的槐角黄酮处理，记为槐角黄酮 低、中、高组；将 抑制剂及阴性对照载体质粒转染至 细胞，记为 组、组；将 模拟物及阴性对照转染至 细胞后用 的槐角黄酮处理，记为槐角黄酮 组、槐角黄酮 组。检测细胞抑制率；展开克隆形成实验并检测相关克隆细胞数量；应用流式细胞术确认细胞凋亡情况；蛋白表达水平采用蛋白质印迹法完成；实时荧光定量 （）检测结直肠癌组织和 细胞中 的表达水平。结果不同浓度槐角黄酮处理后，细胞增殖活性明显降低，细胞凋亡率明显升高，克隆形成实验显示克隆细胞形成数量减少，和 蛋白均呈高表达态势发展，表达水平降低，呈浓度依赖性，差异有统计学意义（）。抑制 表达后，细胞增殖抑制活性明显升高，细胞凋亡率升高，细胞克隆形成数减少，和 蛋白呈高表达态势发展，差异有统计学意义（）。过表达逆转了槐角黄酮对结直肠癌 细胞增殖和凋亡的作用。结直肠癌组织中 表达水平升高，差异有统计学意义（）。结论槐角黄酮通过下调 表达抑制结直肠癌 细胞增殖，促进细胞凋亡。【关键词】槐角黄酮；结直肠癌；增殖；凋亡【中图分类号】【文献标识码】，（，；，）【】，（，），（），（），（）（）【】；世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，中药治疗结直肠癌具有高效、毒副作用小的特点，已成为结直肠癌的有效治疗方法 ，。槐角为豆科植物国槐（）的成熟果实，是一种常见的中药材，其中富含黄酮类化合物，有降血脂、抗炎、止血、抗溃疡、抗骨质疏松及抗癌等功效 ，。研究报道槐角黄酮通过调控 抑制肺癌 细胞的增殖，迁移和侵袭 。槐角黄酮能够抑制人胰腺癌细胞增殖，并诱导其凋亡 。但现阶段关于槐角黄酮对结直肠癌细胞增殖活性及促进细胞凋亡的相关机制仍未明显，亟待探讨和研究。基因所具备的调控性质对结直肠癌变的发生发展具有一定介入效应，的表达及调控可能是中医药发挥抗肿瘤疗效的作用机制之一，探讨 调控网络与中医理论之间的联系，对以 为靶点的中医药防治结直肠癌具有重要意义 。研究报道结直肠腺瘤中外泌体 过表达 。在非小细胞肺癌组织中上调表达，与术后患者的不良预后相关；可促进非小细胞肺癌细胞 和 的增殖、迁移和侵袭 。而 对结直肠癌细胞增殖和凋亡活性的影响尚不清晰，关于槐角黄酮是否对 具有调控作用以及是否可以影响结直肠癌细胞活性的机制也未明确。基于此，为了进一步分析结直肠癌细胞增殖、凋亡活性的影响机制，本研究围绕槐角黄酮对 是否具有调控机制并分析其对结直肠癌细胞的影响效用。材料与方法 材料 样本选取选取 年 月 年 月期间在本院接受根治术治疗的 例结直肠癌患者体内癌组织及癌旁组织，所有患者手术前均未接受相关放化疗干预方案，所有患者均对本研究了解且同意配合本研究相关调查直至研究结束。本研究经本院伦理委员会审核批准（审批号：）。细胞与主要试剂 细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：）；培养基（上海慧颖生物，批号：）；槐角黄酮（西安维珍生物有限公司）；细胞增殖及凋亡检测试剂盒（上海 碧 云 天 生 物 技 术 有 限 公 司，批 号：、）；组织蛋白抽提试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：）；试剂（上海碧云天生物技术有限公司，批号：）、荧光定量 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：）。方法 细胞处理与分组 细胞用 培养基常规培养，作为对照组，分别用浓度为 、的槐角黄酮处理，记为槐角黄酮 低、中、高组；将 抑制剂及阴性对照载体质粒转染至 细胞，记为 组、组；将 模拟物及阴性对照转染至 细胞后用 的槐角黄酮处理，记为槐角黄酮 组、槐角黄酮 组。检测指标 检测细胞抑制率各组细胞经培养 后添加 溶液 ，之后持续培养 ，添加二甲基亚砜 ，等待 后，针对 处的吸光度值（）进行检测，采用酶标仪完成并计算细胞增殖活性的抑制率。细胞克隆形成数检测取对数生长期细胞，备好 孔板，每孔板均接种 个细胞，完成操作后培养 ，之后应用甲醇进行固定，持续 ，应用结晶紫进行染色，持续 ，在低倍光学显微镜下观察 个细胞的集落并进行计数。细胞凋亡活性检测将 做好预冷操作后对已完成 培养的各组细胞进行漂洗，漂洗结束后置入结合缓冲液 ，完成充分混匀后加入 共 ，再加入 的 进行二次混匀，操作完成后在避光环境下完成孵育，时间 ；之后将样本上上流式细胞仪进行检测并明确细胞凋亡活性。蛋白表达检测对各组细胞完成总蛋白提取后，完成定量分析操作，之后以聚丙烯酰胺凝胶为介质进行电泳操作（，），之后进行转膜，转膜操作结束后封闭膜，持续 后分别加入 、抗体（），在恒温 环境下孵育过夜，之后清洗膜并加入山羊抗兔 （）并在室温环境下完成 孵育操作，暗室中曝光显影、定影，对目标条带灰度值进行分析并明确蛋白相对表达情况。世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，实时荧光定量 对 表达水平进行检测针对样本组织及各组细胞完成总 提取后进行 合成，并展开 操作，用 法对相对表达量进行计算分析。以 为内参，上游引物序列：，下游引物序列：；上游引物序列：，下游引物序列：。统计学方法采用 统计学软件分析数据，计量资料中符合正态分布的部分用均数 标准差（）表示，并应用 检验，多组间对比时应用单因素方差完成相应数据分析，采用 检验。以 为差异有统计学意义。结果 槐角黄酮对结直肠癌 细胞增殖的影响与对照组比较，槐角黄酮 低、中、高组 细胞增殖抑制率逐渐升高、细胞克隆形成数逐渐减少，呈浓度依赖性，差异有统计学意义（）；且槐角黄酮 低、中、高组 细胞增殖抑制率、细胞克隆形成数比较，差异有统计学意义（）。结果见表 。表 槐角黄酮对结直肠癌 细胞增殖的影响（）组别抑制率（）细胞克隆形成数（个）对照组 槐角黄酮 低组 槐角黄酮 中组 槐角黄酮 高组 注：与对照组比较，；与槐角黄酮 低组比较，；与槐角黄酮 中组比较，槐角黄酮对结直肠癌 细胞凋亡的影响与对照组比较，槐角黄酮 低、中、高组 细胞的凋亡率逐渐升高、和 蛋白表达水平逐渐升高，呈浓度依赖性，差异有统计学意义（）；且槐角黄酮低、中、高组 细胞的凋亡率、和 蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（）。结果见图，图，表。在结直肠癌组织中的表达与癌旁组织比较，结直肠癌组织中 表达水平升高，差异有统计学意义（）。结果见表 。图 槐角黄酮对结直肠癌 细胞凋亡相关蛋白表达的影响图 槐角黄酮对结直肠癌 细胞凋亡相关蛋白表达的影响表 槐角黄酮对结直肠癌 细胞凋亡的影响（）组别凋亡率（）蛋白 蛋白对照组 槐角黄酮 低组 槐角黄酮 中组 槐角黄酮 高组 注：与对照组比较，；与槐角黄酮 低组比较，；与槐角黄酮 中组比较，表 在结直肠癌组织中的表达（）组别 癌旁组织 结直肠癌组织 注：与癌旁组织比较，槐角黄酮对结直肠癌细胞 表达的影响与对照组比较，槐角黄酮 低、中、高组 细胞中 表达水平逐渐降低，呈浓度依赖性，差异有统计学意义（）；且槐角黄酮 低、中、高组 细胞中 表达水平比世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，较，差异有统计学意义（）。结果见表 。表 槐角黄酮对结直肠癌细胞 表达的影响组别 对照组 槐角黄酮 低组 槐角黄酮 中组 槐角黄酮 高组 注：与对照组比较，；与槐角黄酮 低组比较，；与槐角黄酮 中组比较，干扰 表达对结直肠癌 细胞增殖和凋亡的影响 组 表达较 组呈明显降态势，组 细胞增殖抑制率和凋亡率呈均呈升高态势，细胞克隆形成数量明显降低，和 蛋白呈高表达态势，差异有统计学意义（）。结果见图 ，图 ，表 。图 干扰 表达对结直肠癌 细胞凋亡相关蛋白表达的影响图 干扰 表达对结直肠癌 细胞凋亡相关蛋白表达的影响 过表达逆转了槐角黄酮（）对结直肠癌 细胞增殖和凋亡的作用槐角黄酮 组 表达较槐角黄酮 组更高，细胞增殖抑制率和凋亡率降低，细胞克隆形成数量明显增多，和 蛋白呈低表达态势，差异有统计学意义（）。结果见图 ，图 ，表 。图 过表达逆转了槐角黄酮对结直肠癌 细胞凋亡相关蛋白表达的作用图 过表达逆转了槐角黄酮对结直肠癌 细胞凋亡的作用 讨论研究表明天然黄酮类化合物具有预防结肠癌的作用 。如天然黄酮类化合物木犀草素可通过调节 轴抑制结直肠癌细胞转移 。荔枝核总黄酮可抑制大鼠结直肠癌前病变 。羟表 干扰 表达对结直肠癌 细胞增殖和凋亡的影响（）组别 抑制率（）细胞克隆形成数（个）凋亡率（）蛋白 蛋白 注：与 组比较，表 过表达逆转了槐角黄酮对结直肠癌 细胞增殖和凋亡的作用（）组别 抑制率（）细胞克隆形成数（个）凋亡率（）蛋白 蛋白槐角黄酮 槐角黄酮 注：与槐角黄酮 组比较，世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，基异黄酮能抑制结直肠癌细胞的增殖，诱导结直肠癌细胞的凋亡 。槐角黄酮已报道对肺癌和胰腺癌具有抗肿瘤作用，而其对结直肠癌的影响尚未清楚。本研究用不同浓度槐角黄酮处理结直肠癌 细胞后，细胞的增殖抑制率和凋亡率升高，细胞克隆形成数减少，呈浓度依赖性；表明槐角黄酮可浓度依赖的抑制 细胞增殖，促进细胞凋亡。研究报道肺腺癌组织中 上调表达 。在胃癌组织与细胞中高表达，与胃癌患者的 分期、远端转移和不良预后呈正相关；对 具有靶向调控作用，这也是促进胃癌细胞生长、迁移、侵袭活性升高的重要机制 。本研究结果发现结直肠癌组织中 呈高表达，抑制 表达后，细胞增殖抑制率和凋亡率升高，细胞克隆形成数减少，说明抑制 表达可抑制 细胞增殖，促进细胞凋亡。提示，在结肠癌中可能起促癌作用。研究表明一种小檗胺衍生物通过调控 和 信号传导抑制细胞活力并诱导人胶质母细胞瘤的癌症干细胞样细胞凋亡 。本研究结果显示，槐角黄酮可降低 的表达水平，而 过表达可实现对槐角黄酮的有效逆转，进一步证实槐角黄酮与 可实现相互影响并对结直肠癌 细胞增殖、凋亡等活动产生影响。综上所述，槐角黄酮可对 表达产生影响，通过调控其表达下调而对结直肠癌 细胞增殖活性起到抑制作用，促进细胞凋亡。参考文献 李变丽，陈华国，赵超，等 中药抗结直肠癌的作用机制研究进展 天然产物研究与开发，（）：杨宇飞 中医药在结直肠癌治疗中的优势与展望 中国中西医结合杂志，（）：王永红，冉茂娟，姜艳，等 槐角黄酮栓抗炎，止血，抗溃疡作用的实验研究 现代生物医学进展，（）：韦华梅，王剑波 中药槐角的研究进展 亚太传统医药，（）：侯从岭，雷小婷，芦晓帆，等 槐角黄酮通过调控 基因表达对肺癌细胞增殖，迁移和侵袭的影响及其机制 中国老年学杂志，（）：龚龙伟 槐角黄酮抑制人胰腺癌细胞的体外生长及机制的初步研究 南京：东南大学，贺雪，殷佩浩 在中医药防治结直肠癌中的研究进展 上海医药，（）：朱莉 肺腺癌 芯片筛选及生物信息学分析 长春：吉林大学，（）：，：，（）：，（）：卢青，成秋宸，肖绪华，等 荔枝核总黄酮对大鼠结直肠癌前病变的影响 广西医学，（）：陈慧菁，廖锦容，李洁羽，等 羟基异黄酮通过 影响结直肠癌细胞增殖 中国病理生理杂志，（）：，：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）（上接第 页）清傅山 傅青主女科 太原：山西科学技术出版社，：清萧埙 女科经纶 北京：中国中医药出版社，：晋陈延之 小品方 北京：中国中医药出版社，：清吴谦 医宗金鉴 北京：中国中医药出版社，：宋许叔微 普济本事方 北京：中国中医药出版社，：宋朱佐 类编朱氏集验医方 上海：上海科学技术出版社，：张民庆，王兴华，刘华东 张璐医学全书 ，北京：中国中医药出版社，：张劭雷，郭伟 针灸治疗肾精不足型椎 基底动脉供血不足性眩晕的临床研究进展 按摩与康复学，（）：曾平安 产后三冲治验 河南中医，（）：唐孙思邈 孙思邈医学全书 太原：山西科学技术出版社，：（收稿日期：）