基于CRISPR_Cas9技术创制耐盐香稻.pdf

中国水稻科学(Chin J Rice Sci),2023,37(5):478485 478 http:/ DOI:10.16819/j.1001-7216.2023.220907 基于 CRISPR/Cas9 技术创制耐盐香稻 李景芳1 温舒越2 赵利君2 陈庭木1 周振玲1 孙志广1 刘艳1 陈海元3 张云辉3 迟铭1 邢运高1 徐波1 徐大勇1 王宝祥1,*(1连云港市农业科学院,江苏 连云港 222000；2南京农业大学,南京 210095；3江苏省农业科学院 种质资源与生物技术研究所,南京 210014；*通信联系人，email：)Development of Aromatic Salt-tolerant Rice Based on CRISPR/Cas9 Technology LI Jingfang1,WEN Shuyue2,ZHAO Lijun2,CHEN Tingmu1,ZHOU Zhenling1,SUN Zhiguang1,LIU Yan1,CHEN Haiyuan3,ZHANG Yunhui3,CHI Ming1,XING Yungao1,XU Bo1,XU Dayong1,WANG Baoxiang1,*(1Lianyungang Academy of Agricultural Science,Lianyungang 222000,China;2Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;3 Institute of Germplasm Resources and Biotechnology,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China;*Corresponding author,email:)Abstract:【Objective】It is of importance to promote salt-tolerant and fragrant rice breeding.We obtained transgene free homozygous rice materials with salt-tolerance and fragrance by CRISPR/Cas9-mediated editing of Badh2 and OsRR22 in japonica variety Lianjing 11.【Method】Target sites were designed according to knockout efficiency of editing sites in Badh2 and OsRR22 gene sequence.The pH-Ubi-Badh2-OsRR22 knockout vector was constructed and transferred into the recipient variety Lianjing 11 by the Agrobacterium-mediated technology.PCR detection for hygromycin,Cas9 marker and target gene sequencing were performed in the transgenic progenies to obtain badh2-osrr22 homozygous lines without exogenous gene insertion.The seed traits and salt tolerance at seedling stage were analyzed.【Result】Compared with the background material Lianjing 11,the 2-AP content of T2 significantly increased.After treated with 128 mmol/L NaCl solution for 14 days,the seedling height,the fresh and the dry weight of T2 line 21-30 increased by 15.2%,45.2%and 13.2%,respectively.【Conclusion】The successful editing of Badh2 and OsRR22 by CRISPR/Cas9 technology developed aromatic salt-tolerant homozygous lines without exogenous gene insertion,speeding up the breeding process of pyramiding multiple traits in rice.Key words：rice;CRISPR/Cas9;salt-tolerant;fragrance;Badh2;OsRR22 摘 要：【目的】为了促进耐盐香稻育种，利用 CRISPR/Cas9 系统对粳稻品种连粳 11 的 Badh2 和 OsRR22 基因进行编辑，以期快速获得一批不含有转基因成分且具有耐盐性和香味的纯合水稻材料。【方法】根据 Badh2 和OsRR22 基因序列中编辑位点的敲除效率设计靶位点，构建 pH-Ubi-Cas9-Badh2-OsRR22 敲除载体，利用农杆菌介导法转入受体品种连粳 11 中。对转基因后代进行潮霉素和 Cas9 标记 PCR 检测以及靶基因测序，获得无外源基因插入的 badh2-osrr22 纯合株系，并对后代种子性状和苗期耐盐性进行分析。【结果】T2代成熟种子中 2-AP 含量较背景材料连粳 11 显著增加，千粒重、粒长、粒宽无明显变化；128 mmol/L 氯化钠处理 14 d 后株系 21-30 较连粳 11 苗高增加 15.2%，苗鲜质量增加 45.2%，苗干质量增加 13.2%。【结论】利用 CRISPR/Cas9 技术对 Badh2和 OsRR22 基因编辑获得能稳定遗传且无外源基因插入的耐盐香稻材料，加快了水稻多性状聚合的选育进程。关键词：水稻;CRISPR/Cas9;耐盐;香味;Badh2;OsRR22 土壤盐碱化是制约水稻生产的主要非生物胁迫因素之一。我国盐碱地面积广，综合利用潜力巨大。培育能够利用沿海滩涂资源的耐盐水稻品种是增加土地利用率、提高水稻种植面积和产量的重要途径。近年来，水稻中大量耐盐相关基因被报道，如SOS11、OsMYB22、OsHKT1;13、OsNHX14、OsP5CS15、OsTPS16等水稻耐盐正调控基因以及收稿日期：2022-09-28;修改稿收到日期：2022-12-19。基金项目：连云港市财政专项资金资助项目（QNJJ2102;QNJJ2211;QNJJ1803）；江苏省农业重大品种创制计划资助项目（PZCZ201704）；江苏省政策引导类计划（苏北科技专项）资助项目（LYG-SZ202040）。李景芳等：基于 CRISPR/Cas9 技术创制耐盐香稻 479 OsSPL107、OsEIL28、OsGSK19、OsRR2210等水稻耐盐负调控基因。其中，OsRR22 编码一个包含696 个氨基酸的 B 型反应调节蛋白转录因子，参与细胞分裂素信号转导等过程，它的功能缺失显著提高了耐盐性。Zhang 等11通过 CRISPR/Cas9 技术靶向编辑 OsRR22 基因显著提高了水稻耐盐性。研究者也通过 RNAi8,12、T-DNA 插入13、基因编辑14等手段获得一系列耐盐水稻材料。优质米已经成为我国水稻生产的发展方向，米饭的香味是影响食味品质的重要因素之一。控制水稻香味的挥发性物质种类有很多，而绝大多数香米与普通大米 2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的含量存在显著差异，2-AP 的含量也常被用来评价稻米是否具有香味的重要参考指标15。水稻香味调控基因 Badh2编码甜菜碱醛脱氢酶，其突变使得 BADH2 蛋白功能丧失，导致-氨基丁醛积累，导致 2-AP 含量增加，使稻米具有香味16-17。目前已有很多报道通过TALEN18、CRISPR/Cas919等技术对水稻 Badh2基因进行定向修饰，使 BADH2 蛋白功能缺失，成功创制具有香味的水稻。对现有水稻品种性状进行改良或者研发出具有优异性状的品种是许多研究者一直努力的方向，目前选育优质抗逆品种主要是通过杂交和回交改良 等 常 规 育 种 手 段，品 种 选 育 周 期 长，CRISPR/Cas9 技术作为应用最为广泛的基因编辑技术，可以对内源基因组进行敲除、插入、碱基替换、点突变等修饰，快速改良品种关键性状，克服基因连锁效应带来的障碍，获得具有优良性状的新品种，未来可能在水稻遗传育种改良中发挥重要作用。本研究利用 CRISPR/Cas9 技术对连粳 11 水稻品种的耐盐和香味基因同时进行编辑，对转基因分离后代进行鉴定，筛选既耐盐又具有香味且不含有外源基因插入的纯合株系，以期为商业化育种技术的创新和产业发展提供思路。1 材料与方法 1.1 试验材料 本研究以连粳 11 为遗传转化受体，开展遗传转化试验。1.2 载体构建及转基因研究 通过 NCBI 网站获得 Badh2（Os08g0424500）和 OsRR22（Os06g0183100）基因组序列，登录CRISPR-GE 网 站（http:/ 计OsRR22、Badh2 基因靶位点，前引物为靶点序列 5端加上 GGCA 碱基，后引物为靶序列反向互补后 5端加上 AAAC 碱基（表 1），通过酶切、连接分别构建两个靶点的 sgRNA 入门载体，进一步酶切、连接，将 Badh2 和 OsRR22 基因靶标 sgRNA 连接形成一个入门载体并与 pH-Ubi-Cas9 载体连接构建水稻最终表达载体20。所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，基因测序由南京擎科生物有限公司完成。测序验证正确的质粒转入到农杆菌EHA105 菌株中，利用农杆菌介导的方法侵染连粳11 愈伤组织，并通过愈伤组织的筛选和分化等步骤获取转基因植株。1.3 PCR 鉴定及分析 1.3.1 T0代植株转基因鉴定 分蘖前期取连粳 11 和转基因植株叶片，采用CTAB 法提取基因组 DNA，用潮霉素标记进行 PCR鉴定，挑选 T0代转基因阳性株系种植。1.3.2 T1代植株转基因鉴定 分蘖前期取叶片，提取 DNA，用潮霉素引物和Cas9 标记引物进行扩增，剔除含有外源片段的植株，将不含有载体片段的植株用含有靶位点的引物进行 PCR 扩 增 和 产 物 测 序，测 序 结 果 使 用DSDecodeM 网站（http:/ BioXM 软件分析，选取 Badh2、OsRR22 编辑成功且纯合的株系后代用于香味和耐盐性鉴定。1.4 耐盐性鉴定 连粳 11 和基因编辑 T1代纯合种子用 75%酒精消毒，室温下浸种 2，催芽 1 d 至种子露白，将露白种子播到底部剪开的96孔PCR板中进行水培，23 d 换一次水。待幼苗长至 1 叶心时，换成 IRRI营养液培养21，每 23 d 更换一次营养液。当幼苗长至两叶一心时，用含 128 mmol/L NaCl 的 IRRI营养液培养11,22，以标准 IRRI 营养液作为对照，每 23 d 更换一次营养液，处理 2 周后，拍照，测定苗高、苗鲜质量、苗干质量，并进行耐盐性评价。所有测定均进行 3 次生物学重复。耐盐相关基因相对表达水平测定，以 UBIQUITIN 作为内参基因，数据采用 2Ct法进行分析23。1.5 基因编辑后代表型分析 将成熟的连粳 11 和基因编辑 T2代种子置于烘箱中60下烘至恒重，考查千粒重，并对粒长、粒宽进行测定。稻米香味物质 2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的含量采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用仪测定19。480 中国水稻科学(Chin J Rice Sci)第37卷第5期(2023年9月)2 结果与分析 2.1 基因编辑载体的构建 Badh2 基因包含 15 个外显子，OsRR22 基因包含 6 个外显子，利用 CRISPR-GE 在线设计 Badh2和 OsRR22 基因靶位点，选取两个分别位于第 6 外显子和第3外显子上的靶位点，对 Badh2 和 OsRR22基因进行编辑（图 1-A）。水稻 pH-Ubi-Cas9 终转化载体构建完成后（图 1-B），进行靶位点测序，载体测序结果表明设计靶点序列能够完全比对（图 1-C），将测序验证正确的质粒转化到农杆菌中并开展后续转基因实验。2.2 Badh2-OsRR22 的编辑及无标记后代的鉴定 将 Badh2 和 OsRR22 基因编辑载体转化到连粳11 的愈伤组织中，通过遗传转化获得 T0代转基因苗，利用潮霉素标记筛选阳性转基因植株，并进行下一代繁殖。分别提取 T1代转基因单株 DNA，通过 Cas9 载体引物筛选无外源标记的株系（图 2），并对筛选到的无外源标记的株系进行靶位点突变信息检测，表 1 本研究中使用的引物 Table 1.Primers used in this study.引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence(5-3)用途 Usage Badh2-S1-F GGCATGGTGGAAAAAGTCCTATAG构建 Badh2 敲除载体 Construction of Badh2 knockout vector Badh2-S1-R AAACCTATAGGACTTTTTCCACCABadh2-F CCTTTGTCATCACACCCTGGBadh2 敲除靶点测序鉴定 Badh2-R TAACTGCCTTCCTTGCCACGSequencing for Badh2 knockout target OsRR22-S1-F GGCACTCAACTGACCATACAACTC构建 OsRR22 敲除载体OsRR22-S1-R AAACGAGTTGTATGGTCAGTTGAG Construction of OsRR22 knockout vector OsRR22-F TAGGAGGAAGTTCGGTAATCGTOsRR22 敲除靶点测序鉴定 OsRR22-R ACATTTTCCCTGGTGAGTTTCTSequencing for OsRR22 knockout target Cas9-F CCTTCTGTGTGGTCTGGTTC载体检测Cas9-R AGACAATCACCCCCTGGAACVector assayHyg-F CTATTTCTTTGCCCTCGGAC转基因检测Hyg-R ATGCCTGAACTCACCGCGAC Transgenic detection qPCR SOS1-F ATTGCAGCTGAGCATGTACG实时荧光定量 PCRqPCR SOS1-R AGAGCTTGCTTTCGTGTGACQuantitative real-time PCR qPCR OsMYB2-F GGGCTGAAACGCACAGGCAAGA实时荧光定量 PCRqPCR OsMYB2-R CTGCTTGGCGTGCTTCTGCQuantitative real-time PCR qPCR OsNHX1-F GTGACAGACCTGGCAAATCC实时荧光定量 PCRqPCR OsNHX1-R TCGACACAGCTCCTCTCATC Quantitative real-time PCR qPCR OsHKT1;1-F TGCCAGAAGTTGTTGAAGCC实时荧光定量 PCRqPCR OsHKT1;1-R CCCAGGAACATCACCAGGATQuantitative real-time PCR qPCR OsP5CS1-F GTCAGAGTGGACTGATGGCT实时荧光定量 PCRqPCR OsP5CS1-R GCCTTTCTAGTGCTGATGGCQuantitative real-time PCR UBIQUITIN-F GCTCCGTGGCGGTATCAT实时荧光定量 PCRUBIQUITIN-R CGGCAGTTGACAGCCCTAG Quantitative real-time PCR ABadh2 和 OsRR22 基因结构及靶位点位置信息，绿色碱基代表 PAM序列；BBadh2 和 OsRR22 基因靶点 CRISPR/Cas9 载体构建；C表达载体中靶位点测序结果。A,Badh2 and OsRR22 structure and target site.The PAM motif is shownin green.B,Construction of CRISPR/Cas9 vector for Badh2 and OsRR22gene target;C,Target site sequencing results in the expression vector.图 1 Badh2 和 OsRR22 基因靶点和载体构建 Fig.1.Badh2 and OsRR22 target sites and CRISPR/Cas9vector construction.李景芳等：基于 CRISPR/Cas9 技术创制耐盐香稻 481 共检测到 6 种不同的纯合双突变植株，其中，Badh2 基因有 4 种突变类型，分别为插入 A、缺失 TA、缺失 AGTCCTATA 和缺失 TAT。插入 A导致蛋白翻译过程中第 267IN、268VS、269VG、270FV位氨基酸的替换，进而导致蛋白翻译提前终止；缺失 TA 导致第 267IS、268VG位氨基酸的替换，进而导致蛋白翻译提前终止；缺失AGTCCTATA，导致第 265S、266P、267I位这 3个氨基酸的缺失；缺失 TAT 导致第 267I位氨基酸缺失。OsRR22 基因有插入 T、插入 G 和 34 bp 缺失等 3 种突变类型，分别导致出现一段氨基酸的替换后终止翻译（图 3）。MDNA 标记；“+”阳性对照；“”阴性对照；19 为 T1代部分植株。Cas9 标记目标片段大小为 906 bp。M,DNA Marker;“+”,Positive control;“”,Negative control;Lanes 1 to 9,Some plants of T1.The size of the Cas9 marker target fragment is 906 bp.图 2 T1代部分植株 Cas9 标记鉴定结果 Fig.2.Identification of Cas9 markers in some T1 plants.红色箭头表示突变位置。“+”代表插入；“-”代表缺失。黑色箭头表示氨基酸位置。Red arrows indicate mutation positions.“+”means insertion;“-”means deletion.Black arrows indicate amino acid positions.图 3 T1代纯合株系 Badh2 和 OsRR22 突变类型 Fig.3.Mutation types at the Badh2 and OsRR22 loci of the homozygous lines in T1.482 中国水稻科学(Chin J Rice Sci)第37卷第5期(2023年9月)2.3 基因编辑水稻耐盐性鉴定 为了对基因编辑后代进行耐盐性鉴定，我们挑选了 T2代两个纯合株系 21-30、21-31 进行温室苗期耐盐性鉴定。分别使用水稻营养液和含有 128 mmol/L 氯化钠的营养液处理，数据分析表明盐处理条件下 21-30 和 21-31 株系苗高、苗鲜质量和苗干质量均显著高于连粳 11。21-30 苗高较连粳 11增加 15.2%，苗鲜质量增加 45.2%，苗干质量增加13.2%（图 4）。因此，与连粳 11 相比，OsRR22基因编辑后代的耐盐性增强。对水稻耐盐相关基因 SOS1、OsMYB2、OsNHX1、OsHKT1;1、OsP5CS1 的相对表达量进行分析，定量结果显示与连粳 11 相比，5 个耐盐调控基因均上调表达，其中 OsMYB2、OsNHX1 和 OsHKT1;1 在基因编辑后代中表达量显著升高（图 5），表明OsRR22 基因编辑引起了耐盐相关基因表达的改变。2.4 T2代植株农艺性状和 2-AP 含量测定 将野生型连粳 11 与 T2代 21-30、21-31 株系成熟种子进行比较，与野生型相比，21-30、21-31 后代千粒重、粒长、粒宽均无明显差异。利用 GC-MS 对连粳 11、21-30 和 21-31 株系种子中 2-AP 物质含量进行测定，发现 21-30 和 21-31 种子中 2-AP 含量数据用平均数标准差表示。*和*分别表示在 5%和 1%水平上差异显著(t 检验)。Values are shown as mean SD.*,*Significantly different at 0.05 and 0.01 levels by t-test,respectively.图 4 T2代两个纯合株系 21-30、21-31 苗期耐盐性鉴定 Fig.4.Salt tolerance identification of T2 homozygous lines 21-30,21-31 at the seedling stage.数值用平均数标准差表示。*表示在 5%水平上差异显著(t 检验)。Values are shown as mean SD*Significantly different at 0.05 level by t-test 图 5 野生型连粳 11 与 T2代 21-30 株系中耐盐相关基因的相对表达量 Fig.5.Relative expression levels of salt resistance related genes in the wild-type and its T2 line 21-30.李景芳等：基于 CRISPR/Cas9 技术创制耐盐香稻 483 分别为 0.277 mg/kg、0.294 mg/kg，而在连粳 11 种子中未检测到 2-AP（图 6）。3 讨论 连云港属于沿海城市，大面积沿海滩涂地不适合种植水稻等农作物，目前选育的适宜该地区种植的耐盐水稻品种相对匮乏，选育高耐盐水稻品种可以增加土地利用率，提高水稻种植面积和产量。香味是一种特色的水稻品质，也是稻米重要的品质指标。选育耐逆的优质稻米品种是近年来育种的主要目标，杂交育种技术是水稻传统育种的主要方法。与传统育种方法相比，基因编辑技术具有编辑效率高、不携带外源基因等优点，CRISPR/Cas9 基因编辑技术的出现使基因定向修饰更为简便，是水稻种质改良技术中的重大突破，加快了水稻育种进程。本研究针对连云港地区水稻品种种植需求，利用基因编辑技术以耐盐负调控基因 OsRR22 和香味调控基因 Badh2 为靶标基因，构建双基因串联的CRISPR/Cas9 基因敲除载体，转入到连粳 11 愈伤组织中，对两个基因同时进行编辑，通过转基因后代鉴定，获得无外源标记且稳定遗传的耐盐香味水稻株系。利用基因编辑技术改良水稻的报道已有很多，如抽穗期、抗稻瘟病、香味、直链淀粉含量、粒型等性状的改良，但同时对耐盐和香味基因进行编辑的报道较少。Xu 等24利用碱基精准编辑技术对 Wx基因进行三个靶位点的编辑，获得了直链淀粉含量为 1.4%11.9%的一系列水稻突变体，一方面为水稻品质改良育种创制了新资源，另一方面也为水稻品质精准育种和快速改良提供了新思路。Liu 等25利用基因编辑技术对 Hd2 的上游开放阅读框(uORF)进行编辑，可以使水稻实现不同程度延迟开花（4.611.2 d）的目的，对未来微效改变水稻开花性状的研究提供重要依据。徐善斌等26以 GS3、GS9和 Badh2 为靶基因，构建 CRISPR/Cas9 敲除载体，转入到龙粳 11 中，获得无 T-DNA 元件的纯合长粒香型水稻。OsRR22 和 Badh2 分别为水稻耐盐性和香味的负调控基因。本研究构建了 OsRR22 和 Badh2 的双基因敲除载体，利用农杆菌介导法转到连粳 11 中，对这 2 个基因同时进行编辑，获得了耐盐香型水稻材料。通过对后代转基因株系的筛选，获得 6 个不含有外源基因的纯合基因编辑株系，对其中 21-30和 21-31 株系种子中 2-AP 含量测定结果表明香味物质含量增加至 0.277 和 0.2294 mg/kg，苗期耐盐性较连粳 11 显著增强，且转基因株系千粒重、粒长、粒宽等性状无明显差异，以上纯合株系的获得为耐盐香型水稻的培育提供技术支撑和育种材料。谢辞谢辞：北京大学瞿礼嘉教授课题组提供了本研究所用的 CRISPR 载体，在此深表谢意。参考文献：1 El Mahi H,Perez-Hormaeche J,de Luca A,Villalta I,Espartero J,Gamez-Arjona F,Fernandez J L,Bundo M,Mendoza I,Mieulet D.A critical role of sodium flux via the plasma membrane Na+/H+exchanger SOS1 in the salt tolerance of riceJ.Plant Physiology,2019,180(2):1046-1065.2 Yang A,Dai X Y,Zhang W H.A R2R3-type MYB gene,OsMYB2,is involved in salt,cold,and dehydration tolerance in riceJ.Journal of Experimental Botany,2012,63(7):2541-2556.3 Wang R,Jing W,Xiao L G,Jin Y K,Shen L K,Zhang W H.The rice high-affinity potassium pransporter1;1 is involved in salt tolerance and regulated by an MYB-type 数值用平均数标准差表示。*表示在 1%水平上差异显著(t 检验)。Values are shown as mean SD*Significantly different at 0.01 level by t-test 图 6 野生型和转基因阳性株系中水稻籽粒和香味相关性状表现 Fig.6.Performance of rice yield and fragrance related traits in the wild-type and its positive transgenic lines.484 中国水稻科学(Chin J Rice Sci)第37卷第5期(2023年9月)transcription factorJ.Plant Physiology,2015,168(3):1076-1090.4 Liu S P,Zheng L Q,Xue Y H,Zhang Q,Wang L,Shuo H X.Overexpression of OsVP1 and OsNHX1 increases tolerance to drought and salinity in riceJ.Journal of Plant Biology,2010,53:444-452.5 张霞,唐维,刘嘉,刘永胜.过量表达水稻 OsP5CS1 和 OsP5CS2 基因提高烟草脯氨酸的生物合成及其非生物胁迫抗性J.应用与环境生物学报,2014,20(4):717-722.Zhang X,Tang W,Liu J,Liu Y S.Co-expression of rice OsP5CS1 and OsP5CS2 genes in transgenic tobacco resulted in elevated proline biosynthesis and enhanced abiotic stress toleranceJ.Chinese Journal of Applied&Environmental Biology,2014,20(4):717-722.(in Chinese with English abstract)6 Li H W,Wang X P.Overexpression of the trehalose-6-phosphate synthase gene OsTPS1 enhances abiotic stress tolerance in riceJ.Planta,2011,234(5):1007-1018.7 Lan T,Zheng Y L,Su Z L,Yu S B,Song H B,Zheng X Y,Lin G G,Wu W R.OsSPL10,a SBP-box gene,plays a dual role in salt tolerance and trichome formation in rice(Oryza sativa L.)J.G3:Genes,Genomes,Genetics,2019,9(12):4107-4114.8 Yang C,Ma B,He S J,Xiong Q,Duan K X,Yin C C,Chen H,Lu X,Chen S Y,Zhang J S.MAOHUZI6/ETHYLENE INSENSITIVE3-LIKE1 and ETHYLENE INSENSITIVE3-LIKE2 regulate ethylene response of roots and coleoptiles and negatively affect salt 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