基于InDel标记的杏鲍菇遗传多样性评价.pdf

Edible and medicinal mushrooms 2023，31（6）：385390 基于 InDel 标记的杏鲍菇遗传多样性评价 姜晓红1 朱家漘1,2 孙忠刚3 曲绍轩1 马 林1 李辉平1*（1.江苏省农业科学院蔬菜研究所 江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏 南京 210014；2.江苏大学生命科学学院，江苏 镇江 212013；3.江苏淮香食用菌有限公司，江苏 淮安 223009）摘 要 插入/缺失（insertion-deletion，InDel）标记作为快速鉴定品种间遗传多样性的方法之一，因具有对检测设备要求低、简单易行、成本低，且共显性遗传、变异稳定、准确性高、重复性好等特点，在医学、动植物遗传学的群体遗传分析、基因定位及遗传图谱构建等领域被广泛应用。为评价我国杏鲍菇菌株的遗传多样性，加快杏鲍菇遗传育种工作进程，通过比对杏鲍菇已公布的基因组组装数据，开发 30200 bp InDel 标记便于常规电泳检测，随机选取合成 36 对引物对收集自国家食用菌标准菌株库、国内企业和市场的 65 份杏鲍菇菌株进行验证，筛选出 25 对有效引物，进行遗传多样性分析并构建 UPGMA 聚类树。结果表明，65 份供试菌株遗传多样性丰富，遗传相似系数最低为 0.362，在相似系数 0.616 时可分为 5 个类群。关键词 杏鲍菇；基因组比对；分子标记；种质资源评价 中图分类号：S646 文献标识码：A 文章编码：2095-0934（2023）06-385-06 Diversity evaluation of Pleurotus eryngii strains based on InDel markers JIANG Xiaohong1 ZHU Jiachun1,2 SUN Zhonggang3 QU Shaoxuan1 MA Lin1 LI Huiping1*（1.Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement,Institute of Vegetable Crops,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China;2.School of Life Sciences,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;3.Jiangsu Huaixiang Edible Fungi Co.,LTD,Huaian 223009,China）Abstract Insertion deletion(InDel)markers,as one of the methods for quickly identifying genetic diversity between varieties,are widely used in fields such as medicine,animal and plant genetics,population genetic analysis,gene mapping,and genetic map construction due to their low requirements for detection equipment,simplicity,low cost,co dominant inheritance,stable variation,high accuracy,and good repeatability.In order to evaluate the genetic diversity of Pleurotus eryngii strains in China and accelerate the genetic breeding process,30 200 bp InDel markers were developed by comparing the published genome assembly data of Pleurotus eryngii for routine electrophoresis detection.36 pairs of primers were randomly selected and synthesized to validate 65 strains collected from the China Center for Mushroom Spawn Standards and Control,domestic enterprises,and markets.25 pairs of effective primers were screened and applied in genetic diversity analysis and UPGMA clustering tree construction.The results showed that the 65 strains were rich in genetic diversity,with the lowest genetic similarity coefficient of 0.362.These strains could be divided into 5 groups when the similarity coefficient was 0.616.Key words king oyster mushroom;genome comparison;molecular marker;germplasm resource evaluation 基金项目：国家现代农业产业技术体系（CARS20）；江苏省种业振兴揭榜挂帅项目（JBGS089）*通信作者：李辉平（1982），硕士，副研究员，主要从事食用菌栽培与遗传育种研究。E-mail：。386 2023 年 第 31 卷 第 6 期 杏鲍菇（Pleurotus eryngii），学名刺芹侧耳，隶属侧耳科、侧耳属，是我国三大重要工厂化栽培珍稀食用菌之一，其野生种质资源主要集中在南欧、北非、中亚等地1。杏鲍菇含有多种膳食纤维、维生素、人体必需氨基酸及功能性多糖等，具有药食兼用的功能，深受消费者的欢迎。分子标记的开发对开展种质资源收集与评价，培育优质新品种具有重要意义。杏鲍菇子实体形态特征较少且极易受外界环境因素影响，单从形态水平鉴定杏鲍菇菌株的亲缘关系比较困难。DNA 分子标记技术作为一种快速鉴定样品间遗传多样性的方法被广泛应用于种质资源鉴定、基因定位、分子辅助育种等多方面。目前在杏鲍菇上得到应用的分子标记主要包括有限制性片段长度多态性（RFLP）2、随即扩增多态性 DNA（RAPD）3、简单重复序列多态性（SSR）4、简单重复序列间区（ISSR）5和多核苷酸多态性（MNP）6标记技术等。插入/缺失（insertion-deletion，InDel）是指在不同个体之间基因组同一位点的序列发生了数个碱基的插入或缺失，在基因组中的分布密度仅次于SNP，适用于全基因组分子标记的开发。InDel 标记目前在医学、动植物遗传学都得到广泛应用，在食用菌遗传多样性中也逐步得到应用7。Xiang 等筛选了 68 对 InDel 引物，分析了 88 个香菇栽培群体的遗传多样性8。沈秀芬等通过对 5 个香菇菌株重测序，开发并利用 InDel 标记对 44 份香菇菌株进行遗传多样性分析，并将其分为 4 个亚群9。本研究通过 InDel 分子标记技术，对搜集的杏鲍菇菌株进行遗传多样性评价，为杏鲍菇种质资源评价及开发利用提供技术支撑。1 材料与方法 1.1 供试菌株 65 份杏鲍菇菌株由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供（表 1），其中栽培菌株主要来自国内企业和市场，CCMSSC 菌株来自国家食用菌标准菌株库。1.2 菌丝培养 采用常规的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）进行菌丝活化 3 d 后，打孔接入 250 mL 马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）摇瓶进行菌丝扩大培养，25 下 150 r/min 培养 5 d，接真空泵抽滤收集菌丝，用纯净水洗涤 2 次。表 供试菌株编号信息 序号 编号 来源 序号 编号 来源 序号 编号 来源 序号 编号 来源 1 Per1 栽培菌株 18 Per18 栽培菌株 35 Per35 CCMSSC03898 52 Per54 栽培菌株 2 Per2 栽培菌株 19 Per19 栽培菌株 36 Per37 CCMSSC00467 53 Per55 栽培菌株 3 Per3 栽培菌株 20 Per20 栽培菌株 37 Per38 CCMSSC00468 54 Per56 栽培菌株 4 Per4 栽培菌株 21 Per21 栽培菌株 38 Per39 CCMSSC00470 55 Per57 栽培菌株 5 Per5 栽培菌株 22 Per22 栽培菌株 39 Per40 CCMSSC00471 56 Per58 栽培菌株 6 Per6 栽培菌株 23 Per23 CCMSSC00479 40 Per41 CCMSSC00472 57 Per59 栽培菌株 7 Per7 栽培菌株 24 Per24 CCMSSC00480 41 Per42 CCMSSC00473 58 Per60 栽培菌株 8 Per8 栽培菌株 25 Per25 CCMSSC00481 42 Per43 CCMSSC00474 59 Per61 栽培菌株 9 Per9 栽培菌株 26 Per26 CCMSSC00482 43 Per45 CCMSSC00476 60 Per62 栽培菌株 10 Per10 栽培菌株 27 Per27 CCMSSC01353 44 Per46 CCMSSC00477 61 Per63 栽培菌株 11 Per11 栽培菌株 28 Per28 CCMSSC02874 45 Per47 栽培菌株 62 Per67 栽培菌株 12 Per12 栽培菌株 29 Per29 CCMSSC02875 46 Per48 栽培菌株 63 Per68 栽培菌株 13 Per13 栽培菌株 30 Per30 CCMSSC03301 47 Per49 栽培菌株 64 Per69 栽培菌株 14 Per14 栽培菌株 31 Per31 CCMSSC03860 48 Per50 栽培菌株 65 Per70 栽培菌株 15 Per15 栽培菌株 32 Per32 CCMSSC03861 49 Per51 栽培菌株 16 Per16 栽培菌株 33 Per33 CCMSSC03869 50 Per52 栽培菌株 17 Per17 栽培菌株 34 Per34 CCMSSC03870 51 Per53 栽培菌株 姜晓红等：基于 InDel 标记的杏鲍菇遗传多样性评价 387 1.3 DNA 纯化 取 10 mg 的菌丝体，研钵中用液氮将其迅速研磨成粉状，用 DNA 提取试剂盒（上海生工）按操作手册纯化 DNA。检测 OD260/OD280 比值，范围在 1.71.9 为合格，并将核酸浓度统一为 50 ng/L后放入 20 冰箱备用。1.4 InDel 位点筛选与引物设计 依据 NCBI 网站公布的杏鲍菇基因组数（GCA_015484515.1 和 GCA_001717165.1），通过Minimap2进 行 基 因 组 比 对10，以GCA_001717165.1 为参考基因组，筛选 30200 bp碱基差异的 InDel 位点，随机选择 36 个位点，在其上下游各 150 bp 内利用 Primer 3 设计（参数默认）引物（表 2），引物由北京擎科生物科技股份 表 2 引物序列及多态性 引物名称 引物序列(5-3)退火温度/扩增条带/bp 多态性 引物名称 引物序列(5-3)退火温度/扩增条带/bp 多态性 PerSV1_F TCGAGAGGACCGGTTCGA 59.7 265 是 PerSV19_F CGACGCAAGGAAAGGGGA 59.7 258 否 PerSV1_R ACGCTGCTTCACTCTTCCC 60.0 265 是 PerSV19_R TGGCCATGCTTGTCCACC 60.3 258 否 PerSV2_F GAACGCACAGAGCTCCCA 59.7 276 是 PerSV20_F CGCCCGTTCTTCCAAGTCT 60.0 194 是 PerSV2_R CATGCGGCATCAACGTGG 59.9 276 是 PerSV20_R AGCCCGAACTCATGCGAC 60.1 194 是 PerSV3_F TGCAAGGGAAGTGGGTGG 59.5 240 是 PerSV21_F TAACCTACACGGCGGGGA 60.0 202 是 PerSV3_R CCTGTCCCTATCTCTTTCCCC 58.9 240 是 PerSV21_R CGGCCACCTTGGAGAGTG 60.0 202 是 PerSV4_F TCTCGGACTCAGTCGCCA 60.0 241 是 PerSV22_F TTGTGGCTTTCCCGTGGG 60.2 258 是 PerSV4_R CGAGCTCGTACGCCTCAG 60.0 241 是 PerSV22_R ATGCCCCACCGTTCTGTG 60.0 258 是 PerSV5_F TCATCAGTGGCCCAGAGC 59.0 213 是 PerSV23_F ATGCACACCCATCTGGCG 60.4 201 是 PerSV5_R GCAGTGTGCAGGAGCTCC 60.7 213 是 PerSV23_R TTCAAGCGCACAGAGGGG 60.0 201 是 PerSV6_F AAAGACCTGGGGCTGTACT 57.8 280 否 PerSV24_F AGTGCGACGAACCATGCA 60.0 248 是 PerSV6_R GCAGAGCCCTGTCTCTCAC 59.8 280 否 PerSV24_R GTGCGCGTTCTCGAATGC 60.3 248 是 PerSV7_F GCCTCTCGCCATACTCCC 59.3 259 是 PerSV25_F GACTGGTCGAGGATGCGC 60.6 274 是 PerSV7_R GGGGGTGAGGATCGGACT 60.0 259 是 PerSV25_R TCGTTGCCCACAGTTCCC 59.9 274 是 PerSV8_F AAGGGGAGCTGTGAGGCT 60.2 276 是 PerSV26_F GCCCCTCAAAGACAGGCA 59.6 274 是 PerSV8_R CACCCACTACGCCAGCTC 60.1 276 是 PerSV26_R GCGAACAGTGGCACATCC 59.1 274 是 PerSV9_F ACCATCCATCTCCTGCCCT 60.0 249 否 PerSV27_F GAGATCGAGGCCACGGTG 59.9 271 否 PerSV9_R GCCGCCGTGTTTGACATC 59.8 249 否 PerSV27_R TTCATGCAAGTCCGTCAAGA 57.5 271 否 PerSV10_F GACGGTCGTTGGGCTTCT 59.7 242 是 PerSV28_F TCTATGCCGTACCAAGTGTG 57.3 124 是 PerSV10_R CGGGCTACTCACGACTCG 59.6 242 是 PerSV28_R GACGTCATAAAATGCGGGGC 60.0 124 是 PerSV11_F TGCTCTCACCAAACCCACA 59.1 248 否 PerSV29_F TTCGATCCCCACGTTGGC 60.0 163 是 PerSV11_R GGGAAGCCCATGTGCACA 60.3 248 否 PerSV29_R GCGGATTGAGTGGACCCC 60.1 163 是 PerSV12_F AGACAGCGAAACGGCGAA 60.0 252 是 PerSV30_F TGAGCGCCAACTCGATCG 60.2 247 是 PerSV12_R TCCCCTCACTCCCATCGG 60.0 252 是 PerSV30_R GCTGTTGTCGCACGCTAC 59.5 247 是 PerSV13_F CGACGGGGGAAACGAACA 60.0 239 是 PerSV31_F AGGCATCTGCACATCCGC 60.5 262 是 PerSV13_R TCGCCTGTTCGTTCCCAC 60.0 239 是 PerSV31_R GTCCGGGCATCTGCACAT 60.1 262 是 PerSV14_F GAGGCTCGGCGTTTGACT 60.0 258 是 PerSV32_F CGTAGGCCTGCTGCTCTC 59.9 278 否 PerSV14_R CGAGAAACCGCCGTTGGT 60.7 258 是 PerSV32_R AGCGTTTGGTGACCCGAA 59.5 278 否 PerSV15_F GGCGCATGCTAGCTCTGA 59.9 275 否 PerSV33_F GCAAATTGACGCCCAGCA 59.4 194 否 PerSV15_R ACTCGCGTTCGATTGGGG 60.1 275 否 PerSV33_R GCTCTGCAGGACGTCGTT 60.0 194 否 PerSV16_F ACGGCCGTCTGTGTCAAG 60.0 259 是 PerSV34_F GCTGGATGAGCGTGTCGA 59.8 252 否 PerSV16_R AGGGTTCCCACGGTCAGT 60.1 259 是 PerSV34_R TCGCCAGCAAGCTCAAGT 59.6 252 否 PerSV17_F TCGGCAGCCAACAGAGTG 60.0 189 是 PerSV35_F ATGCTGCACAGGACGGTC 60.0 269 否 PerSV17_R GCACTGGCAGCGGTATCT 59.8 189 是 PerSV35_R CTGGGGTTCGCTTCCTCG 60.1 269 否 PerSV18_F AACACGATCGCGCAGGAA 60.0 236 是 PerSV36_F GGGGCTAGCTGTAAGGGC 59.5 234 否 PerSV18_R AGACGTTGCCGACCGATG 60.1 236 是 PerSV36_R TTCTCCGGACTTGTGGCG 59.7 234 否 388 2023 年 第 31 卷 第 6 期 有限公司合成。1.5 PCR 扩增和电泳分析 PCR 反应体系：2 PCRmix 10 L，正反向引物（10 mol/L）各 1L，模板 DNA 1L，补 dd H2O至 20 L。PCR 反应条件：98 4 min 预变性；95 10 s，63 10 s，72 10 s，30 个循环；72 5 min延伸后 4 保存。扩增产物用 2琼脂糖凝胶电泳进行检测，200 V 电泳 20 min，凝胶成像系统拍照并记录结果。1.6 数据处理 在 Excel 2016 中用 1 或 0 标记泳道间相同位移上条带的有或无，再导入 NTSYSpc 2.10 进行分析，计算遗传相似系数并用 UPGMA 法进行聚类分析。2 结果与分析 2.1 InDel 标记开发 经 比 对 发 现，GCA_015484515.1和GCA_001717165.1 间 30200 bp InDel 位点共 135个，其中插入 45 个，缺失 90 个，分布在 64 条Contig 上，每条 Contig 上的目标 InDel 位点少于 5个。位点之间平均距离大于 20 kb，50 个位点之间距离大于 10 kb，只有 4 个位点距离小于 1 kb。随机选取的 36 对 InDel 引物中筛选出条带清晰、重复性好的多态性引物 25 对，对扩增出的 63 个位点进行统计分析（表 2，图 1）。2.2 供试菌株遗传多样性分析 利用 NTSYSpc 2.10 软件进行矩阵分析并计算65 份材料间遗传相似系数，供试菌株遗传相似系数最低值是 0.362，表明存在较大的遗传差异，有丰富的遗传多态性，具有很大的开发潜力。其中菌株 Per22 与其他菌株间的遗传相似系数均很低，与Per18 之间的相似遗传系数仅为 0.362；而 Per53、Per54、Per55、Per56 两两之间的相似系数为 1，表明这四者之间的亲缘关系极近，很有可能属于同株异名。通过 UPGMA 聚类分析法构建的杏鲍菇菌株遗传亲缘聚类树（图 2），在遗传相似系数为 0.616的水平上将其分为 5 大类，第 1 类群数量最多，包括 Per1、Per2、Per14 等 51 个菌株，包含了大量国内栽培菌株；第 2 类群 6 个菌株，分别是 Per4、Per37、Per39、Per42、Per17、Per46；第 3 类群 6个菌株，分别是 Per3、Per48、Per68、Per70、Per67、Per69。Per45 和 Per22 与其他菌株之间的亲缘关系都很远。3 结论与讨论 InDel 在基因组中分布广泛、数目众多，分布密度仅次于 SNP，远高于 SSR，是人类和植物中第二丰富的基因变异形式11-13，而且大片段 InDel 标记可以直接利用琼脂糖凝胶电泳进行分型检测，对检测设备要求低、简单易行，成本大大低于 SNP 和SSR 检测成本14,15，更因其共显性遗传、变异稳定、准确性高、重复性好等特点，在群体遗传分析、基因定位及遗传图谱构建等领域被广泛应用9,11,16-19。图 1 PerSV16 和 PerSV20 InDel 标记多态性标记检测结果 注：Marker 大小 250 bp，图中数字为菌株列表序号。姜晓红等：基于 InDel 标记的杏鲍菇遗传多样性评价 389 本研究专门针对 30200 bp 的 InDel 位点进行开发，虽然得到的候选标记位点数量有限，但是符合易于检测的出发点，且在首批 36 个位点中就筛选得到 25 个多态性候选标记，都可用琼脂糖凝胶直接电泳检测，成功比例较高。InDel 标记开发一般利用不同材料重测序后与参考基因组进行比对分析获得9,20-22，这就需要该物种有公开的参考基因组，同时对不同材料进行重测序，需要一定的资金和时间成本。对于 SNP 和小 InDel，重测序数据更多的测序深度带来了更高的准确度。但随着测序技术和组装算法的不断进步，大 InDel 在基因组组装过程中假阳性越来越低。本研究通过比对已公开的杏鲍菇基因组数据，简单快捷且成本低，后续可利用更多的基因组组装数据进一步扩充。杏鲍菇野生种质资源主要分布于南欧、北非、中亚等地区，虽我国四川、青海、新疆也有分布报道23，但关于野生种质资源采集的报道较少。国内工厂化栽培菌株很多是引进自日本，并得到推广24。此间经过系统选育和杂交育种，我国栽培菌株具有一定的遗传多样性。刘晓红等对来自中国不同地区的杏鲍菇品种进行 RAPD 分析，发现 23 份材料遗传多样性很丰富，可分为5大类25。马红等用RAPD和 ISSR 标记将 34 个中国工厂化栽培杏鲍菇菌株分为 45 大类26。杨和川等基于 ISSR 标记对 27株杏鲍菇种质资源评价也得到类似结果27。这与本研究结果较为类似。但是魏传正等利用基因二代测序技术的 MNP 标记对国内 56 份工厂化栽培菌株 图 2 65 株杏鲍菇菌株遗传亲缘聚类树 相关系数0.460.590.730.861.00Per10 Per1 Per6 Per5 Per7 Per12 Per13 Per16 Per20 Per21 Per50 Per51 Per53 Per54 Per55 Per56 Per57 Per58 Per62 Per59 Per60 Per61 Per52 Per63 Per23 Per25 Per26 Per33 Per49 Per27 Per35 Per47 Per19 Per29 Per24 Per28 Per18 Per30 Per43 Per31 Per2 Per14 Per11 Per15 Per8 Per9 Per32 Per34 Per10 Per40 Per38 Per41 Per4 Per37 Per39 Per42 Per17 Per46 Per3 Per48 Per68 Per70 Per67 Per69 Per45 Per22 390 2023 年 第 31 卷 第 6 期 分析后，发现相似度均接近 100.00%，认为国内杏鲍菇栽培品种高度一致6。对国内栽培菌株的遗传多样性分析还值得进一步研究探讨。参考文献 1 郭美英.珍稀食用菌杏鲍菇生物学特性的研究J.福建农业学报,1998,13(3):44-49.2 黄晨阳,张金霞,郑素月,等.刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)rDNA的IGS2多样性分析J.农业生物技术学报,2005(5):47-50.3 尚晓冬,宋春艳,沈学香,等.杏鲍菇菌株 RAPD 指纹图谱分析J.食用菌学报,2009,16(3):1-4.4 李强,陈诚,熊川,等.杏鲍菇转录组数据SSR位点的生物信息学分析J.应用与环境生物学报,2017,23(3):454-458.5 陆娜,周祖法,王伟科,等.利用 ISSR 分子标记鉴别杏鲍菇生产菌株的研究J.北方园艺,2015(21):150-152.6 魏传正,王朦,张鹏,等.基于二代测序技术的MNP标记鉴别刺芹侧耳菌株J.食用菌学报,2023,30(1):1-9.7 沈秀芬,章炉军,张美彦,等.InDel 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