黄馨枝干炭疽病病原菌的鉴定.pdf

-19-专题研究上海农业科技 王旭，等：黄馨枝干炭疽病病原菌的鉴定 2023(6):19-22黄馨枝干炭疽病病原菌的鉴定王旭1 施文娟1 孔婷1 孙荣华2,3*（1镇江市城市绿化管理站，镇江 212000；2上海市园林科学规划研究院，上海 200232；3上海城市困难立地绿化工程技术研究中心，上海 200232）*为通信作者黄馨（Jasminum mesnyi），又称云南黄素馨，为常绿藤状灌木，喜温暖湿润的环境，因其适宜于堤岸、花架绿篱或坡地高地悬垂种植，在我国各地得到了广泛栽培1。例如，在江苏省镇江市，黄馨是高架、立交桥道路及公园绿地等区域的主栽品种。近年来，黄馨的病害发生引起了广泛关注。目前，国内外已报道引起黄馨叶部病害的病原菌有C.cassiicola、C.siamense2-3，但鲜有关于黄馨枝干病害病原菌的研究报道。目前，镇江市的黄馨上出现了一种新的枝干炭疽病，受害枝干在发病初期出现近椭圆形的病斑，随着病程的推进，病斑可从数厘米长发展至整个枝干，病害发生严重时易造成大量枝干枯萎死亡，给当地的生态景观效果带来较大影响。鉴于此，笔者对镇江市黄馨枝干炭疽病的病原菌进行了分离培养和致病性测定，并利用传统的形态学结合多基因联合分析构建系统发育树，进行了致病菌的鉴定，旨在为该病害的诊断及科学防控提供理论研究基础。现将相关研究结果报道如下。1 材料与方法1.1 症状观察2019年，笔者在江苏省镇江市七里甸街道，观察并记录黄馨枝干炭疽病的发病情况与危害特点，同时采集发病枝条带回实验室进行病原菌分离。病害调查分级标准参照罗卿权等4提出的标准，具体为：0级，无枝枯；1 级，1枝无分枝的小枝枯萎；2级，无分枝的小枝枯萎，数量大于1枝；3级，1枝有顶级分枝的枝条枯萎；级，有顶级分枝的枝条枯萎且枝条枯萎数大于 1枝；5级，1枝或1枝以上基部大枝（至少有两级分枝）枯萎；6级，整株枯萎。计算公式：株发病率（发病株数总株数）100%；病情指数(各级病株数各级代表值)（调查总株数最高级代表值）100。1.2 病原菌的分离及形态学鉴定将发病症状典型的病枝用组织分离法进行病原菌分离4，培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PotatoDextrose Agar，PDA）。取发病枝条病健交界处约3 mm 3 mm大小的植物组织，经75%乙醇消毒1520 s、5%次氯酸钠消毒 2 min、无菌水漂洗 3次、晾干后，接种在含 1%乳酸的 PDA平板上，然后将其置于25 恒温培养箱中，在14 h光照/10h黑暗条件下进行恒温培养。培养10 d后，在光学显微镜下观察病原菌的形态特征，记录分生孢子的形状和大小，挑取孢子，采用玻片萌发法观察附着胞的形态，参照相关文献从形态上进行初步鉴定5-6。1.3 致病性测定根据柯赫氏法则进行致病性测定。具体方法为：用无菌手术刀划伤枝条表皮，形成长度为1 cm的伤口，将菌丝块正面朝向伤口，用已浸湿无菌水的脱脂棉保湿，每个菌株重复接种3个枝条，并设置清水对照。接种后57 d观察枝条发病情况，并对发病枝条进行病原菌再分离，完成柯赫氏法则验证。1.4 多基因联合鉴定1.4.1 菌株 DNA提取与 PCR 扩增在接种菌株的 PDA 平板于 25 恒温培养箱、14 h光照/10 h 黑暗条件下培养 57 d 后，用灭菌的刀片刮取PDA平板表面菌丝，置于研钵中，加入液氮研磨，采用CTAB法提取基因组DNA7。对真菌的核糖体内转录区间隔区（internal transcribed摘 要：近年来，江苏省镇江市黄馨上出现了一种枝干炭疽病，给当地的生态景观效果带来了较大影响。为明确黄馨枝干炭疽病的病原菌种类，对该病害进行了症状观察，并通过组织分离法获得纯化菌株，依据柯赫氏法则进行致病性测定，结合传统的形态学鉴定和多基因联合分析构建系统发育树，最终将病原菌鉴定为暹罗炭疽菌C.siamense。关键词：黄馨；枝干炭疽病；形态学鉴定；多基因联合分析；镇江市中图分类号：S436.8 收稿日期：2023-02-02基金项目：上海市绿化和市容管理局科技攻关项目（项目编号：G230202）；镇江市社会发展指导性科技计划项目（项目编号：FZ2021043）-20-spaces，ITS）、肌动蛋白基因（actin，ACT）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene，GAPDH）、ApMAT基因(partial mating type Mat1-2 gene)、谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase gene，GS)、-微管蛋白基因（-tubulin gene，TUB2）进行扩增，引物序列及退火温度等见表18-9，引物设计由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。PCR 体系总体积为 25.0L，包括 0.1 L Taq 聚合酶（5 U/L）、2.5 L PCR Buffer(含Mg2+)、2.0 L dNTPs、引物(10 mol/L)各 1.0 L、1.0L 模板 DNA，然后用灭菌 ddH2O 补足 25.0 L。上海农业科技 SHANGHAI AGRICULTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY 2023(6)表1 引物序列、退火温度及PCR产物长度PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。1.4.2 聚类分析采用 NCBI数据库中的 Blastn工具进行序列比对和同源性分析，下载相似性高的序列及其对应模式菌的序列用于聚类分析。将所需序列，用ClustalX 2.0.10 进行比对剪切后，按ITS-GAPDH-ACT-TUB-ApMAT-GS的顺序分别首尾相连接，用MEGA-X软件以邻接法（neighbor joining，NJ）构建系统发育树，利用自展法(Bootstrap，1 000次重复)检验各分支的置信度。2 结果与分析2.1 病害症状观察及病情调查黄馨枝干炭疽病在镇江市始发于4月下旬，故本研究于2019年5月9月进行调查，共调查50株黄馨。结果表明，5月黄馨枝干炭疽病的病株率为28%、病情指数为 12.5，6 月黄馨枝干炭疽病的病株率为48%、病情指数为19.0，7月黄馨枝干炭疽病的病株率为62%、病情指数为32.0，8月黄馨枝干炭疽病的病株率为78%、病情指数为40.3，9月黄馨枝干炭疽病的病株率为82%、病情指数为42.6。黄馨枝干炭疽病在初发时，受害枝干出现黑褐色、近椭圆形病斑，随着病情的推进，病斑中心凹陷，病斑扩展延长呈长椭圆形或不规则形，且无分枝的小枝受害时，小枝萎蔫；在发病后期，基部枝条上病斑沿枝干扩展成条块状，使枝条上叶片枯萎，直至黄馨整株萎蔫干枯。病原菌不仅可以侵染黄馨较小的分枝，导致分枝枯死，也可侵染黄馨基部主枝，导致黄馨整株枯萎死亡。2.2 病原菌分离与致病性从采集的发病症状典型的黄馨病枝中，分离培养得到 10 个菌落形态一致的分离物（命名为 JM-1），其菌落呈圆形，边缘整齐，初期为白色；气生菌丝为白色至灰白色，后渐变为深灰色、絮状或绒状，培养皿背面呈现不均匀的灰白色。挑取菌落边缘的菌丝转移纯化，将菌株命名为2019JM。为验证菌株2019JM的致病性，将其接种于黄馨枝条，接种5 d 后发现，接种枝条萎蔫，发病症状与黄馨枝枯病自然状态下的感染症状相同，接种清水的枝条不发病。对接种发病的黄馨枝条进行病原菌再次分离，所得分离物的菌落形态与原分离物 JM-1 一致，证明 2019JM为黄馨枝干炭疽病的病原菌。2.3 病原菌形态学鉴定将病原菌2019JM接种在PDA培养基上，置于25 恒温培养箱中、于14 h光照/10 h黑暗条件下，培养 5 d 后，病原菌分生孢子呈椭圆形至长椭圆形，两端钝圆或一端略尖，无隔膜，单细胞，无色；分生孢子大小基本相近，大小为（12.116.5）m(4.05.0)m，见图 1-A。分生孢子萌发后，在顶端产生附着胞，附着胞为黑褐色、棍棒形或椭圆形，边缘大多规则，大小为(511)m(4引物名称ITS-1ITS-4GDFGDR512F783RAMFAMRGSF1GSR1T1T2基因ITSGAPDHACTApMATGSTUB2引物序列（5-3）TCCGTAGGTGAACCTGCGGTCCTCCGCTTATTGATATGCGCCGTCAACGACCCCTTCATTGAGGGTGGAGTGGTACTTGAGCATGTATGTGCAAGGCCGGTTTCGCTACGAGTCCTTCTGGCCCATTCATTCTACGTATGTGCCCGCCAGAAATACACCGAACTTGCATGGCCGAGTACATCTGGGAACCGTCGAAGTTCCACAACATGCGTGAGATTGTAAGTTAGTGACCCTTGGCC CAGTTG退火温度/526161555561PCR产物长度/bp562262256923919723-21-8)m，见图1-B。依据孢子和附着胞的形态特征，将其初步鉴定为炭疽菌属真菌，具体的种需要采用分子手段进行进一步鉴定5-6。注：A为分生孢子，B为附着孢。图1 菌株2019JM的形态特征2.4 病原菌rDNA-ITS序列分析提取病原菌基因组 DNA 并对ITS、GAPHD、GS、TUB2、ACT和ApMAT序列片段进行PCR 扩增，将序列提交给NCBI数据库，获得序列号，具体见表2。以Colletotrichum hippeastri（CBS 241.78）作为外群6，多基因序列系统发育树的聚类分析结果见图 2，菌株 2019JM 与 GenBank 中的模式菌株暹罗炭疽菌C.siamense(ICMPl8578、LC2940、LC2941、CBS125378)以很高的支持率聚为一支，表明菌株2019JM为暹罗炭疽菌。因此，综合依据形态学鉴定和系统发育树分析，本研究将引起江苏省镇江市黄馨枝干炭疽病的病原菌鉴定为C.siamense。3 结论与讨论炭疽菌属(Colletotrichum Corda)真菌寄主广泛，是世界范围内许多粮食作物及经济作物上的重要致病菌5-6，但是，炭疽菌属不同种之间的形态特征差异微小，且继代培养性状不稳定，故依据形态特征鉴定炭疽菌不够准确。同时，ITS基因序列难以区分胶孢炭疽菌复合群下近缘相似种之间的差异10，但依据多基因序列可以有效鉴定胶孢炭疽菌复合群下各种，故目前，多基因分析方法已成为炭疽菌属真上海农业科技 SHANGHAI AGRICULTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY 2023(6)表2 系统发育分析中的菌株信息菌株编号2019JMICMP18608ICMP17673CBS304.67ICMP12071ICMP18537ICMP18580ICMP18658LC0886ICMP18581LC2923IMI356878IMI319418CBS116870CBS470.96CBS145.29ICMP1778ICMP19051MTCC11350ICMP4832CBS124949BRIP45094ICMP18578LC2940LC2941CBS125378ICMP12942CBS241.78寄 主Jasminum mesnyiPersea americanaAeschynomene virginicaDioscorea alataMalus domesticaCoprosma sp.Coffea arabicaClidemia hirtaCordyline fruticosaCoffea arabicaCa.sinensis,pathogenCitrus sinensisCoffea arabicaMusa sp.Nuphar lutea subsp.polysepalaPsidium sp.Carica papayaSalsola tragusTheobroma cacaoCordyline sp.Theobroma cacaoXanthorrhoea preissiiCoffea arabicaCamellia sp.,pathogenCamellia sp.,pathogenHymenocallis americanaDiospyros kakiHippeastrum sp.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菌 种C.siamenseC.aenigmaC.aeschynomenesC.alataeC.alienumC.aotearoaC.asianumC.clidemiaeC.cordylinicolaC.fructicolaC.fructicolaC.gloeosporioidesC.kahawae subsp.kahawaeC.musaeC.nupharicolaC.psidiiC.queenslandicumC.salsolaeC.theobromicolaC.tiC.tropicaleC.xanthorrhoeaeC.siamenseC.siamenseC.siamense(cont.)C.siamensec.horiiC.hippeastri基因序列ApMatMT469883KM360143KM360145KC888932KM360144KC888930FR718814KC888929JQ899274JQ807838KJ954499JQ807843JQ894579KC888926JX145319KC888931KC888928KC888925KC790726KM360146KC790728KC790689JQ899289KJ954504KJ954505JQ899283JQ807840-22-菌鉴定的必要手段5-6。例如，ApMAT和GS的单基因或者双基因可以将暹罗炭疽菌从胶孢炭疽菌复合群下鉴定出来5-6。本研究前期采用单基因分析发现，依据ITS基因发育树的自展支持率较低，不能有效区分各序列的进化关系，而GS、TUB-2、ApMAT基因可以将暹罗炭疽菌的各菌株聚在一起，但是对胶孢炭疽菌复合群下其他种的自展支持率较低，说明只有依赖多基因序列才能有效区分胶孢炭疽菌复合群下各种的进化关系。暹罗炭疽菌C.siamense最早在泰国咖啡上被发现10，随后有C.siamense在草莓、葡萄、油茶、辣椒、橡胶等多种寄主植物上发生的报道6,8,11-14，由于C.siamense具有较强的致病力，故对寄主植物的经济价值和生态效益构成了严重威胁。在镇江市，C.siamense为害黄馨枝干引起的炭疽病一般在4月下旬开始发生，病害初发时，受害枝条上出现不规则病斑，无分枝的小枝受害时，会造成小枝枯萎；在5月6月，黄馨枝干炭疽病的病株率有所升高，但病害总体发生程度较轻，偶有顶级枝条萎蔫，多表现为无分枝的小枝枯萎和枝干部位出现病斑；7月9月是黄馨枝干炭疽病的发病高峰期，且此时夏季高温，受温度胁迫易造成大量枝干枯萎死亡，甚至造成黄馨整株枯死，严重影响了黄馨的生态景观价值。本研究利用病原菌形态特征结合多基因联合构建系统发育树分析，首次明确了引起镇江市黄馨枝干炭疽病的病原菌为C.siamense，这为该病害的诊断提供了理论依据，且这是国内首次报道C.siamense引起黄馨枝干炭疽病。有研究认为，炭疽菌易发生复合侵染，即多种炭疽菌可同时侵染同一寄主植物。另据文献报道，辣椒炭疽病的致病菌有 4 种；李杨等14在海南省的油茶上分离到3种不同的炭疽菌。因此，关于黄馨枝干炭疽病是否存在优势菌株和复合侵染现象也有待进一步研究确认。4 参考文献1 王少蓉.云南黄馨的扦插繁殖J.现代园艺,2006(9):43.2 ZHANG Y,YIN C,et al.First report of colletotrichum siamense causing anthracnose on jasminum mesnyi in ChinaJ.Plant Disease,2019,doi:10.1094/PDIS-05-20-1080-PDN.3 ZHANG Y L,WANG J Y,YIN C P,et al.First report of leaf spot caused by Corynespora cassiicola on Jasminum mesnyi in ChinaJ.Plant Disease,2018,102(12):2643.4 罗卿权,路广亮,王凤,等.芽黄 红瑞木枝干溃疡病病原 菌的鉴定及药剂防治J.植物保护,2017,43(3):122-128.5 DAMM U,CANNON P F,WOUDENBERG J H C,et al.The Colletotrichum boninense species complexJ.Studies in Mycology,2012,73:1-36.6 WEIR B S,JOHNSTON P R,DAMM U.The Colletotrichum gloeosporioides species complexJ.Studies in Mycology,2012,73:115-180.7 NICHOLSON P,PARRY D W.Development and use of a PCR assay to detect Rhizoctonia cerealis,the cause of sharp eyespot in wheatJ.Plant Pathology,1996,45(5):872-883.8 林春花,杨欢,赵晓宇,等.海南橡胶树炭疽菌Colletotrichum siamense和C.fructicola的鉴定及系统发育分析J.热带 作物学报,2018,39(1):129-136.9 LIU F,WEIR 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