生物素-亲和素反应的放大技术.ppt

生物素生物素-亲合素放大技亲合素放大技术术.第二节第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记一、理化特性一、理化特性二、亲合素（或链酶亲合素）的标记二、亲合素（或链酶亲合素）的标记第一节第一节 生物素的理化性质与标记生物素的理化性质与标记一、活化生物素一、活化生物素二、活化生物素标记蛋白质二、活化生物素标记蛋白质.第三节第三节 生物素生物素-亲合素系统的特点亲合素系统的特点一、灵敏度二、特异性一、灵敏度二、特异性三、稳定性四、适用性三、稳定性四、适用性五、其他五、其他思考题思考题小结小结第四节第四节 生物素生物素-亲合素系统的应用亲合素系统的应用一、生物素一、生物素-亲合素系统基本类型及原理亲合素系统基本类型及原理二、生物素二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用亲合素系统在酶免疫测定中的应用三、生物素三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用亲合素系统在荧光免疫技术中的应用四、生物素四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用亲合素系统在放射免疫测定中的应用五、生物素五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用亲合素系统在分子生物学中的应用.生物素（生物素（biotinbiotin）、亲和素）、亲和素（avidinavidin）是一对具有高度亲）是一对具有高度亲和力的物质，结合迅速、专一、和力的物质，结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。稳定并具有多级放大效应。BABBAABC.生物素（维生素生物素（维生素H H）动、植物组织中广泛动、植物组织中广泛 分布分布,卵黄和肝含量高卵黄和肝含量高分子量小，分子量小，244.31 D244.31 DI I环为咪唑酮环，可与亲合环为咪唑酮环，可与亲合 素结合素结合环为噻吩环，环为噻吩环，C2C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构分子的唯一结构 I I I I 咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环 噻吩环噻吩环噻吩环噻吩环 羧基羧基:可用于活化为其他衍可用于活化为其他衍生物生物第一节第一节 生物素理化性质与标记生物素理化性质与标记.一、活化生物素一、活化生物素 生物素侧链的末生物素侧链的末端羧基经化学修端羧基经化学修饰后制成带各种饰后制成带各种活性基团的衍生活性基团的衍生物物活化生物素活化生物素(生物素化衍生物生物素化衍生物)为何要活化？为何要活化？.活化生物素活化生物素活化生物素易活化生物素易与抗原、抗体、与抗原、抗体、酶及核酸分子酶及核酸分子中相应基团偶中相应基团偶联形成生物素联形成生物素化标记物化标记物 标记蛋白质标记蛋白质氨基氨基的活化生物素的活化生物素 标记蛋白质标记蛋白质醛基醛基的活化生物素的活化生物素 标记蛋白质标记蛋白质巯基巯基的活化生物素的活化生物素 标记标记核酸核酸的活化生物素的活化生物素 .活化生物素活化生物素标记蛋白质氨基的活化生物素标记蛋白质氨基的活化生物素BNHSBNHS分子可与蛋白质分子可与蛋白质 赖氨酸赖氨酸（碱性（碱性AAAA）的氨基形成肽键的氨基形成肽键 BNHSBNHS适用标记抗体和适用标记抗体和 中性或偏碱性中性或偏碱性的蛋白质的蛋白质生物素生物素N-N-羟基丁二酰胺羟基丁二酰胺碳二亚胺碳二亚胺生物素羟生物素羟基琥珀酰基琥珀酰亚胺酯亚胺酯(BNHS)(BNHS).如何减小空间位阻如何减小空间位阻长臂活化生物素长臂活化生物素（BCNHSBCNHS）：）：生物素和生物素和N-N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的距离增加，更易发挥生物素与大分子基团的距离增加，更易发挥生物素的活性作用。的活性作用。生物素分子量小，当与抗体或酶形成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的空间位阻效应，可对生物素与亲和素的结合以及BAS的应用效果造成干扰。？.标记蛋白质醛基的活化生物素标记蛋白质醛基的活化生物素生物素酰肼生物素酰肼(BHZ)(BHZ)：水合肼与生物素的合成物水合肼与生物素的合成物 主要用于标记主要用于标记偏酸性偏酸性糖蛋白糖蛋白 肼化生物胞素肼化生物胞素(BCHZ)(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接后，：生物素与赖氨酸连接后，再与无水肼反应而成。再与无水肼反应而成。除醛基外，除醛基外，BCHZBCHZ还可标记氨基还可标记氨基.标记蛋白质巯基的活化生物素标记蛋白质巯基的活化生物素马来酰亚胺马来酰亚胺-丙酰丙酰-生物胞素（生物胞素（MPB)MPB)：能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素 .标记核酸的活化生物素标记核酸的活化生物素光生物素光生物素(photobiotin)(photobiotin)光敏物质光敏物质 侧链上连接的侧链上连接的芳香基叠氮物基团芳香基叠氮物基团,经光照后经光照后,变为芳香基硝变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合,形成形成B-B-核酸探针，用于核酸探针，用于DNADNA或或RNARNA的标记。的标记。生物素脱氧核苷三磷酸（如生物素脱氧核苷三磷酸（如Bio-dUTPBio-dUTP）作为作为TTPTTP的结构类似物，可采用缺口移位法（的结构类似物，可采用缺口移位法（DNase IDNase I和和DNADNA聚合酶聚合酶I I）掺入到双链）掺入到双链DNADNA中。中。BNHSBNHS和和BHZBHZ 可直接标记核酸，但对碱基配对有影响。可直接标记核酸，但对碱基配对有影响。目前常用光生物素和生物素化目前常用光生物素和生物素化dUTPdUTP作为标记核酸的活化生物素。作为标记核酸的活化生物素。.特性：特性：活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标记多价性（是一个蛋白分子可被多个生物素标记多价性（是BAS多级放大多级放大作用的物质基础）；作用的物质基础）；BNHS多标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质多标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质,BHZ则多标记微则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后，活性降低；可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后，活性降低；二、活化生物素标记蛋白质二、活化生物素标记蛋白质.注意事项：注意事项：选择活化生物素：选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团依抗原或抗体分子所带可标记基团 的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；控制生物素：蛋白质比例控制生物素：蛋白质比例 生物素：生物素：IgG IgG 用量比用量比(mg/mg)宜为宜为2:1,IgG2:1,IgG应用浓度应用浓度 0.50.55 5g/ml;生物素生物素1 13 3个个/Ag/Ag，3 35 5个个/Ab/Ab；使用交联臂减少空间阻力使用交联臂减少空间阻力.第二节第二节 亲合素、链霉亲合素的理亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记化性质与标记亲合素亲合素(avidin,AV)和链霉亲合素和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特异性结合是生物素的天然特异性结合物。而且，物。而且，二者均为二者均为大分子蛋白大分子蛋白，因此几乎所，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链）或链酶亲合素（酶亲合素（SA）结合）结合。.结构结构 四亚基糖蛋白四亚基糖蛋白 四肽链蛋白四肽链蛋白 无糖基无糖基PI PI 10.5 610.5 6结合位结合位 色氨酸色氨酸 色氨酸色氨酸生物素生物素 4 44 4Ka Ka 10 1015 15 10 101515活性活性 131315U 1515U 1518U18U亲合素（亲合素（亲合素（亲合素（AVAVAVAV）链霉亲合素链霉亲合素链霉亲合素链霉亲合素(SA)(SA)(SA)(SA)一、理一、理 化化 特特 性性SASA表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合远低于远低于AVAV，因此目前以，因此目前以SASA标记的酶结合物更为常用。标记的酶结合物更为常用。.二、亲合素二、亲合素/链霉亲合素的标记链霉亲合素的标记v可标记可标记AV/SAAV/SA的物质：的物质：酶、抗原或抗体、铁蛋白、酶、抗原或抗体、铁蛋白、胶体金、胶体金、125125I I、异硫氰酸荧光素（、异硫氰酸荧光素（FITCFITC）等。）等。vHRP-AV(SA)（酶标记蛋白的直接标记法）：酶标记蛋白的直接标记法）：过碘酸钠法、戊二醛法。过碘酸钠法、戊二醛法。vABC/SABC：通过与生物素化酶复合物中的通过与生物素化酶复合物中的 生物素结合，间接地与酶形成结合物。生物素结合，间接地与酶形成结合物。AV(SA)+B-HRP/ALP ABC(avidin-biotin-peroxidase comlplex)/ABAP .第三节第三节 生物素生物素-亲合素系统亲合素系统(BAS)(BAS)的特点的特点灵敏度高灵敏度高:生物素标记蛋白具有多价性，且标记后的抗原生物素标记蛋白具有多价性，且标记后的抗原/抗体生物活性不变，每个亲合素有四个生物素结合部位，可同抗体生物活性不变，每个亲合素有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上，因此，时以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上，因此，BASBAS具有多级放大作用，反应的灵敏度高。具有多级放大作用，反应的灵敏度高。稳定性高和特异性强：稳定性高和特异性强：AV/SAAV/SA与生物素结合的亲与生物素结合的亲和常数比抗原和常数比抗原-抗体反应至少高抗体反应至少高1 1万倍，二者的结合呈高度专一万倍，二者的结合呈高度专一性和不可逆性，且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶、有机溶剂以性和不可逆性，且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶、有机溶剂以及反应试剂的高度稀释均不影响其结合。因此，及反应试剂的高度稀释均不影响其结合。因此，BASBAS稳定性高，稳定性高，特异性强。特异性强。.第三节第三节 生物素生物素-亲合素系统亲合素系统(BAS)(BAS)的特点的特点适用性广泛：适用性广泛：BAS的多级放大作用，以及既可的多级放大作用，以及既可 偶联生物大分子，又可连接标记材料，使偶联生物大分子，又可连接标记材料，使BAS不不 仅用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测仅用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测 及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各 类反应体系中反应物的分离、纯化。类反应体系中反应物的分离、纯化。其他：其他：可制成通用试剂（如生物素化二抗等）；可制成通用试剂（如生物素化二抗等）；反应试剂可高度稀释，特别是与一抗偶联使用可反应试剂可高度稀释，特别是与一抗偶联使用可 大幅减少一抗用量，降低实验成本；实验所需时大幅减少一抗用量，降低实验成本；实验所需时 间不长。间不长。.第四节第四节 生物素生物素-亲合素系统的应用亲合素系统的应用生物素与亲合素之间结合的亲合生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强，各自均可以与各型力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性，使时具有的多级放大作用等优越性，使BASBAS及其相关技术被广泛应用在各种标及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为记免疫分析技术领域中，尤其为标记标记免疫检测自动化分析免疫检测自动化分析做出了极大的贡做出了极大的贡献。献。.一、生物素一、生物素-亲合素系统基本类型亲合素系统基本类型及原理及原理BABBAB法：法：Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A/SAA/SA Ag-Ab Ag-AbB-B-A/SA A/SA B BE E Ag-Ab Ag-AbB-A/SA-BB-A/SA-BE E 特点：以游离特点：以游离A/SAA/SA分别连接分别连接B-AbB-Ab和和B-E B-E.BABA法，也称标记亲合素法，也称标记亲合素-生物素法生物素法:（labeled avidin-biotin,LABlabeled avidin-biotin,LAB）Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A AE/SAE/SAE E Ag-AbAg-AbB-A/SAB-A/SAE E特点：以特点：以A AE/SAE/SAE E代替代替BABBAB法中的法中的A/SAA/SA，省却了加，省却了加B BE E的步骤的步骤.3.3.ABC ABC法法 A+BA+BE A-BE A-BE-ABCE-ABC Ag+B Ag+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B ABCABC Ag-Ab Ag-AbB-ABC B-ABC 特点特点:将将BABBAB法中的法中的A A先与先与B-EB-E结合，制备成复合物结合，制备成复合物 ABC,ABC,网络了大量酶分子，使该法的检测灵敏网络了大量酶分子，使该法的检测灵敏 度显著提高。度显著提高。.BABBAABCBAB与ABC成员相同，反应顺序不同.此外，按待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，此外，按待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，BASBAS分为直接法和间接法。分为直接法和间接法。方 法 反应层次 直接法 BA Ag-(Ab-B)-A*BAB Ag-(Ab-B)-A-B*ABC Ag-(Ab-B)-A-B*C 间接法 BA Ag-Ab1-(Ab2-B)-A*BAB Ag-Ab1-(Ab2-B)-A-B*ABC Ag-Ab1-(Ab2-B)-A-B*CBAS实验方法及反应层次.二、生物素二、生物素-亲合素系统在酶免疫亲合素系统在酶免疫测定中的应用测定中的应用BASBAS在在ELISAELISA中的应用中的应用 ：BASBAS用于固相化抗原用于固相化抗原/抗体的制备抗体的制备 AV/SAAV/SA先包被固相载体、抗原先包被固相载体、抗原/抗体抗体 先与生物素结合先与生物素结合 AV/SA-BAV/SA-B反应而使抗原反应而使抗原/抗体固相化。抗体固相化。BASBAS用于用于ELISAELISA的终反应放大的终反应放大 BA-ELISABA-ELISA、BAB-ELISABAB-ELISA、ABC-ELISAABC-ELISABASBAS在均相酶免疫测定中的应用：在均相酶免疫测定中的应用：B BE E*A A-B A A-BE E（酶因活性中心受空间位阻作用而失活）（酶因活性中心受空间位阻作用而失活）反应系统：反应系统：B BE E*、AgAgA A、AbAb（限量）、标准（限量）、标准Ag/Ag/待检待检AgAgAgAgA A和待检和待检AgAg竞争结合限量竞争结合限量AbAb，若，若Ag AgAg Ag Ab Ag Ab AgA AgA AgA-A-B BE E 酶活性变化与待测标本中抗原浓度呈负剂量相关。酶活性变化与待测标本中抗原浓度呈负剂量相关。（酶活性降低）（酶活性降低）.三、生物素三、生物素-亲合素系统在荧光免亲合素系统在荧光免疫技术中的应用疫技术中的应用 BAS BAS用于荧光抗体技术可明显提高方法的灵敏度用于荧光抗体技术可明显提高方法的灵敏度和特异性，通常采用和特异性，通常采用BABA法，即用荧光素直接标法，即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）；也可采用游离亲记亲合素（或链酶亲合素）；也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（物素化抗体和荧光素标记的生物素（BABBAB法）法）或荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体或荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体的夹心法。的夹心法。BASBAS用于时间分辨荧光免疫分析也可以将反应信用于时间分辨荧光免疫分析也可以将反应信号放大。号放大。.四、生物素四、生物素-亲合素系统在放射免亲合素系统在放射免疫测定中的应用疫测定中的应用BASBAS主要与免疫放射分析主要与免疫放射分析(IRMA)(IRMA)检测体系偶检测体系偶联，用于对终反应的放大（联，用于对终反应的放大（BABA法）法）BASBAS也可用于也可用于IRMAIRMA反应后反应后B B、F F成分的分离成分的分离 .五、生物素五、生物素-亲合素系统在分子生亲合素系统在分子生物学中的应用物学中的应用以生物素标记核酸探针进行的定位检测以生物素标记核酸探针进行的定位检测用用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化将免疫测定技术与将免疫测定技术与PCR结合建立结合建立免疫免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测用于抗原的检测 如如DNADNAB-B-SASAProAProA-IgG-IgG-Ag,Ag,AgAg和和DNADNA间建立对应关系，从而将对蛋白质间建立对应关系，从而将对蛋白质的检测转化为对核酸的检测，抗原抗体反应的特异性与的检测转化为对核酸的检测，抗原抗体反应的特异性与PCRPCR技术的高度敏感技术的高度敏感性相结合，其检测灵敏度可达性相结合，其检测灵敏度可达1010-21-21molmol水平，水平，是迄今最敏感的分析方法是迄今最敏感的分析方法。.思考题思考题1.1.生物素的分子结构特点是什么？生物素的分子结构特点是什么？2.2.生物素通过什么结构、形式与生物大分子相连结？生物素通过什么结构、形式与生物大分子相连结？3.3.亲合素或链霉亲合素的分子结构、理化性质有何特点？亲合素或链霉亲合素的分子结构、理化性质有何特点？4.4.为什么亲合素、链霉亲合素具有为什么亲合素、链霉亲合素具有“桥联桥联”作用？作用？5.5.亲合素、链霉亲合素可以被哪些示踪剂标记？亲合素、链霉亲合素可以被哪些示踪剂标记？6.6.为什么生物素亲合素系统具有放大作用？为什么生物素亲合素系统具有放大作用？7.7.生物素与亲合素或链霉亲合素的结合是否与抗原抗体结合相同？生物素与亲合素或链霉亲合素的结合是否与抗原抗体结合相同？8.8.生物素亲合素系统放大的是反应过程还是单一检测信号？生物素亲合素系统放大的是反应过程还是单一检测信号？9.9.生物素、亲合素或链霉亲合素如何与标记免疫技术联接？生物素、亲合素或链霉亲合素如何与标记免疫技术联接？10.10.如何将生物素链霉亲合素放大系统用于所有双位点如何将生物素链霉亲合素放大系统用于所有双位点ELISA?ELISA?.小小 结结v生生物物素素亲亲合合素素（链链霉霉亲亲合合素素）系系统统具具有有的的多多级级放放大大独独特特效效应应，可可极极大大地地提提高高分分析析测测定定的的灵灵敏敏度度；二二者者之之间间的的高高亲亲和和、高高特特异异结结合合以以及及既既可可偶偶联联生生物物大大分分子子，又又可可连连接接标标记记材材料料的的特特性性，使使该该系系统统在在标标记记免免疫疫分分析析技技术术领领域域中中的的应应用用具具有有很很强强的的稳稳定定性性和和适适用用性性。该该系系统统有有二二种种基基本本类类型型：以以游游离离亲亲合合素素为为中中间间物物，分分别别连连接接包包含含生生物物素素化化大大分分子子的的待待检检反反应应体体系系和和标标记记生生物物素素的的BABBAB法法或或ABCABC技技术术；另另一一类类是是直直接接用用标标记记亲亲合合素素连连接接生生物物素素化化大大分分子子反反应应体体系系进进行行检检测测的的BABA法法或或LABLAB。此此外外，按按生生物物素素化化第第一一抗抗体体或或生生物物素素化化第第二二抗抗体体，又分为直接法或间接法又分为直接法或间接法BASBAS系统。系统。.v在在生生物物素素亲亲合合素素（链链霉霉亲亲合合素素）放放大大系系统统应应用用中中，无无论论采采用用酶酶、荧荧光光素素或或发发光光物物作作为为检检测测示示踪踪剂剂，均均是是待待测测抗抗原原与与生生物物素素化化抗抗体体反反应应形形成成复复合合物物后后，再再利利用用生生物物素素与与亲亲合合素素间间的的多多价价放放大大结结合合特特性性，或或直直接接与与标标有有示示踪踪剂剂的的生生物物素素结结合合（BABA、LABLAB法法），或或依依次次与与亲亲合合素素（链链霉霉亲亲合合素素）、生生物物素素示示踪踪标标记记物物反反应应连连接接成成聚聚合合物物（BABBAB、ABCABC法法），最最终终使使待待测测反反应应信信号号被被放大，提高检测方法的灵敏度。放大，提高检测方法的灵敏度。.