毛细管电泳.ppt

第第20章章 毛细管电泳法毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis CE)概述概述20.1 CE 的基本原理的基本原理20.2 CE 的分离模式的分离模式20.3 毛细管电泳仪毛细管电泳仪20.4 CE 在医药中的应用进展在医药中的应用进展 概述概述 电电泳泳：溶溶液液中中的的带带电电粒粒子子（离离子子、胶胶粒粒或或分分子子）在在电场中的定向迁移现象。电场中的定向迁移现象。物理化学现象。物理化学现象。毛毛细细管管电电泳泳（又又称称高高效效毛毛细细管管电电泳泳）（HPCE HPCE），是是一一类类以以毛毛细细管管为为分分离离通通道道、以以高高压压直直流流电电场场为为驱驱动动力力的新型电泳分离技术。的新型电泳分离技术。包含电泳、色谱及其交叉内容。包含电泳、色谱及其交叉内容。电泳法电泳法（electrophoresiselectrophoresis）以电泳为基础的分离分）以电泳为基础的分离分析方法。析方法。电泳法的发展史电泳法的发展史(Phylogeny)(Phylogeny)：电泳现象早在电泳现象早在1818世纪就被发现世纪就被发现。19091909年，年，L.MichaelisL.Michaelis提出提出“电泳电泳 (electrophoresiselectrophoresis)”)”这一术语，他的实验是用这一术语，他的实验是用于测定蛋白质的等电点。于测定蛋白质的等电点。19371937年，年，瑞典科学家瑞典科学家A.Tiselius A.Tiselius 成功研制出界成功研制出界面电泳仪，并建立了移动界面电泳法，用于人血面电泳仪，并建立了移动界面电泳法，用于人血清蛋白的分离。清蛋白的分离。TiseliusTiselius于于4848年获诺贝尔化学奖。年获诺贝尔化学奖。花絮1937年，年，Tiselius(瑞典瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白；球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；年，获诺贝尔化学奖；1.经典电泳技术经典电泳技术 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术电泳法或电泳技术。经典电泳法经典电泳法自由界面电泳（无载体电泳）自由界面电泳（无载体电泳）区带电泳（有载体支持电泳）区带电泳（有载体支持电泳）界面电泳界面电泳 ：在没有惰性支持物的液体接界面上：在没有惰性支持物的液体接界面上进行的电泳。进行的电泳。缺点：缺点：对流较严重，组分不能完全分离，检测困难对流较严重，组分不能完全分离，检测困难区区带带电电泳泳：是是在在溶溶液液中中加加入入一一些些惰惰性性物物质质或或凝凝胶胶物物质质作作为为支支持持物物，泳泳动动物物质质在在支支持持物物间间隙隙中中移移动动的电泳方法。的电泳方法。避免对流的干扰。避免对流的干扰。纸电泳纸电泳醋酸纤维素电泳醋酸纤维素电泳淀粉凝胶电泳淀粉凝胶电泳琼脂糖电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 常压电泳：常压电泳：电位梯度电位梯度 50V/cm 50V/cm高压电泳：高压电泳：电位梯度电位梯度 50V/cm 50V/cm影响因素：影响因素：1.电荷效应2.溶液pH值3.离子强度和温度4.电渗5.载体性质和分子筛电泳速度电泳速度电场强度电场强度V/L(V/m)电泳速率电泳速率 传统电泳的缺陷：传统电泳的缺陷：（1）焦焦耳耳热热效效应应：电电流流通通过过电电泳泳介介质质而而产产生生的热效应。的热效应。使使电电泳泳分分离离介介质质温温度度分分布布不不均均匀匀，引引起起溶溶液液对对流流，从从而而导导致致区区带带展展宽宽，降降低低分分离离效效率率。焦焦耳耳热热效效应应随随电电场场强强度度的的增增大大而而迅迅速速加加剧剧，限限制了高电压的使用。制了高电压的使用。（2）无法在线检测，定量精度较差）无法在线检测，定量精度较差。2.2.高效毛细管电泳技术高效毛细管电泳技术19811981年，年，Jorgenson和和Luckas，用，用7575 m m内径的内径的石英毛细管电泳分离了丹酰化氨基酸，柱效高石英毛细管电泳分离了丹酰化氨基酸，柱效高达达4040万万/m/m，使电泳技术发生了根本变革，迅速，使电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与发展成为可与GCGC、HPLCHPLC相媲美的崭新的分离分相媲美的崭新的分离分析技术析技术高效毛细管电泳。高效毛细管电泳。毛细管电泳：毛细管电泳：使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，使焦耳热效应减小，能使用高电压，全面改善分离质量和提高分析速度。总之，与经典电泳法比较，毛细管电泳法的特点总之，与经典电泳法比较，毛细管电泳法的特点有四个：有四个：高效、快速、微量和自动化。高效、快速、微量和自动化。毛细管的使用使产生的热量能够较快散发，大毛细管的使用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，大减小了温度效应，可以可以使用使用很高的很高的电压。电压。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱内电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱内径变小，柱长增加，理论塔板数高达几十万块径变小，柱长增加，理论塔板数高达几十万块/米，米，特殊柱子可以达到数百万。特殊柱子可以达到数百万。高效毛细管电泳在技术上采取了三项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了三项重要改进：一、采用了一、采用了50 50 m内径的毛细管；内径的毛细管；二、采用了高达数千伏的高电压；二、采用了高达数千伏的高电压；三、实现了高灵敏度的在线检测。三、实现了高灵敏度的在线检测。19811981年年，JorgensonJorgenson和和LukacsLukacs 使使用用75m75m内内径径的的熔熔融融石石英英毛毛细细管管，电电泳泳分分离离氨氨基基酸酸和和肽肽，成成为为高高效效毛毛细细管管电电泳泳划划时时代代的的里里程程碑碑。至至此此，出出现现了了毛细管电泳技术。毛细管电泳技术。8080年年代代以以来来，诞诞生生了了很很多多新新的的毛毛细细管管电电泳泳方方法法，如毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦电泳。如毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦电泳。8888年年商商品品化化HPCEHPCE问问世世，高高灵灵敏敏度度柱柱上上检检测测器器的的发发展展使使HPCEHPCE在在世世界界范范围围内内蓬蓬勃勃开开展展。HPCEHPCE已已成成为为电电泳领域发展最快的新分支。泳领域发展最快的新分支。毛细管电泳的发展毛细管电泳的发展 高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较（1 1）分离过程：）分离过程：相同相同 HPCE HPCE 与与HPLC HPLC 都都是是一一种种液液相相分分离离分分析析技技术术。都都是是差差速速迁迁移移过过程程，可可用用相相同同的的理理论论来来描描述述,如如保保留留值值、塔板理论和速率理论等。塔板理论和速率理论等。（2 2）分离原理：）分离原理：不同（不同（驱动力不同驱动力不同）HPCEHPCE：带带电电粒粒子子在在电电场场中中发发生生定定向向移移动动，依依据据粒粒子子所所带带电电荷荷数数、形形状状、离离解解度度等等不不同同所所产产生生的的差差速速迁迁移而分离。移而分离。HPLCHPLC：不同组分在两相中的分配系数不同而分离。不同组分在两相中的分配系数不同而分离。（4 4）应用：）应用：二者相互补充二者相互补充 HPCEHPCE在在生生物物大大分分子子分分离离方方面面，在在分分析析速速度度和和效效率率、样样品品和和试试剂剂用用量量方方面面有有优优势势，但但在在样样品品制制备备和和定定性、定量重复性等方面不及性、定量重复性等方面不及HPLCHPLC。（3 3）仪器流程：）仪器流程：基本相同基本相同 都都包包括括进进样样装装置置、分分离离柱柱、检检测测器器和和数数据据记记录录处处理理等部分。等部分。1.1.分离模式多：分离模式多：2.2.分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 在在3.1min内分离内分离36种无机及有机阴离子，种无机及有机阴离子，4.1min内分离内分离了了24种阳离子；种阳离子；分离柱效：分离柱效：105107/m理论塔板数；理论塔板数；3.3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 进样量极少（进样量极少（纳升）纳升），水介质中进行；，水介质中进行；4.仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶电源、毛细管、检测器、溶液瓶5.5.应用范围极广应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；小结：小结：高效毛细管电泳法的特点高效毛细管电泳法的特点 （多、快、好、省多、快、好、省）20.1 20.1 毛细管电泳的基本原理毛细管电泳的基本原理一、一、电泳和电泳淌度电泳和电泳淌度二、二、电渗和电渗率电渗和电渗率三、表观淌度三、表观淌度四、四、分离效率和谱带展宽分离效率和谱带展宽五、五、分离度分离度 介质的介电常数介质的介电常数 介质的粘度介质的粘度 i粒子的 Zeta 电势,近似正比于 Z/M2/3 Z 为净电荷，M 为摩尔质量。电泳的速度电泳的速度 uep 可表示为：可表示为：ep 电泳淌度，电泳淌度，单位电场下的电泳速度。单位电场下的电泳速度。空心毛细管柱中一个粒子的空心毛细管柱中一个粒子的淌度淌度近似表示为：近似表示为：一一、电泳和电泳淌度、电泳和电泳淌度与介质性质与介质性质有关有关与粒子性质有关：与粒子性质有关：表面电荷和粒子质量的大小表面电荷和粒子质量的大小有效淌度：有效淌度：在实际溶液中，考虑离子活度系数、溶在实际溶液中，考虑离子活度系数、溶质分子的离解程度均对粒子的淌度有影响，这时的质分子的离解程度均对粒子的淌度有影响，这时的淌度称为淌度称为有效淌度有效淌度。i 样品分子的第样品分子的第 i i 级电离度级电离度 i 活度系数或其它平衡离解度活度系数或其它平衡离解度总之，总之，粒子的迁移速度除与粒子的迁移速度除与电场强度电场强度和和介质的特性介质的特性有关外，有关外，还与粒子的离解度、电荷数及其大小和形状有关。还与粒子的离解度、电荷数及其大小和形状有关。不同的带电粒子电泳速度不同，可以实现分离不同的带电粒子电泳速度不同，可以实现分离二、电渗和电渗率二、电渗和电渗率电电渗渗（electroosmotic）：在在电电场场作作用用下下，液液体体相相对对带带电电的的固固体体支支持持介介质质移移动动的的现现象象，又又称称电电渗渗（流）（流）EOF。石石英英毛毛细细管管表表面面含含有有许许多多硅硅醇醇基基（SiOHSiOH），在在一一定定的的条条件件下下可可离离解解使使表面带有负电荷。表面带有负电荷。毛细管中的电渗流的形成毛细管中的电渗流的形成双电层抗衡离子机机理理：当当在在毛毛细细管管两两端端加加有有电电场场时时，双双电电层层内内靠靠近近管管壁壁的的稠稠密密层层中中可可迁迁移移阳阳离离子子向向阴阴极极移移动动。由由于于离离子子是是被被水水化化的的，因因此此，带带动动管管中中的的液液体体也也随随迁移着一起匀速向阴极移动，形成电渗流。迁移着一起匀速向阴极移动，形成电渗流。总之，总之，毛细管中的电渗流是毛细管内壁表面电毛细管中的电渗流是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动。荷所引起的管内液体的整体流动。电电渗渗流流的的特特点点：具具有有一一定定流流型型，其其电电渗渗驱驱动动力力沿沿毛毛细细管管均均匀匀分分布布，所所以以电电渗渗速速度度的的径向分布几乎是均匀的。径向分布几乎是均匀的。eo电渗率，电渗率，单位电场下的电渗流的线速度单位电场下的电渗流的线速度 介质的介电常数介质的介电常数 介质的粘度介质的粘度 管壁的管壁的 Zeta Zeta 电势，即电势，即双双电层到电层到管壁很近的地方之间的管壁很近的地方之间的电位差。电位差。总总之之，Zeta Zeta 电电势势越越大大，介介电电常常数数越越大大，粘粘度度越越小小，电渗流越大。电渗流越大。在在电电场场作作用用下下，电电泳泳和和电电渗渗同同时时存存在在，电电渗渗流流速速度度是电泳的是电泳的 5 5 7 7 倍。倍。电渗的速度可以表示为：电渗的速度可以表示为：硅醇基阴离子石英毛细管柱内壁的双电层结构图石英毛细管柱内壁的双电层结构图双双电电层层电电势势表面电势表面电势 0Stern电势电势 d电动电势电动电势 双电层模型双电层模型电渗流的控制：电渗流的控制：电渗流是毛细管电泳的基本操作要素，为了优化电渗流是毛细管电泳的基本操作要素，为了优化分离，有必要对它进行控制。分离，有必要对它进行控制。电渗流的控制要求对毛细管表面及缓冲液的粘度电渗流的控制要求对毛细管表面及缓冲液的粘度进行调节。进行调节。（1 1）电场强度）电场强度（2 2）缓冲溶液的）缓冲溶液的pHpH（影响管壁带电情况）（影响管壁带电情况）（3 3）缓冲溶液的浓度和离子强度（影响）缓冲溶液的浓度和离子强度（影响Zeta Zeta 电电势）势）三、三、表观淌度表观淌度在在毛毛细细管管电电泳泳中中同同时时存存在在电电泳泳流流和和电电渗渗流流，所所以以带带电电粒粒子子在在电电场场中中的的迁迁移移速速度度由由两两者者同同时时决决定定，可可表表示为：示为：uap 表观迁移速度表观迁移速度 ap 表观淌度表观淌度注：注：一般情况下一般情况下，uos os uefef中性分子中性分子 阳离子阳离子 阴离子阴离子电渗电渗流流四、四、分离效率和谱带展宽分离效率和谱带展宽1.柱效参数柱效参数理论塔板数和塔板高度理论塔板数和塔板高度理论塔板数：理论塔板数：塔板高度：塔板高度：Ld 进样口到检测器之间的距离进样口到检测器之间的距离t tm m 迁移时间迁移时间，W W1/21/2 时间半峰宽时间半峰宽影响柱效的因素：影响柱效的因素：（1 1）n n 与与 E E 成正比，成正比，E E 越大，柱效越高。越大，柱效越高。（2 2）n n 与与溶溶质质的的扩扩散散系系数数 （D）成成反反比比，D越越小小的分子柱效越高。的分子柱效越高。毛细管电泳的速率方程：毛细管电泳的速率方程：理论塔板数：理论塔板数：溶质的扩散系数溶质的扩散系数只有纵只有纵向扩散向扩散项项2.2.引起带展宽的因素引起带展宽的因素电渗的流型：电渗的流型：呈塞状扁平流型呈塞状扁平流型 扁平流型是毛细管电泳获得高分离度的重要原因扁平流型是毛细管电泳获得高分离度的重要原因之一，是理想状态。之一，是理想状态。（1 1）扩散）扩散扩扩散散系系数数由由溶溶质质本本身身的的性性质质决决定定，随随分分子子量量的的增增加而降低。分子越大，加而降低。分子越大，D D 越小。越小。因此，毛细管电泳特别适合分离生物大分子。因此，毛细管电泳特别适合分离生物大分子。另另外外，凡凡是是能能影影响响溶溶质质扩扩散散的的因因素素都都会会影影响响谱谱带带宽度。宽度。（2 2）自热（焦耳热）自热（焦耳热）焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时，焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时，在毛细在毛细管内形成管内形成径向温度梯度径向温度梯度（管壁温度（管壁温度 管轴心温度）管轴心温度）表：毛细管壁温度和中心到壁的温差表：毛细管壁温度和中心到壁的温差 径向温度梯度导致缓冲溶液的径向粘度梯度径向温度梯度导致缓冲溶液的径向粘度梯度 ，引起电泳，引起电泳淌度改变，淌度改变，导致离子迁移速度的径向不均匀分布，破坏导致离子迁移速度的径向不均匀分布，破坏了区带的扁平流轮廓，导致区带展宽，柱效降低。了区带的扁平流轮廓，导致区带展宽，柱效降低。焦耳热和温度梯度的控制焦耳热和温度梯度的控制焦焦耳耳热热的的大大小小与与毛毛细细管管尺尺寸寸、缓缓冲冲液液电电导导及及电电场场强度有关。强度有关。操作电压：操作电压：电压越高，焦耳热越严重。电压越高，焦耳热越严重。柱内径：柱内径：是影响焦耳热的一个重要因素。内径越是影响焦耳热的一个重要因素。内径越小，焦耳热的影响越小。通常毛细管电泳采用尽小，焦耳热的影响越小。通常毛细管电泳采用尽可能小的柱内径。可能小的柱内径。缓冲溶液的浓度：缓冲溶液的浓度：浓度增加，焦耳热增加浓度增加，焦耳热增加。目前常采用内径为目前常采用内径为 25 2575 75 m m 的毛细管柱的毛细管柱采用外管壁涂层技术采用外管壁涂层技术。Knox方程：方程：Edc1/31500E电场强度，电场强度，d d管内径，管内径，c c介质浓度介质浓度满足上式方程，自热影响较小。满足上式方程，自热影响较小。当当E=50kV/m,E=50kV/m,c c=0.01mol/L=0.01mol/L时，时，d140m即能即能满足上述方程满足上述方程 。(3)(3)吸附吸附毛细管电泳中的吸附作用主要指毛细管管壁对被毛细管电泳中的吸附作用主要指毛细管管壁对被分离物质粒子的作用。分离物质粒子的作用。主要原因：主要原因：阳离子溶质和带负电的管壁离子相互作用；疏水阳离子溶质和带负电的管壁离子相互作用；疏水作用。作用。吸附作用与毛细管表面积与体积之比有关。吸附作用与毛细管表面积与体积之比有关。内径越细，吸附越严重。内径越细，吸附越严重。五、五、分离度分离度分离度：分离度：将淌度相近的组分分开的能力。将淌度相近的组分分开的能力。n 理论塔板数理论塔板数 u/u 两组分的相对迁移速度差两组分的相对迁移速度差定义式：定义式：根据根据 Gidding 方程，分辨率方程，分辨率 R 定义为：定义为：对上面的公式处理，可得：由公式可见：由公式可见：R 并非随操作电压线性增加，而是并非随操作电压线性增加，而是与操作电压的平方根成正比。与操作电压的平方根成正比。操作电压的增加受到焦耳热的限制。操作电压的增加受到焦耳热的限制。20.2 20.2 毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的分离模式一、毛细管电泳的分类一、毛细管电泳的分类二、毛细管区带电泳法二、毛细管区带电泳法三、胶束电动毛细管色谱三、胶束电动毛细管色谱四、凝胶毛细管电泳法四、凝胶毛细管电泳法五、毛细管电色谱法五、毛细管电色谱法一、毛细管电泳的分类一、毛细管电泳的分类按分离模式可分为三大类按分离模式可分为三大类电泳型电泳型毛细管区带电泳毛细管区带电泳毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳色谱型色谱型 毛细管电色谱毛细管电色谱胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱微乳液电动毛细管色谱微乳液电动毛细管色谱电泳电泳/色谱型色谱型二、二、毛细管区带电泳法毛细管区带电泳法（C Capillary Zone Electrophorsis,CZE）毛毛细细管管区区带带电电泳泳（又又称称毛毛细细管管自自由由溶溶液液区区带带电电泳泳法法）是是毛毛细细管管电电泳泳中中最最简简单单、最最基基本本、使使用用最最广广泛的一种技术。泛的一种技术。CZE的理论的理论是其它是其它CECE方法的理论模板。方法的理论模板。中性分子中性分子 阳离子阳离子 阴离子阴离子1.1.分离机理分离机理 在在只填充缓冲溶液只填充缓冲溶液的毛细管中，不同质荷比大小的的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下因组分在电场的作用下因淌度不同淌度不同而进行分离。而进行分离。在在毛毛细细管管中中，由由于于电电渗渗流流的的存存在在，所所有有溶溶质质都随电渗流一起向负极迁移。都随电渗流一起向负极迁移。在在CZECZE中中可可以以实实现现正正负负离离子子（或或粒粒子子）的的同同时时分分离离,中中性性粒粒子子随随电电渗渗流流一一起起流流出出毛毛细细管管,不不能能分离（图谱上是一个峰）分离（图谱上是一个峰）。组分的检出顺序为：组分的检出顺序为：阳离子（粒子）阳离子（粒子）中性粒子中性粒子负离子（粒子）负离子（粒子）CZE溶质的迁移规律小结：溶质的迁移规律小结：2.2.影响影响CZECZE迁移速率的因素（操作条件的选择）迁移速率的因素（操作条件的选择）（1 1）操作电压）操作电压 操作电压与毛细管的内径和长度及缓冲溶液浓度操作电压与毛细管的内径和长度及缓冲溶液浓度（离子强度）有关。（离子强度）有关。柱柱长长一一定定时时，在在一一定定电电压压范范围围内内，操操作作电电压压与与粒粒子的迁移速度呈线性关系。子的迁移速度呈线性关系。当当电电压压过过高高时时，线线性性关关系系偏偏移移，主主要要是是由由高高电电压压引引起起的的焦焦耳耳热热造造成成的的。电电压压的的极极值值范范围围随随系系统统和和组成而异。组成而异。一般为小于一般为小于30KV30KV。电压对柱效的影响也是相同的。电压对柱效的影响也是相同的。（2 2）缓冲溶液的选择：）缓冲溶液的选择：重要的分离因素重要的分离因素CZECZE缓冲溶液必须符合以下条件：缓冲溶液必须符合以下条件：在规定的在规定的pHpH值范围内应有较强的缓冲能量，值范围内应有较强的缓冲能量，并维持恒定的并维持恒定的pHpH值。值。尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的缓冲盐。缓冲盐。在检测波长处有较低的吸收度在检测波长处有较低的吸收度尽可能采用酸性缓冲溶液。吸附和电渗都尽可能采用酸性缓冲溶液。吸附和电渗都小。缓冲溶液的缓冲溶液的pHpH：是影响组分离子淌度的最主要因是影响组分离子淌度的最主要因素。素。影响管壁电荷多少，影响电渗流的大小和迁移影响管壁电荷多少，影响电渗流的大小和迁移速率速率 ZetaZeta电位，电位，当当pHpH值在值在4 4 7 7时，对时，对EOFEOF影响最大影响最大 影响被分离物质的电荷，影响迁移速度和方向。影响被分离物质的电荷，影响迁移速度和方向。电离程度：如蛋白质，多肽等，电离程度：如蛋白质，多肽等，荷电状况：荷电状况：当当pHpH pIpI,溶溶质质带带正正净净电电，朝朝阴阴极极泳泳动动，和和电电渗渗方向相同，粒子迁移总速度比电渗快；方向相同，粒子迁移总速度比电渗快；当当pH pH pIpI，溶溶质质带带负负净净电电，移移向向负负极极，和和电电渗渗方向相反，粒子迁移总速度比电渗慢。方向相反，粒子迁移总速度比电渗慢。必须比必须比pIpI高或低一个高或低一个pHpH单位。单位。pI pI1 pH pH=pIpI，在在等等电电点点pIpI时时,正正负负解解离离相相等等，净净电电荷为荷为0 0；粒子迁移速度和电渗速度相同。粒子迁移速度和电渗速度相同。复习：蛋白质的等电点多肽多肽编号编号计算的电荷计算的电荷计算的等电点计算的等电点pH=2.5pH=2.5pH=4.0pH=4.0pH=11.0pH=11.01 12.412.412.022.02-0.47-0.4710.510.52 21.411.411.021.02-0.71-0.7110.110.13 31.371.370.460.46-0.71-0.716.76.74 40.410.410.020.02-0.95-0.956.06.05 50.370.37-0.54-0.54-1.95-1.953.23.26 60.330.33-1.09-1.09-2.95-2.953.03.0表：表：6个合成小肽的计算电荷和等电点影响进样过程，特别是采用电动进样方法。影响进样过程，特别是采用电动进样方法。缓冲溶液的种类：缓冲溶液的种类：影响离子的迁移和分离影响离子的迁移和分离 缓冲液缓冲液B4O72-cit3-Ac-PO43-HCO3-电流电流/A A EOFEOF/(10/(10-5-5cmcm2 2/V/Vs)s)137.441.2246.547.774.549.0162.049.769.051.8表：不同阴离子钠盐缓冲溶液测得的电流和电渗迁移率表：不同阴离子钠盐缓冲溶液测得的电流和电渗迁移率cit3-柠檬酸柠檬酸尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的缓冲盐。尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的缓冲盐。缓冲溶液的浓度缓冲溶液的浓度缓冲溶液的浓度缓冲溶液的浓度 浓浓度度增增加加，会会引引起起溶溶液液粘粘度度、溶溶质质、扩扩散散系系数数及及ZetaZeta电电位位等等的的变变化化，缓缓冲冲溶溶液液浓浓度度的的增增加加对对柱柱效效的影响比较复杂。的影响比较复杂。在在恒恒定定pHpH值值下下，浓浓度度增增加加，（扩扩散散层层变变薄薄），电电渗渗率率降降低低，溶溶质质的的迁迁移移速速率率下下降降，迁迁移移时时间间延延长长。分离效率提高。分离效率提高。浓浓度度的的增增加加，导导电电的的离离子子数数增增加加，在在相相同同的的电电场场下毛细管的电流值增加，焦耳热增加。下毛细管的电流值增加，焦耳热增加。总之：在一定浓度范围内，增加缓冲溶液的浓度可以提高柱效和分离度，并可以抑制管壁的吸附作用。常用浓度：常用浓度：10200mmol/LCZECZE特特点点：操操作作简简单单、快快速速、分分离离效效率率高高。应应用用广广泛泛，适适用用于于具具有有不不同同淌淌度度的的带带电电粒粒子子的的分分离离。分分子子量量范范围：从十几的小分子到几十万的生物大分子。围：从十几的小分子到几十万的生物大分子。不足：不能分离中性分子不能分离中性分子！添加剂：添加剂：改善管壁或溶质的理化性质，优化分离条件。改善管壁或溶质的理化性质，优化分离条件。表面活性剂：如表面活性剂：如SDS、季铵盐等；、季铵盐等；有机溶剂，如甲醇、乙腈等；有机溶剂，如甲醇、乙腈等；两性离子，如三甲铵基甲内盐等；两性离子，如三甲铵基甲内盐等；金属盐，如金属盐，如K2SO4、LiCl等等手性试剂，如环糊精、冠醚、胆汁酸盐等手性试剂，如环糊精、冠醚、胆汁酸盐等应用实例应用实例例例1 1 毛细管区带电泳分离五种碱性蛋白。毛细管区带电泳分离五种碱性蛋白。例例2 2 三种手性药物的对映体拆分三种手性药物的对映体拆分小结：三、三、胶束电动（毛细管）色谱胶束电动（毛细管）色谱（M Micellar electrokinetic chromatography,MEKC(Micellar electrokinetic capillary chromatography,MECC）胶束电动色谱：胶束电动色谱：是以胶束为是以胶束为假固定相假固定相的一种电动色的一种电动色谱法，是电泳技术与色谱技术的结合，因在毛细管谱法，是电泳技术与色谱技术的结合，因在毛细管中进行，又称为中进行，又称为胶束电动毛细管色谱。胶束电动毛细管色谱。1.1.胶束的形成和特性胶束的形成和特性表面活性剂：表面活性剂：由亲水基和疏水基组成。疏水部分为由亲水基和疏水基组成。疏水部分为直链或支链烷烃；亲水部分由阳离子、阴离子、两直链或支链烷烃；亲水部分由阳离子、阴离子、两性离子基团组成。性离子基团组成。临界胶束浓度（临界胶束浓度（CMCCMC）：）：表面活表面活性剂开始聚集形成胶束时的浓度。性剂开始聚集形成胶束时的浓度。不同的表面活性剂不同的表面活性剂CMCCMC不同，形不同，形成的胶束的形态也不相同。成的胶束的形态也不相同。胶束具有团状结构，疏水性的链胶束具有团状结构，疏水性的链端向里，带电荷的亲水端朝向缓端向里，带电荷的亲水端朝向缓冲溶液。冲溶液。具有增溶作用。具有增溶作用。表：常用的表面活性剂表：常用的表面活性剂表面活性剂表面活性剂CMC/(mmol/L)聚集数聚集数/n阴离子型阴离子型十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDS）8.262阳离子型阳离子型十二烷基三甲基溴化铵（十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）十六烷基三甲基溴化铵（十六烷基三甲基溴化铵（C.TAB）141.35078非离子型非离子型 辛基葡萄糖苷辛基葡萄糖苷n-十二烷基十二烷基 麦芽糖苷麦芽糖苷Triton-X-1000.160.24140两性离子型两性离子型 3-(3-胆甾酰胺丙基胆甾酰胺丙基)二甲基铵二甲基铵-1-丙磺酸内盐丙磺酸内盐810胆酸盐胆酸盐胆酸胆酸去氧胆酸（）去氧胆酸（）牛黄酸胆酸（）牛黄酸胆酸（）1451015244104聚集数聚集数n n：形成一个胶束离子所需的分子数。聚集数一般在：形成一个胶束离子所需的分子数。聚集数一般在40-14040-140个之间。个之间。MECC的分离原理示意图的分离原理示意图 胶束准固定相胶束准固定相液相载体液相载体阳阳极极阴阴极极2.2.分离机理分离机理 把把离离子子型型表表面面活活性性剂剂加加到到缓缓冲冲溶溶液液中中，使使形形成成离离子子胶胶束束。胶胶束束在在毛毛细细管管中中起起准准固固定定相相的的作作用用，使使中中性性溶溶质质在在流流动动相相（水水相相）和和准准固固定定相相（胶胶束束相相）中中进进行行分分配配，由由于于溶溶质质在在胶胶束中有不同的保留能力而产生差速迁移，从而实现分离。束中有不同的保留能力而产生差速迁移，从而实现分离。说明：说明：（1 1）离离子子型型胶胶束束表表面面带带电电荷荷。在在电电场场作作用用下下也也要要发发生生电电泳泳而而移移向向阳阳极极或或阴阴极极，如如SDSSDS表表面面带带负负电电荷荷，朝朝阳阳极极方方向向泳泳动动，和和电电渗渗方方向向相相反反。但但在在大大多多数数情情况况下下，电电渗渗速速度度大大于于胶胶束束的的电电泳泳速速度度，所所以胶束实际的移动方向朝向以胶束实际的移动方向朝向阴极阴极。（2 2）对对于于中中性性分分子子来来说说，分分离离仅仅受受溶溶质质进进入入和和离离开开胶胶束束这这一一行行为为的的影影响响。例例如如：阴阴离离子子胶胶束束迁迁移移方方向向与与电电渗渗流流相相反反，溶溶质质与与胶胶束束的的作作用用力力越越强强，迁迁移移时时间间越越长长。溶溶质质的的疏疏水水性性越越强强，与与胶胶束束间间的的作用力越强，迁移时间越长。作用力越强，迁移时间越长。用于用于MEKC的的胶束的基本要求：胶束的基本要求：(1)(1)生成的胶束稳定性要好，与溶质的缔合速生成的胶束稳定性要好，与溶质的缔合速度快，度快，减小峰扩散。减小峰扩散。(2)(2)形成的胶束必须是均匀、透明的溶液，能形成的胶束必须是均匀、透明的溶液，能透过紫外光；透过紫外光；紫外检测紫外检测(3)(3)胶束的粘度要小；胶束的粘度要小；不影响电渗流和分离度不影响电渗流和分离度(4)(4)表面活性剂的表面活性剂的CMCCMC要小，要小，不增大电流不增大电流在在MEKCMEKC中控制选择性的方法中控制选择性的方法（1 1）使用不同的表面活性剂）使用不同的表面活性剂 SDSSDS可用于大多数中性溶质的分离；可用于大多数中性溶质的分离；强疏水性溶质可选用极性强的胶束体系如胆强疏水性溶质可选用极性强的胶束体系如胆酸盐；酸盐；对易被管壁吸附的大分子溶质，可选用阳离对易被管壁吸附的大分子溶质，可选用阳离子胶束；子胶束；分离离子性溶质时，要选择与溶质电荷相反分离离子性溶质时，要选择与溶质电荷相反的胶束，才能相互作用进入胶束。的胶束，才能相互作用进入胶束。（2 2）缓冲溶液的选择）缓冲溶液的选择 缓缓冲冲溶溶液液体体系系的的改改变变可可以以改改变变溶溶质质在在两两相相间间的的分分配配系系数数，从从而而对对容容量量因因子子和和迁迁移移产生影响。产生影响。流流动动相相的的改改变变包包括括缓缓冲冲溶溶液液种种类类、成成分分、pHpH值和离子强度。值和离子强度。pHpH值值不不能能改改变变SDSSDS的的荷荷电电情情况况，因因此此不不影响胶束的泳动速度。影响胶束的泳动速度。（3）使用添加剂）使用添加剂（1 1）手性选择剂）手性选择剂（2 2）尿素、金属离子和硼酸盐）尿素、金属离子和硼酸盐（3 3）有机溶剂，如甲醇、乙腈等，控制溶质）有机溶剂，如甲醇、乙腈等，控制溶质胶束之间的相互作用。胶束之间的相互作用。MECCMECC的特点（与的特点（与HPLCHPLC比较）比较）（1 1）能能同同时时分分离离不不带带电电的的中中性性分分子子和和荷荷电电粒粒子子，并并可可用用于于强强疏疏水水性性溶溶质质的的分分离离。是是HPCEHPCE应用较多和较广的操作方式。应用较多和较广的操作方式。（2 2）分分离离效效率率高高，HPLCHPLC的的柱柱效效为为5 5，000 000 2525，000000理理论论塔塔板板数数；MECKMECK的的柱柱效效为为5050，000000 500500，000000理理论论塔塔板板数数。与与毛毛细细管管GCGC接接近，使分离复杂混合物成为可能。近，使分离复杂混合物成为可能。四、四、凝胶毛细管电泳法凝胶毛细管电泳法（Capillary Gel Electrophoresis，CGE）用凝胶物质作为支持物进行电泳的方式，用凝胶物质作为支持物进行电泳的方式，称为凝称为凝胶电泳。胶电泳。平板凝胶电泳平板凝胶电泳毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳：在毛细管内充有凝胶或其它筛：在毛细管内充有凝胶或其它筛分介质（分介质（凝胶柱凝胶柱），流经凝胶的物质，原则上按），流经凝胶的物质，原则上按分子的大小分离。分子的大小分离。凝胶介质凝胶介质：是一种固态胶体分散体系，由网状结：是一种固态胶体分散体系，由网状结构和共聚其中的溶剂所组成。凝胶物质具有多孔构和共聚其中的溶剂所组成。凝胶物质具有多孔性，有一种类似分子筛的作用。通过它的物质会性，有一种类似分子筛的作用。通过它的物质会按分子的大小逐一被分离开。按分子的大小逐一被分离开。凝凝胶胶无机凝胶：无机凝胶：多孔硅胶、多孔玻璃多孔硅胶、多孔玻璃有机凝胶：有机凝胶：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）纤维素衍生物纤维素衍生物特点：特点：柱效高柱效高 凝胶粘度大，抗对流，可减小溶质扩散；凝胶粘度大，抗对流，可减小溶质扩散；可可采采用用短短柱柱分分离离 溶溶质质与与凝凝胶胶（或或添添加加剂剂）可可生生成成络络合合物物，使使分分离离度度增增加加，防防止止溶溶质质在在管管壁壁的的吸吸附附并减小电渗流。并减小电渗流。和和常常规规的的SDS-PAGESDS-PAGE相相同同，毛毛细细管管SDS-PAGESDS-PAGE可可提提供供丰富的分子量信息，具有更好的定性分析性能。丰富的分子量信息，具有更好的定性分析性能。样样品品用用量量少少，可可以以实实现现自自动动化化，可可用用于于大大分分子子物物质的微制备和馏分收集。质的微制备和馏分收集。缺点：缺点：柱制备较困难，寿命偏短。柱制备较困难，寿命偏短。应用：应用：CGECGE在分子生物学和蛋白质化学上有十分广泛的在分子生物学和蛋白质化学上有十分广泛的应用。应用。在分子生物学上实现了包括在分子生物学上实现了包括寡聚核苷酸寡聚核苷酸纯化、纯化、反反应基因治疗应基因治疗、DNADNA测序和测序和PCRPCR产物的分析产物的分析。在蛋白质化学方面用于多肽和蛋白质的分子测量，在蛋白质化学方面用于多肽和蛋白质的分子测量，原蛋白和原蛋白和SDSSDS结合蛋白的分离等。结合蛋白的分离等。用于其它带电物质的分离，并可通过加入添加剂用于其它带电物质的分离，并可通过加入添加剂改变分离的选择性。如手性添加剂、离子对试剂、改变分离的选择性。如手性添加剂、离子对试剂、络合试剂改变络合试剂改变 CECCEC是是毛毛细细管管电电泳泳法法技技术术和和HPLCHPLC理理论论基基础础结结合合的的产产物，是最新的物，是最新的HPLCHPLC方法。方法。1981 1981 年出现，年出现，90 90年代才开始发展。年代才开始发展。它快速、经济、应用广，是最有前途的分析方法。它快速、经济、应用广，是最有前途的分析方法。五、五、毛细管电色谱法毛细管电色谱法（Capillary Electrochromatography,CEC）分离机理分离机理:CECCEC是在空管是在空管CZECZE中填充或涂布色谱固定相，依靠色中填充或涂布色谱固定相，依靠色谱和电场两种作用力，依据样品组分的分配系数和谱和电场两种作用力，依据样品组分的分配系数和电泳速度的差别而分离。电泳速度的差别而分离。柱效可达柱效可达 10 106 6 片片/米。米。CECCEC介质的选择首先是固定相