基于iap基因的RT-LAMP技术检测肉类食品中单核细胞增生李斯特菌的效果评价.pdf

研究论文基于iap基因的RT-LAMP技术检测肉类食品中单核细胞增生李斯特菌的效果评价陈东，杨逍，安宋达峰*2（1.杭州安旭生物科技股份有限公司，浙江杭州310 0 0 0；2.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310000)摘要：作者旨在探讨逆转录环介导等温扩增（reverse transcription-loop-mediated isothermalamplification，RT-LA M P)技术在检测单核细胞增生李斯特菌感染的肉类食品中的效果评价。根据RT-LAMP原理，以iap基因为靶基因设计引物，检测肉制品中的单核细胞增生李斯特菌，并将该方法的特异性灵敏度、死菌活菌鉴别效果与国标进行对比。实验获得的RT-LAMP体系最佳参数为6 3扩增6 0 min，反应体系中引物的最佳浓度为外引物0.4mol/L和内引物0.8umol/L，以及MgS042.0mmol/L、甜菜碱1.0 mol/L、d NT Ps 2.0 mmo l/L、A M V逆转录酶10 U/L、BstDNA聚合酶32 0 U/mL。该实验的灵敏度为每管7.310 CFU，是LAMP的2 倍。特异性实验显示该方法仅检测单增李斯特菌的靶基因，无假阳性。用RT-LAMP和中国国家标准CB4789.302016检测市售肉样品（n=100)中单核细胞增生李斯特菌的能力相似，且RT-LAMP仅对活菌有扩增作用。死菌活菌鉴别实验显示该法可以排除肉样中死菌的干扰。经与国标方法做对比，可知RT-LAMP可作为一种有效的检测手段。关键词：逆转录环介导等温扩增；单核细胞增生李斯特氏菌：快速检测；肉类食品中图分类号：R155.5*5文章编号：16 7 3-16 8 9（2 0 2 3）11-0 0 8 1-0 7DOl:10.12441/spyswjs.20211229003Detection and Evaluation of Listeria monocytogenes in Meat Productsby RT-LAMP Based on iap GeneCHEN Dong，Y A NG Xi a o*,SO NG D a f e n g 2(1.Hangzhou Assure Technology Co.,Ltd.,Hangzhou 310000,China;2.College of Food and Biological Engineering,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310000,China)Abstract:This experiment aimed to investigate the effectiveness and evaluation of the reversetranscription-loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP)in detecting Listeriamonocytogenes infection in meat products.The assay was designed to target the iap gene of Listeriamonocytogenes for detection of meat samples based on the principle of RT-LAMP.The specificity,sensitivity and differentiation between living and dead bacteria of this identification were comparedto Chinese national standards.This experiment optimized the RT-LAMP conditions and obtained the收稿日期：2 0 2 1-12-2 9基金项目：浙江省领雁计划项目（2 0 2 2 C03091)。*通信作者：宋达峰（197 9），男，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事微生物遗传学研究。E-mail:食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第11期修回日期：2 0 2 2-0 3-2 081RESEARCHARTICLECHEN Dong,et al:Detection and Evaluation of Listeria monocytogenes inMeat Products by RT-LAMP Based on iap Geneoptimum amplification at 63 C for 60 min,the optimal concentrations of the primers were 0.4mol/L outer primer and 0.8 mol/L inner primer,2.0 mmol/L MgSO4,1.0 mol/L betaine,2.0mmol/L dNTPs,10U/L AMV reverse transcriptase,320 U/mL Bst DNA polymerase.The assay hasa sensitivity of7.3x10CFU/per reaction,which was twice as sensitive as LAMP.The specificity testdemonstrated that only the target genes of Listeria monocytogenes were detected without falsepositives.The ability of RT-LAMP to detect Listeria monocytogenes in commercially available meatsamples(n=100)was comparable to the Chinese National Standard GB 4789.30-2016,and RT-LAMPonly amplified live microorganisms.Differentiation experiments between living and dead bacteriarevealed that this method could eliminate the interference from dead bacteria in meat samples.Incomparison with the method of national standards,RT-LAMP proves to be an effective detectionmethod.Keywords:reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,Listeria monocytogenes,rapid detection,meat products核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)是一种人畜共患病原菌,也被称为高致病性兼容细胞有机体叫，被其污染的食物可导致人类感染2。在美国每年有16 0 0 多人感染该病菌,2 0 0 多人死亡。2 0世纪90 年代，WHO将单增李斯特菌列为食品四大病原菌之一。单核细胞增生李斯特菌可突破血脑屏障或是胎盘屏障，有极大的可能性会感染宿主中枢神经,这也是高死亡率(2 0%30%)的主要原因 3-。目前国标检测常用生化鉴定法，该方法步骤烦琐、检测周期长、特异性低,无法做到快速灵敏检测回,在市场检测中实用性差，酶联荧光分析法(ELISA)则不够准确高效。到目前为止，由于食品形态和成分的多样，单一配方的培养基无法适用于所有类型食物样品中单增李斯特菌的分离，需分门别类培养，操作非常不方便。而逆转录环介导等温扩增法类型target Listeria sppother Listeria spp(RT-LAMP)则可以很好地解决以上问题,既保留了逆转录检测技术的高效精确，又结合了环介导等温扩增法(LAMP)的简便操作，该方法可同时检测多批样本，成本较低，结果判定简单。作者首次采用RT-LAMP技术对8 株单增李斯特菌和33株非单增李斯特菌进行特异性试验，研究不同条件下对单增李斯特菌的ip基因的检测效果，此外还探讨了死菌附着于样本对检测结果准确性的影响。本实验以国家标准检测法为对照，以确认RT-LAMP的可行性。一材料与方法1.1菌种分析了来自不同国家和来源的39 种细菌菌株，见表1。表1RT-LAMP实验菌株Table 1RT-LAMP experimental strains属名ListeriaListeriaListeriaListeriaListeriaListeriaListeriaListeriaListeriaListeria种名monocytogenesmonocytogenesmonocytogenesmonocytogenesmonocytogenesmonocytogenesmonocytogenesmonocytogenesseeligeriseeligeri菌株ATCC7648ZFMJ4045ZFMJ3215ZFM1723ZFMHF550ZFMJ0161ZFMF2365ZFMF8027CGMCC1.6731ZFM5133582JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 11 2023研究论文陈东，等：基于ip基因的RT-LAMP技术检测肉类食品中单核细胞增生李斯特菌的效果评价续表1类型NoD-Listeriaspp注：CGMCC为中国普通微生物菌种保藏管理中心；ZFM为浙江省食品微生物技术研究重点实验室。1.2主要试剂AMV逆转录试剂、细菌总RNA快速抽提试剂盒、LAMP引物及PCR引物：上海生工生物工程科技有限公司;DNA提取试剂盒：Axygen公司。1.3方法引物设计在GeneBank中查找单核细胞增1.3.1生李斯特菌的iap基因的基因序列，用PrimerExplorer V4(Eiken Chemical,Japan)设计了 4个引物，包括2 个外引物(LM-F3和LM-B3)和2 个内引物(LM-FIP和LM-BIP),它们识别了iap基因的6个区域,见图1。属名ListeriaListeriaListeriaListeriaListeriaListeriaMicrococcusStaphylococcusStaphylococcusStaphylococcusStaphylococcusLactobacillusLactobacillusLactobacillusLactobacillusBacillusEnterococcusEnterococcusShigellaPseudomonasShigellaEscher ichiaEscherichiaEscherichiaSalmonellaSalmonellaPseudomonasRhodotorulaSaccharomyces种名innocuainnocuainnocuagrayigrayilvanoviluteusaureusaureusaureusaureusplantarumplantarumplantarumlactissubtilisfaecalisfaecalisflexneriaeruginosadysenteriaecolicolicoliSP.Sp.pufidarubracerevisiae421AAAGCAGTAA GCACTCCAGT TGCACCAACA CAAGAAGTGA AAAAGAAAC|TACTACTCAA481 CAAGCTGCAC CTGTTGCAGA AACAAAAACT GAAGTAAAAC AAACTACACA AGCAACTACA541 CCTGCGCCTA AAGTAGCAGA AACGAAAGAA ACTCCAGTAA TAGATCAAAA TGCTACTACAB1c601 CACGCTGTCA AAAGCGGTGA CACTATTTGG GCTTATCCG TAAAATACGG|TGTTTCTGTTB2661 CAAGACATTA TGTCATGGAA TAATTTATCT TCTTCTTCTA TTTATGTAGG TCAAAAGCTTB3-图1iap基因引物在单核细胞增生李斯特菌中的位置和序列Fig.1 Location and sequence of iap gene primers inListeria monocytogenes会品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第11期菌株CGMCC 1.7730CGMCC1.2990ZFM33090CGMCC1.6770CCMCC1.2989ZFM19119CGMCC1.193CGMCC1.879CGMCC 1.128ATCC6538PCGMCC1.2386CGMCC1.551CGMCC1.511CGMCC1.556ATCC15577CGMCC 1.1627CGMCC1.125ZFMBM13CGMCcC1.1868CGMCC1.647ATCC9753JM1090104CGMCC1.1580CGMCC1.1552ZFM New portCCMCC1.645CGMCC2.1034CGMCC2.1643F3F283RESEARCHARTICLECHEN Dong,et al:Detection and Evaluation of Listeria monocytogenes inMeatProductsbyRT-LAMPBasedoniapGene1.3.2DNA和总RNA的提取按照细菌总RNA快速抽提试剂盒(Sangon Biotech)和DNA提取试剂盒（Axygen）的操作说明分别提取DNA和总RNA保存备用。1.3.3优化RT-LAMP体系根据裴灵芝的RT-LAMP研究7,进行微调后设定RT-LAMP初始的基本反应体系(2 5 L)为:缓冲液1xThermoPol?,dNTPs0.8 mmol/L,MgSO4 2.0 mmol/L,LM-FIP 0.8 mol/L,LM-BIP 0.8 mol/L,LM-F3 0.4 mol/L,LM-B30.4mol/L,AMV逆转录酶10 U/L，甜菜碱1.0mol/L,Bst DNA 聚合酶32 0 U/mL,RNA 2 L,63 孵育1h。用控制单一变量的方法对甜菜碱(0.0.5、1.0、1.5 m o l/L),M g S0 4(1.0、2.0、3.0、4.0 m m o l/L),dNTPs(1.2、1.6、2.0、2.4 m m o l/L)和 Bst DNA 聚合酶(40、8 0、16 0、32 0 U/m L)和引物的孵育温度（59、6 1、63、6 5)进行优化。1.3.4RT-LAMP的特异性实验用8 株单核细胞增生李斯特菌和31株非单核细胞增生李斯特菌菌株按照试剂盒说明提取RNA，用最优的RT-LAMP体系进行实验，观察凝胶电泳结果来判断RT-LAMP 的特异性。1.3.5RT-LAMP的灵敏度实验用纯单核细胞增生李斯特菌培养物(J0161)测定RT-LAMP灵敏度。10倍稀释法处理培养物,从中提取RNA,并在最佳反应条件下进行RT-LAMP。用上述方法按照试剂引物引物内容LM-F3前外引物LM-B3后外引物LM-FIPFlc和F2LM-BIPBlc和B22.2优化RT-LAMP体系优化RT-LAMP实验结果见图2。在MgSO4浓度为2.0 mmol/L时可以扩增iap，而在其他浓度下不产生扩增产物。随着dNTPs浓度的增加,琼脂糖凝胶上的RT-LAMP产物条带强度增加，在dNTPs浓度为2.0 mmol/L时观察到最佳条带。添加1.0mol/L甜菜碱后,条带检测更清晰,但当甜菜碱浓度从1.0 mol/L增加到1.5mol/L时没有观察到明显的差异；随着反应体系中BstDNA聚合酶浓度的增加，扩增产物在32 0 U/mLBstDNA聚合酶下观察84JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSUe 11 2023盒说明提取DNA并测试LAMP的灵敏度，将琼脂糖凝胶电泳结果与RT-LAMP进行比较。1.3.6用RT-LAMP和LAMP检测活菌和死菌作者测试了当地市场购买的50 个肉类样品，以确定RT-LAMP是否能有效区分死细菌和活细菌。将每个肉类样品匀浆后,用10 5CFU/dL的单增李斯特菌感染40 个肉样品，并将等浓度灭活菌液接种于剩余10 个肉类样品。将每种培养物振荡培养后,离心取上清液提取DNA和RNA，分别用LAMP和RT-LAMP进行实验并分析结果。1.3.7检测肉样中的单核细胞增生李斯特菌将RT-LAMP检测法和中国国家标准GB4789.302016法分别用于分析从中国当地市场获得的10 0个肉样品，以确定RT-LAMP鉴定肉中单核细胞增生李斯特菌的能力。取每种肉类样品匀浆,离心并从上清液中提取RNA。采用国家标准GB4789.30一2016检测每种肉类样品，已证实了单核细胞增生李斯特菌菌落的存在。2结果与分析2.1引物设计引物序列见表2。设计了4个引物，包括2 个外引物(LM-F3和LM-B3)和2 个内引物(LM-FIP和LM-BIP),它们识别了iap基因的6 个区域,见表2。表2 iap基因的特异性引物序列Table 2Specific primer sequences of iap gene引物序列ACACAAGAAGTGAAAAAAGAAACACATAATGTCTTGAACAGAAACATTAGGCGCAGGTGTAGTTGCTTGTG-GCAGAAACAAAAACTGAAGATCAAAATGCTACTACACACGCTCGTATTTTACGGATAAAGCCCA李斯特菌,没有假阳性结果，见图3。长度/bp23234448到最佳扩增。模板在59 6 5成功扩增，并且在6 3产生最明显的条带。基于这些结果,RT-LAMP测定条件为：MgS042.0mmol/L,dNTPs2.0mmol/L,甜菜碱1.0 mol/L,BstDNA聚合酶32 0 U/mL，扩增温度6 3。这些参数用作所有后续实验的标准条件。2.3RT-LAMP的特异性试验设计的引物扩增了来自8 个单增李斯特菌菌株的iop基因，但没有扩增来自非单增李斯特菌的iap序列。因此,RT-LAMP试验特异性地检测单增研究论文陈东，等：基于ip基因的RT-LAMP技术检测肉类食品中单核细胞增生李斯特菌的效果评价M123456M1234562.000 bp1 000bp750bp500 bp250bp100 bp泳道M：2 0 0 0 b p M a r k e r；泳道1：阴性对照；泳道2 6：Mg2+浓度分别为0.5、1.0、2.0、3.0 mmol/L。2.000 bp1000bp750bp500bp250bp100bp泳道M：2 0 0 0 b p M a r k e r；泳道1 4：温度分别为59、6 1、6 3、6 5；泳道5：阴性对照。2.000 bp1000bp750bp500bp250bp100bp泳道M：2 0 0 0 b p M a r k e r；泳道1 4：甜菜碱浓度分别为0、0.5、1.0、1.5mol/L；泳道5:阴性对照。2.000bp1000bp750bp500bp250bp100bp泳道M：2 0 0 0 b p M a r k e r；泳道1：阴性对照；泳道2 5：BstDNA酶浓度分别为40、8 0、16 0、32 0 U/mL。(a)Mg浓度优化M123456(b）引物孵育温度优化M123456(c）甜菜碱浓度优化M123456(e）Bs t D NA 酶浓度优化图2 RT-LAMP体系优化结果Fig.2Optimization results of RT-LAMIP systemM1234562.000 bp1000bp750bp500bp250bp100bp泳道M:2000bpMarker;泳道1 8：单增李斯特菌7 6 48、J4045、J0161J3215、17 2 3、H F550、F2 36 5、F8 0 2 7；泳道9:大肠杆菌JM109。Fig.31RT-LAMP specific results2.4RT-LAMP的灵敏度试验从单核细胞增生李斯特菌纯培养物的5个连续稀释液中提取RNA（稀释10 倍），在最佳反应条件下进行RT-LAMP检测。在2 g/dL琼脂糖凝胶上观察，低于7.310 CFU/mL时没有明显的扩增产物,见图4(a)。比较LAMP和RT-LAMP的灵敏度，LAMP的灵敏度为1.410 CFU/mL，低于RT-LAMP,见图 4(b)。图3RT-LAMP特异性结果M 1 23452.000 bp1000 bp750bp500bp250bp100 bp泳道M：2 0 0 0 b p M a r k e r；泳道1：阴性对照；泳道2 5：dNTPs浓度分别为1.2、1.6、2.0、2.4mmol/L。2 000 bp1000bp750bp500bp250bp100bp泳道M：2 0 0 0 b p M a r k e r；泳道1 4：培养物浓度分别为7.310 3、7.310 27.310l、7.3CFU/m L；泳道5：阴性对照。(d)dNTPs浓度优化（a）RT-LA M P灵敏度食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第11期85RESEARCHARTICLECHEN Dong,et al:Detection and Evaluation of Listeria monocytogenes inMeatProductsbyRT-LAMPBasedoniapGeneM 1 23452000bp1000bp750bp500bp250bp100bp泳道M：2 0 0 0 b p M a r k e r；泳道1 4：培养物浓度分别为1.410 4、1.410 3、1.4102、1.410 CFU/m L；泳道5：阴性对照。(b)LAMP灵敏度图4RT-LAMP和LAMP灵敏度结果Fig.4Sensitivity results of RT-LAMP and LAMP2.5活菌和死菌的RT-LAMP和LAMP检测RT-LAMP的测定结果见表3。在含有死单增李斯特菌的10 个样品中结果为阴性，但在LAMP测试的所有10 个样品中均为阳性，而活菌污染样本则均被检出阳性。表3RT-LAMP和LAMP检测死菌和活菌Table 3 Detection of dead and living bacteria using RT-LAMP and LAMPLAMP检测出样品数量/个测出的阳性的阳性样本样本数量/个数量/个活菌污染样品40死菌污染样品102.6肉样中存活的单核细胞增生李斯特菌检测100个肉样品RT-LAMP分析数据与国家标准CB4789.302016的数据比较结果见表4。RT-LAMP和GB测定均鉴定出3种单核细胞增生李斯特菌阳性样品，证实了RT-LAMP测定的准确性。表4RT-LAMP和GB法检测肉样中的单核细胞增生李斯特菌Table 4IDetection of Listeria monocytogenes in meatsamples using RT-LAMP and GB methodsRT-LAMP测出的样品数量/个牛肉25猪肉25羊肉25兔肉253结语作者首次用RT-LAMP以iap基因为靶基因设计引物检测肉样中单增李斯特菌，在传统的LAMP技术上作了延伸。此外，根据RT-LAMP原理对反应体系进行优化，对该方法性能进行评估，并与国标进行对比。实验结果表明,RT-LAMP在7.310 1CFU/mL培养物中即可检出单增李斯特菌，具有高灵敏度。且在特异性实验中没有出现假阳性结果，特异性强。采用RT-LAMP在7.310 CFU/mL的培养物中检测到单增李斯特菌，灵敏度是LAMP的2倍。在活菌和死菌的检测实验中,与LAMP技术相比,RT-LAMP只对活菌进行扩增,可以区分活细菌和死细菌，避免假阳性结果，且鉴别能力较强，而GB方法难以做到。在随后的可行性实验中,RT-LAMP检测结果与国家标准GB4789.30一2 0 16 方法相同，但整体准确度更高，这表明它可以更快、更准确地检测单增李斯特菌,有望取代GB4789.30一RT-LAMP检2016。实验结果还显示，MgS04的浓度对引物结合和Bst活性的影响最大，镁离子的浓度不适合整个体4040010GB4789.302016阳性样本/个测出的阳性样本/个22110000系就不会得到扩增结果,这与之前的研究结果一致8。同时甜菜碱在体系中的作用值得探讨，虽然其他人报道在RT-LAMP中加人甜菜碱只能适度提高反应性能 9,但在本实验中观察到扩增产物明显增加(1.0 mol/L甜菜碱是最佳）。这一现象可能与甜菜碱增强RNA对BstDNA聚合酶的易接近能力有关 0。综上所述,RT-LAMP技术检测肉样中单增李斯特菌具有特异性和良好的灵敏度，相比CB方法对死菌活菌的辨别准确,避免了消毒灭菌后死菌残留或因其他原因出现死菌情况下对食品卫生程度的误判 I-13。相比于传统生化方法,此技术节省了菌落培养分离所需的时间，减少了工作量，并能做到即取即测。同时该技术延续了LAMP技术的优点，仪器成本低且操作便捷，为食源性致病菌的快速高效检测提供了新途径。参考文献：1申海鹏.李斯特菌的危害 J.食品安全导刊,2 0 15(S1):37-39.SHEN H P.The harm of Listeria monocytogenesJJ.China Food Safety Magazine,2015(S1):37-39.(in Chinese)2 J LEE J E,CHO W K,NAM C H,et al.A case of meningoencephalitis caused by Listeria monocytogenes in a healthy childJ.Korean Journal of Pediatrics,2010,53(5):653-656.3 J ROCOURT J,BENEMBAREK P,TOYOFUKU H,et al,Quantitative risk assessment of Listeria monocytogenes in ready-to-eat86JOURNALOFFOOD SCIENCEAND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue112023研究论文陈东，等：基于iap基因的RT-LAMP技术检测肉类食品中单核细胞增生李斯特菌的效果评价foods:the FAO/WHO approachJJ.FEMS Immunology and Medical Microbiology,2003,35(3):263-267.【4 蔡雪薛.单核细胞增生李斯特菌毒力相关基因的筛选鉴定及其功能研究 D.扬州：扬州大学,2 0 17.【5 王国梁，殷月兰，焦库华，等.绵羊李斯特菌病病原诊断及其生物学特性研究 J.中国人兽共患病学报,2 0 13,2 9(7):6 39-6 45.WANG G L,YIN Y L,JIAO K H,et al.Diagnosis of Listeria monocytogenes NTSNJ.Chinese Journal of Zoonoses,2013,29(7):639-645.(in Chinese)6 J YENI F,ACAR S,POLAT O G,et al.Rapid and standardized methods for detection of foodborne pathogens and mycotoxins onfresh produceJJ.Food Control,2014,40:359-367.7裴灵芝.逆转录环介导等温扩增检测风疹病毒RNA方法的建立和应用 D.苏州：苏州大学,2 0 11.8 J SAIKI R K,GELFAND D H,STOFFEL S,et al.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNApolymeraseJJ.Science,1988,239(4839):487-491.9 J ZHAO L M,LI G,GAO Y,et al.Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay for detecting tomatochlorosis virusJ.Journal of Virological Methods,2015,213:93-97.10 KRAMARENKO T,ROASTO M,KETO-TIMONEN R,et al.Listeria monocytogenes in ready-to-eat vacuum and modifiedatmosphere packaged meat and fish products of Estonian origin at retail levelJJ.Food Control,2016,67:48-52.11张文敏,石育娇,戚成,等。恒温实时荧光法快速检测不同样品中的单增李斯特菌 J.食品与生物技术学报,2 0 19,38(5):44-50.ZHANG W M,SHI Y J,QI C,et al.Rapid detection of Listeria monocytogenes in different samples by real time fluorescenceisothermal amplificationJJ.Journal of Food Science and Biotechnology,2019,38(5):44-50.(in Chinese)12吴潇,吕贝贝,蒋玮,等.环介导等温扩增技术在鸭源成分检测中的研究 .食品与生物技术学报,2 0 19,38(8):12 6-133.WU X,LV B B JIANG W,et al.Rapid detection technique of duck-derived components in beef and sheep products by LAMPJ.Journal of Food Science and Biotechnology,2019,38(8):126-133.(in Chinese)13牛会敏,蒋静,户瀚文,等.恒温实时荧光法快速检测婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的研究 .食品与生物技术学报,2 0 2 3,42(10):94-99.NIU H M,JIANG J,HU H W,et al.Study on rapid determination of carrot components in complementary foods for infant andyoung children by isothermal real-time fluorescence assay J.Journal of Food Science and Biotechnology,2023,42(10):94-99.(in Chinese)食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第11期87