基于Label-free技术的非小细胞肺癌蛋白质差异研究.pdf

内蒙古医学杂志InnerMongoliaMedJ2023年第55卷第9期DOI:10.16096/J.cnki.nmgyxzz.2023.55.09.0011025基于 Label-free技术的非小细胞肺癌蛋白质差异研究?魏文海1,李兴芳2，张新迪,周立文,赵（1.甘肃中医药大学中西医结合学院，兰州7 30 0 30；2.甘肃省中医院肺病科,兰州7 30 0 50)摘要 目的基于非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)及与其配对的非癌性邻近组织(non-cancerous adjacent tissues,NATs)的蛋白质组学分析，寻找 NSCLC诊断相关蛋白标志物。方法应用非标记定量蛋白组学(LFP)技术,以 NSCLC患者配对的 NATs 为对照,对5 例 NSCLC患者进行癌组织蛋白质组学分析。以差异倍数 1.5(上调)或 0.6 7(下调)且P0.05为标准筛选差异蛋白。应用String网站和R语言对差异蛋白进行基因本体论(gene ontology,GO)分析、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclo-pedia of Genes and Genomes,KEGG)分析，为进一步研究提供良好基础。结果本研究发现差异蛋白共 6 44个，其中339个蛋白表达上调，30 5个蛋白表达下调。PCA结果显示，差异蛋白可明显区分NSCLC与NATs。G O 分析结果表明,差异蛋白大多以细胞外泌体的形式存在且主要富集于调节胞外分泌、胞外分泌、骨髓细胞激活参与免疫反应等的生物学过程以及钙粘着蛋白绑定、细胞外基质绑定等的分子功能。KEGG分析结果显示，差异蛋白主要富集在抗坏血酸和醛酸代谢、组氨酸代谢、蛋白质消化吸收、丙酮酸代谢等通路(P1.5(up-regulated)or 0.67(down-regulated)and P0.05 were used as the criteria to screen dif-ferential proteins.The gene ontology(GO)analysis and the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)analysis were conducted using the String web site and the R language.Genomes(Genomes)analysis It provides*【基金项目甘肃省卫生行业科研计划项目（编号：GSWSKY-201930)；甘肃省重点研发计划项目（编号：2 1YF1FA061)；甘肃省自然科学基金（编号：2 1JR11RA209）通信作者E-mail：114597 2 6 6 5 q q.c o m区琼1，李静芸1，牛慧敏11026a good foundation for further study.Results A total of 644 different proteins were found in this study,amongwhich 339 proteins were up-regulated and 305 proteins were down-regulated.PCA showed that differentialproteins could significantly distinguish between NSCLC and NATs.The results of GO analysis showed that mostof the differential proteins existed in the form of extracellular bodies and were mainly enriched in the biologicalprocesses of regulating extracellular secretion,extracellular secretion,activation of bone marrow cells and partic-ipation in immune response,as well as molecular functions of cadherin binding and extracellular matrix binding.KEGG analysis showed that differential proteins were mainly concentrated in ascorbic acid and uronic acidmetabolism,histidine metabolism,protein digestion and absorption,pyruvate metabolism and other pathways(P0.05).Conclusion There are significant differences between NSCLC and NATs,which can provide cluesfor the discovery of novel markers of NSCLC.Keywordsnon-small cell lung cancer;label-free quantitative proteomics;novel protein markers肺癌是一种高度恶性疾病，在全球常见癌症中位居第二,更有数据表明肺癌是男性癌症发病率和病死率高的主要原因，在人群中发病率每年持续上升4.5%,严重威胁人类健康 1,2。非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer,NSCLC)是最常见的肺癌形式,约占所有肺癌病例的8 5%3。而多数患者确诊时已为晚期，因复发转移，5年生存率仅为13.8%4。因此，肺癌早期诊断极为重要。目前，NSCLC的诊断“金标准”是病理检测,但这主要基于病变的形态学改变，具有一定局限性。研究发现NSCLC在蛋白标志物水平与正常组织有着明显区别 5,这表明通过对病变组织进行蛋白标志物检测,可以有效提升NSCLC诊断正确率,这对于早期发现NSCLC及提升NSCLC患者生存率具有重要意义。本研究运用Label-free蛋白质组学技术探寻在NSCLC及与其配对的非癌性邻近组织（non-cancerous adjacent tissues,NATs）中差异表达的蛋白，为发现NSCLC诊断生物标志物提供依据。1材料与方法1.1研究对象纳入甘肃省中医院2 0 2 1年1月至2021年12 月确诊且未接受治疗的NSCLC患者5例。其中1例为女性，4例为男性,中位年龄51（486 2)岁，受试者均为经组织病理学活检首次确诊为NSCLC,且未经任何治疗、无其他癌症史的新发NSCLC患者。在研究开始前,本课题已取得了甘肃省中医院伦理审查委员会的批准，所有研究对象均通过书面形式告知详情并签署了知情同意书。1.2组织标本收集收集NSCLC患者的癌组织和与其配对的NATs，立即分装并冻存于8 0 冰箱待用。1.3蛋白质的裂解、定量和酶解样品从8 0 环内蒙古医学杂志InnerMongoliaMedJ2023年第55卷第9期境取出，解冻后向样品中加入裂解液，充分混合均匀，进行组织匀浆离心取上清液。然后采用丙酮沉淀法对溶液中的蛋白质进行沉淀，再向得到的蛋白质沉淀中加入复溶液复溶后，加入二硫苏糖醇在37孵育；随后，加入碘乙酰胺，于室温、暗处进行烷基化反应以封闭巯基。用Bradford法测定蛋白质浓度，并按照酶与蛋白质1：50 的质量比加入胰蛋白酶,37 孵育振荡过夜进行酶切。第2 日加入TFA终止酶切，取上清液进行脱盐，抽干后2 0 冻存待用。1.4液相色谱串联质谱分析质谱数据使用QExactiveHF-X质谱仪串联EASY-nLC1200超高效液相的液质联用系统进行采集。肽段样品经过上样缓冲液溶解，由自动进样器吸入后结合至分析柱进行分离。利用两个流动相建立分析梯度，质谱以DDA模式采集数据，每个扫描循环中包含一个MS全扫描。1.5LFP分析本研究质谱数据通过MaxQuantv1.6.6软件进行检索,采用的数据库检索算法是An-dromedao1.6统计学方法和生物信息学分析采用SPSS22.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以（土s)表示，采用t检验进行组间比较；计数资料采用（%）表示，采用进行组间检验，P0.05时认为差异有统计学意义。当P0.05时，以差异表达量变化(foldchange,FC)值超过1.5作为显著上调的变化阈值，小于0.6 7 作为显著下调的变化阈值，进而筛选差异蛋白（differential express s i o nproteins,DEPs)。通过 Wolf Psort 软件、R软件、String网站和DAVID网站,对差异蛋白进行亚细胞定位、主成分分析（principal component _analysis,内蒙古医学杂志InnerMongoliaMedJ2023年第55卷第9期PCA)、基因本体论(gene ontology,GO)分析、基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)代谢通路富集分析，并将结果可视化。2结果2.1蛋白质定量结果及质控利用MaxQuantv1.6.6软件获得蛋白质组的LFQ相对定量数据，各样本丰度值见图1。2.2主成分分析(PCA)结果图中每个点代表1个分组实验中的1次重复，以不同颜色区分不同组。PCA从不同维度展现样品间关系，主成分分析可见同组样本在空间分布稍弥散，可明显区分。2.3差异蛋白的鉴定通过LFP检测发现DEPs共6 44个，其中表达下调的DEPs为30 5个，表达上调的DEPs为339 个。红蓝色散点分别代表上下调蛋白质，深灰色代表非显著表达蛋白质，见图3。2.4差异蛋白表达水平聚类分析根据表达谱对共表达数据进行分组，分为CA/CON组。同一类样品通过聚类出现在同一簇中。红色表示高表达蛋白,蓝色表示低表达蛋白。可见在同一簇中两组间蛋白质变化相反,相同的DEPs在不同组变化相反。两组间上调及下调DEPs区别较为明显，提示DEPs的筛选是合理的，分析结果是相对稳定可靠的，见图4。2.5差异蛋白GO功能富集分析对NSCLC患者DEPs进行GO功能富集分析可知，相关生物过程(Biological Process,BP)主要有：调节胞外分泌、胞外分泌、骨髓细胞激活参与免疫反应等，见图5。相关细胞组分(Cellular Comp o n e n t,CC)主要有：分泌颗粒、分泌小泡、囊腔等，见图6。相关分子功能(MolecularFunction,MF)主要有：钙粘着蛋白绑定、细胞外基质绑定、蛋白质二硫异构酶活性等，见图7。2.6差异蛋白KEGG富集分析KEGG通路富集分析通路共有312 条，主要有抗坏血酸和醛酸代谢、组氨酸代谢、蛋白质消化吸收等通路，见图8。图9为富集倍数最高的抗坏血酸和醛酸代谢通路图，其中红绿底色分别标记上调下调的DEPs，蓝色底色标记的是同时有上调下调的DEPs。3讨论肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤,在过去10年中，西方国家开展的大规模基因组研究揭示了NSCLC的驱动基因，其中常见的体细胞突变有TP53、K RA S、K EA P1、ST K 11、EG FR等 6。蛋白质1027作为生理功能的执行者和生命现象的直接体现者，对蛋白质的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。中国肺癌诊断生物标志物谱(LCBP)研究结果显示，癌胚抗原(CEA）、胃泌素释放肽前体(ProGRP）、鳞状上皮细胞癌抗原（SCC)及血清细胞角蛋白19 片段(CYFRA21-1)四项标志物联合检测可检出57%的胸部CT漏检的肺癌患者 7。同时,联合肺癌标志物可将 CT 筛查的肺癌检出率从7 8.1%提升至90.6%8。可见寻找新的肺癌标记物对NSCLC的早期诊断提升意义重大。此次研究发现的DEPs主要为IGKV2-24、U BA 6、SSC5D、EI F3C 和ACOT7。I G K V 2-2 4 的相关研究较少,有研究表明其可能与 COVID-19 相关 9。UBA6即泛素激活酶6,研究发现UBA6 或许是激活肺腺癌患者免疫反应的生物标记物之一，尤其是当患者具有高肿瘤突变负荷和大量的体细胞突变时,免疫激活效果更好 10。更有学者发现T细胞特异性 UBA6 缺陷小鼠会出现干扰素(IFN)的表达增加,加剧多器官炎症的发展 11。SSC5D属于清道夫受体富含半胱氨酸（SRCR）超家族，是一种新型可溶性蛋白，其表达仅限于单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞，可能在适应性免疫和先天免疫中发挥着独特作用 12。EIF3C是真核翻译起始因子3亚单位C,在维持翻译这一基础细胞功能中发挥重要作用。LIUetal研究发现EIF3C的下调可以减弱或中和肺腺癌驱动因子ZNF280A的促癌作用 13。更有研究发现,EIF3C在埃罗替尼耐药肺癌细胞(PC9/ER)中表达上调，更有活检样本的免疫组织化学分析显示EGFR-TKI耐药患者中EIF3C阳性病例的频率高于 EGFRT K I 治疗前的患者 14。因此,EIF3C 的上调可以削弱对EGFR-TKI的敏感性,这是一种新的耐药机制。ACOT7即酰基辅酶A硫酯酶7,是ACOT家族的主要亚型,在调节细胞周期、细胞增殖和葡萄糖代谢中具有重要意义 15。JUNG et al 发现低 ACOT7 水平延长了乳腺癌和肺癌患者的总生存期，此外，与正常组织相比,肺癌患者组织中的ACOT7mRNA水平更高 15。ZHENGetal发现ACOT7可影响阿法替尼、吉非替尼、伊布替尼、拉帕替尼、奥希替尼的敏感性，当ACOT7表达下调时,PC9 细胞的增殖和迁移被显著抑制,这表明低水平的ACOT7 可能参与了肺癌的预防。需要注意的是，部分肺信号蛋白在NSCLC中表达增高，如UBA6、EI F3C、A CO T 7 等，这可被视1028为NSCLC的可能标志物，但也有部分肺信号蛋白在NSCLC 中的表达低于在NATs 中的表达，如IGKV2-24、SSC 5D 等，这些蛋白质在肺细胞中特异性表达，可能是维持肺表面正常活性、正常呼吸或上皮再生所必需的 16,17 从蛋白质GO功能注释结果可以看到，这些结合蛋白参与了多种重要的生物学过程，如调节胞外分泌、胞外分泌等。KEGG是系统分析蛋白质在细胞中代谢途径的主要公共数据库。本研究使用KEGG路径分析检索DEPs参与的生物路径，发现主要富集在抗坏血酸和醛酸代谢、组氨酸代谢、蛋白质消化吸收等通路，而这些通路主要与细胞的生长、浸润及转移等相关。尤其是富集倍数最高的通路抗坏血酸和醛酸代谢通路,有学者认为,抗坏血酸和醛酸代谢通路与戊糖和葡糖醛酸通路之间存在化学分子连接,诸如L-阿拉伯糖和D-半乳糖醛酸等,故二者可相互转化,这或许会改善NSCLC患者的预后 18 综上，本研究应用非标记蛋白质组学技术，为发现NSCLC诊断生物标志物提供依据，并为理解NSCLC的发生机制和探索治疗靶标提供基础。并在结论上与国际学者的研究结果基本一致，但由于本研究是通过大型网络数据库对实验结果进行分析得出结论，故具体机制仍需要后续验证。（附图1 9见封2、封3）参考文献1SUNG H,FERLAY J,SIEGEL R L,et al.Global CancerStatistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortal-ity Worldwide for 36 Cancers in 185 CountriesJl.CA Cancer JClin,2021,71(3):209249.2 SIEGEL R L,MILLER K D,FUCHS H E,et al.CancerStatistics,2022J.CA Cancer J Clin,2022,72(1):733.3AHLAWAT P,PHUTELA K,BAL A,et al.Therapeutic Po-tential of Human Serum Albumin Nanoparticles EncapsulatedActinonin in Murine mModel of Lung AdenocarcinomaJ.DrugDeliv,2022,29(1):24032413.4DEBIEUVRE D,LOCHER C,ASSELAIN B,et al.Evidenceof Slight Improvement in Five-year Survival in Non-small-cell Lung Cancer Over the Last 10 Years:Results of the FrenchKBP-CPHG Real-world StudiesJ.Bull Cancer,2019,106(4):283292.5REKHTMAN N.Lung Neuroendocrine Neoplasms:RecentProgress and Persistent Challenges J.Mod Pathol,2022,35内蒙古医学杂志InnerMongoliaMedJ2023年第55卷第9期(1):3650.6XU J Y,ZHANG C,WANG X,et al.Integrative ProteomicCharacterization of Human Lung AdenocarcinomaJ.Cell,2020,182(1):245261,217.7YANG D W,ZHANG Y,HONG Q Y,et al.Role of a Serum-based Biomarker Panel in the Early Diagnosis of Lung Cancer fora Cohort of High-risk PatientsJ.Cancer,2015,121(17):31133121.8 文刘海洋，张晓菊。预测模型在肺癌早期诊断中的应用 J.结核与肺部疾病杂志，2 0 2 1,2(3）：2 6 2 2 6 6.9NMA J,BAI H,GONG T,et al.Novel Skewed Usage of B-cellReceptors in COVID-19 Patients with Various Clinical Presen-tationsJ.Immunol Lett,2022,249:2332.1o WANG 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5页）platcletaggeregationPvalueregulation of animal organ morphogenesis:response to molecule of bacterialoriginneutrophil degnnulationneutrophilactivation involved in immuneresponseneutrophil activation-neutrophil mediated immunitygranuloeyte.activationmyeloid ellactivatio involved in mmune response:leakocyte degranulationmyeloi lukoceyte medlaedimmunitymyeloid leukoeyeactivationregulated exocytosis-leukocyte actiation involvedin immune responsecell activation involved in immune responseexoytosisleuakocyte activationhemopoiesis-leukocye mediatied immunityhematopoictic or lymphoid organ development图5差异蛋白GO功能富集的生物学过程分析图版编号：10 0 4-0 951-(2 0 2 3)0 9-10 2 5-F5oxyen bindingextracllularroctural consitucat coferingtcesilestrengthproetin disulfide isomecrase.actitytmnamolecelaroxidoreductaseaetivity,trangposing S-S bondspatrin bindingaldchyde dehydogcenasc NAD(PWl activity aldehydedehydrogemne(NAD+)activiyextracelular mari indingperoxidasactivityoxidoredluetase ariviyacting on peroxide asceptoreintramolecular oxidoreductase activityextracellular.matrixxstructural.constitucmtNAD bindingheme bindingantioxidant actityunfodided prutcin bindlingcadherin indingaxidoreductase activityceliaheion molcele inding(cytskeletal proceia binding图7 差异蛋白GO功能富集的分子功能分析图版编号：10 0 4-0 951-(2 0 2 3)0 9-10 2 5-F7ASCORBATE AND ALDARATEMETAB OLISMmyo-lnoeitolB-D-Ctucuronoside24117O3:2131UDP-D-gh277.42.41.172.71.4311121119PentoseandghucuronateUDP-D-ghucosentereomveraonegarmetabolianL-Gulose-IPO5.13.18-OODP-L-gulos-513.18-OGDP-L-galactoeODP-D-manOe2.2.769L-Galoctoe-IPL-Oalastomo-1,5-hactoneO-3.11-5.13.6-OUDP-D-galscturonat2.7.7-3.13D.Caleturonato-1Pntoseandghucurona000532/1021(e)KanehisaLabohemoglobin complex:piemen ranulemelanosome-1e-05azurophil granulelumenprimary lysonomeazurophilgranlc5e-06fecolin-1-cich granulevacuolar lumenficolin-1-nich granule lumencytosolic rihosiomevesicle.lumenCountsecretory granule lamen18cytoplasmic wesielelumenseretory granule43seccretory vesicle68lyticvacuolelysosomc93vacuolecll-substratejunction118anchoring junction2Fold EnrichmentFold EnrichmentLOuboOLGulonate31125L11120L-Oaletom1112113163.11-3OD-TagatuonateD-GalacturonateatonesPvalue2e-041e-04Count7335985111Fold Enrichment图6 差异蛋白GO功能富集的细胞组分分析图版编号：10 0 4-0 951-(2 0 2 3)0 9-10 2 5-F6PvalueAsecorbate and aldaratemetatbolism0.0100HistidinemetabolismProtein digestion andabsorpion0.0075Pynuvate metabolismPancreatic secretion0.0050ProteasomeGlycerolipid metabolism0.0025betu-Alanine metabolismSalivary secretion-Spinocerebellar aaxiaGlyeolysis/GiluconeogenesisCountPlatelet activationLipid and atheronsckerosisFocal adhesion20Parkinson diseasePrion disease34Huntington disease48AlzhelimerdiseasePathways of neurodegeneration-multiple diseaxes62Amyotrophie lateral sclerosis-图8 差异蛋白KEGG通路富集分析图版编号：10 0 4-0 9 51-(2 0 2 3)0 9-10 2 5-F842.1.40L13.9131119D-Glecurono-TD-Clucuromate231117113.80sR.ontan.eOEL-ThreonateL-Astone13233.3.12185.11.6.5.4OMonodehyctroacotban110.3.313.23Dehy411-4.11LLgponate LixytomatePvalue0.0200.0150.0100.005Count6162636462Fold Enrichment-412.20TartRadhye421.40412.20D-Clucaste4.2.1.42D-Calactaro-1,4-laectoneD-Calactrnte4.1.1.85-0L-Xytuloae-SP3.1.1513tbate2213271194L-AsCcotbate45.134Xy4uboo1132.3-Dilketo-L-galbomtPentee and ghucuronateintercomveseoneOPymvate5.5.127421.4+35-DioxoF54144214D-Calaotaro-OL21261,S-lactoeDi-aabinonateLRibulose-421OD-ArabinonateCitrteyclo31130SP-Arabiroto111101111711461376D-Ambioo2L-Arabinoe113.37(D-Eryntanoate4121842143842123OL-Arabironate图9KEGG差异蛋白质通路图（抗坏血酸及醛酸代谢通路）图版编号：10 0 4-0 951-(2 0 2 3)0 9-10 2 5-F9