机采血小板成分输注对肝癌细胞增殖转移的影响.pdf

J Clin Transfus Lab Med,August.2023,Vol 25,No.4456 论著机采血小板成分输注对肝癌细胞增殖转移的影响*罗婧菱 杨磊广西中医药大学第一附属医院；广西高校中医临床研究重点实验室，广西 530000DOI：10.3969/j.issn.1671-2587.2023.04.005*本课题受广西壮族自治区卫健委自筹课题（No.Z20210130，Z20210817）；广西中医药大学第一附属医院首批青年人才拔尖项目资助作者简介：罗婧菱，主要从事各类疾病在血小板输注后疗效及预后评估方面研究，（E-mail）。通信作者：杨磊，主要从事各类疾病的早期诊断及疗效评估方面研究（E-mail）。【摘要】目的 探讨不同储存天数及数量的血小板（PLT）对肝癌细胞增殖的影响。方法 收集南宁中心血站发往广西中医药大学第一附属医院的机采O型PLT辫子12份，根据存放天数不同分为新鲜PLT组与陈旧PLT组，其中新鲜PLT组为储存1 d的PLT；陈旧PLT组则为储存4 d的PLT。两组PLT分别与人肝癌细胞Huh-7进行共培养，通过划痕实验观察各组Huh-7细胞48 h内汇合度变化，通过Transwell实验观察各组24 h内Huh-7细胞侵袭能力的差异。结果 划痕实验结果显示，Huh-7细胞在与PLT共培养后，其增殖能力明显增强；加入相同数量PLT时，陈旧性PLT能够更强地促进Huh-7细胞增殖；当加入存储天数相同的PLT时，PLT数量越多，则普遍表现出相对较强的刺激细胞增殖的能力。Transwell实验结果与划痕结果相似，当PLT数量相同时，陈旧PLT刺激Huh-7细胞发生侵袭的细胞数较新鲜PLT组多，差异有统计学意义（P0.05）；加入Huh-7细胞中共培养的PLT数量越多，新鲜PLT组和陈旧PLT组发生侵袭的细胞数越多，差异有统计学意义（P0.05）。结论 PLT促进细胞增殖和侵袭的能力强弱，与PLT存储时间和PLT数量成正相关，PLT制品的应用细则需根据临床具体情况具体分析，在肿瘤性疾病患者治疗过程中，应尽量避免陈旧性PLT的应用，在不得不应用PLT治疗的情况下，应尽量减少PLT的输注，以达到减缓肿瘤细胞增殖和转移的目的。【关键词】肝癌细胞 血小板制品 增殖 侵袭 应用 【中图分类号】R457 【文献标识码】A 【文章编号】1671-2587（2023）04-0456-05Effect of Apheresis Platelets Transfusion on Proliferation and Metastasis of Hepatocellular Carcinoma Cells LUO Jingling,YANG Lei.The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine 2 Key Laboratory of Chinese Medicine Clinical Research,Education Department of Guangxi Zhuang Autonomous Regio 530000【Abstract】Objective To investigate the effects of platelets with different storage days and quantities on the proliferation of liver cancer cells.Methods Twelve type O platelet braids were collected from Nanning Central Blood Station and sent to the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine.According to the storage days,they were divided into fresh PLT group and old PLT group,of which the fresh PLT group was platelets stored for 1 day.In the old PLT group,platelets stored for 4 days were used.The two groups of platelets were co-cultured with human liver cancer cell Huh-7.The confluence degree of Huh-7 cells in each group within 48 hours was observed by scratch test,and the invasion ability of Huh-7 cells in each group within 24 hours was observed by transwell test.Results The results of scratch test showed that the proliferation ability of Huh-7 cells was significantly enhanced after co-culture with platelets.When the same amount of PLT was added,old PLT could promote the proliferation of Huh-7 cells more strongly.When PLT with the same storage days was added,PLT with a higher number generally showed a relatively stronger ability to stimulate cell proliferation.The results of transwell experiment were similar to the results of scratch.When the number of PLT was the same,the number of Huh-7 cells invaded by old PLT group was more than that of fresh PLT group,and the difference was statistically significant(P0.05).The more PLT was added into Huh-7 cells,the more invasive cells occurred in the fresh PLT group and the old PLT group,and the difference was statistically significant(P0.05).Conclusion The ability of platelets to promote cell proliferation and invasion is positively correlated with the storage time of platelets and the number of platelets.The application rules of platelet products need to be analyzed according to the specific clinical conditions.In the treatment of patients with neoplastic diseases,the application of old platelets should be avoided as far as possible,and the transfusion of platelets should be minimized when platelets have to be used,so as to achieve the purpose of slowing down the proliferation and metastasis of tumor cells.【Key words】Liver cancer cells Platelet products Proliferation Invasion Application目前，输注血小板（platelet，PLT）或富血小板血浆在临床上被广泛应用于各种外科术后围术期临床输血与检验2023年8月第25卷第4期457治疗1，如术后出血的预防及治疗、糖尿病足等肢端末梢的创面加速愈合等2。虽然，PLT的输注可以有效预防外科术后并发出血，一般情况下，每输注一个单位的PLT，血常规检查PLT计数提升（3050）109个/mL3。但是有研究显示4，临床输注PLT后，外周血中PLT计数的提升率并不能达到预期。更槽糕的是，一些肿瘤患者术后输注PLT后反而会促进肿瘤细胞的增殖和转移，导致患者预后差，35年生存率明显降低5。有报道指出6，PLT在存储过程中会不断活化，其产生并释放出的血小板微粒（platelet microparticle，PMP）具有促进肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。而临床在应用PLT制品的过程中，根据病情的不同可能会输注多个机采PLT（每个机采PLT单位数为2.51011个）。因此我们推测，PLT输注后，造成肿瘤细胞发生转移的现象，不仅仅在于PLT伴随储存时间延长而活化程度增加，同时也与PLT数量存在差异有关。因此，本研究旨在探讨不同数量及存放时间的机采PLT成分对肝癌细胞增殖和转移能力的影响，现汇报如下。资料与方法1 一般临床资料本实验中机采PLT均来自于南宁中心血站。献血者经问卷调查和体检均符合卫生部献血者健康检查标准（GB184692012），应用MCS+多功能血细胞分离机，按全血及成分血质量要求的标准采集机采PLT成分。取样量为PLT制品辫子，长度为10 cm。人肝癌细胞Huh-7，由广西中医药大学第一附属医院中心实验室赠予。一次性低值耗材、培养基等购自南宁点滴实验器械有限公司。2 PLT分类及实验分组2.1 PLT分类将PLT从采集之日计起，储存时间T72 h组视为新鲜PLT，储存时间72 hT120 h视为陈旧PLT，储存时间T120 h的PLT视为过期PLT。本研究选取储存24 h的PLT作为新鲜PLT，储存96 h的PLT作为陈旧PLT。2.2 实验分组本实验将PLT与Huh-7细胞进行共同培养，主要分为新鲜PLT组和陈旧PLT组。同时每组设置PLT数量梯度，分别为2105、4105、6105个/孔。3 划痕实验将对数期生长的Huh-7细胞用胰酶消化后计数后重悬，细胞浓度调至10105个/mL，取50 L加入12孔板。再将新鲜PLT及陈旧PLT按PLT数量梯度2105、4105、6105个/孔加入12孔板，每组设置3个副孔，对照组加入与PLT组等体积PBS。5%CO2、37条件下培养，待细胞汇合度达到70%时弃去细胞培养液，用无菌1 mL枪头或灭菌牙签垂直于孔板制造细胞划痕，用PBS冲洗孔板三次，除掉因划痕产生的细胞碎片。统一加入2 mL DMEM完全培养基，从划痕之时分别于0 h、12 h、24 h、48 h拍照记录结果时倒置显微镜下进行拍照，并测量细胞缝隙宽度，最终汇合度W用当时细胞缝隙宽度与0 h细胞宽度的差值表示（W=W12 h/24 h/48 h-W0 h）。4 Transwell 实验取对数期生长细胞的Huh7细胞用胰酶消化计数后重悬，将chamber小室放置于12孔板后加入300 L无血清DMEM培养基、Huh-7细胞5 000个与相应个数的PLT，在外室加入500 L完全DMEM培养基。每组设置3个副孔，对照组加入与PLT组等体积PBS。5%CO2、37条件下培养24 h。培养过后弃去chamber小室内部培养基，置于预先加入4%多聚甲醛溶液的24孔板中，室温固定30 min；固定后取出小室，用棉签小心擦干固定液，置于预先加入有结晶紫染液的孔中，室温染色30 min；用去离子水冲洗浸泡3次，每次3 min，取出小室后，用棉签吸去小室内部液体，之后小心擦去小室底部膜表面上的细胞；底面朝上在通风橱内晾干；将晾干后的小室置于显微镜下，200倍视野下观察各组副孔多个随机视野下染色细胞的数，统计结果，计算均值。5 统计学处理采用SPSS16.0进行统计学分析，计量资料采用均数标准差（MeanSD）表示，采用多因素重复测量方差分析（Two-Way ANOVA analysis with multiple factors），两样本间的两两比较采用两独立样本t检验（t-test），检验水准=0.05，P0.05时，则视为差异有统计学意义。结 果1 如图1和表1所示，两组PLT均可以促进Huh-7细胞增殖，各组细胞在48 h汇合度均明显高于对照组，差异有统计学意义FInteraction（12，147）=19.05，P0.01；FRow Factor（2，147）=1 450，P0.01；FColumn Factor（6，147）=41.71，P0.01。此外，在相同数量PLT刺激下，陈旧PLT各组细胞汇合度明显高于新鲜PLT各组，差异有统计学意义（P0.05）；当均采用新鲜/陈旧PLT对Huh-7细胞进行共培养（即 J Clin Transfus Lab Med,August.2023,Vol 25,No.4458新鲜/陈旧PLT组内比较时），PLT数量为6105个时，其48 h最终汇合度与对照组及组内另外两组相比差异有统计学意义（P0.05）；当PLT数量为2105个时，与加入4105个PLT时的最终汇合度相比，差异无统计学意义（P0.05）。表1 两组PLT在不同时间点对Huh-7细胞划痕汇合度分析（W/m）时间/汇合度（h/m）对照组新鲜PLT陈旧PLT2105个4105个6105个2105个4105个6105个12 h 37.9815.52 67.1514.94 53.558.032.334.77 34.747.7760.026.6162.487.4924 h68.239.38101.3013.22 90.0818.0967.847.27 54.527.92 97.3911.2688.316.4648 h127.3016.27138.7010.56 142.21.36156.1010.28176.505.54 174.4012.71 205.0018.93表2 两组PLT在不同时间点对Huh-7细胞Transwell结果分析（细胞计数/个）细胞数（个）对照组新鲜PLT陈旧PLT2105个4105个6105个2105个4105个6105个28.4511.7839.726.53*&46.3311.26*61.567.89*&49.4514.97*#&96.6314.25*#190.8020.60*#&*t，p2.78，0.053.44，0.057.2，0.053.66，0.0511.41，0.0522.45，0.05#t，p1.98，0.058.12，0.0517.65，0.05t，p1.64，0.056.78，0.056.92，0.0510.97，0.05&t，p1.64，0.053.32，0.056.92，0.0518.11，0.05注：*代表与对照组相比；#代表与新鲜PLT组内相同数量PLT组相比；代表与组内PLT数量为2105个相比；&代表与组内PLT数量为4105个相比，相应统计学指标t值p值如表中所示。图1 两组PLT在不同时间点对Huh-7细胞划痕汇合度实景图（200）2 Transwell结果如表2所示，新鲜PLT及陈旧PLT各组Huh-7细胞24 h后发生迁移的细胞数均明显高于对照组，差异有统计学意义（P0.05）；在加入相应数量PLT（4105个、6105个）与Huh-7共培养后，陈旧PLT组发生迁移的细胞数均明显高于新鲜PLT组，差异有统计学意义（P0.05）。同时，分别在新鲜PLT、陈旧PLT组内作比较，其统计结果显示，除新鲜PLT组内2105个与4105组发生迁移的细胞无统计学差异外（P0.05），随着加入PLT数量的增加，发生迁移的细胞数均有明显的升高，该变化存在统计学差异（P0.05）。讨 论1 PLT促进肿瘤细胞增殖转移的机制随着对富血小板血浆的深入研究，其在临床外科学中的应用价值不断被发掘出来7，临床应用也日渐广泛，以及患者对临床疗效的期待越来越高，PLT输注引起的一系列副作用也越来越得到广大医生的重临床输血与检验2023年8月第25卷第4期459图2 两组PLT在不同时间点对Huh-7细胞Transwell结果实景图（200）视8。由于PLT在其正常的生理周期中会发生活化9，其分泌的生长因子及PMP参与肿瘤的生长，并能促进肿瘤细胞在血管中黏附、滞留和转移10。PMP表面携带多种生物分子，如PLT膜糖蛋白CD41（GPba）、PLT衍生生长因子（Platelet Derived Growth Factor，PDGF）及碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等均参与血管内皮细胞的增殖过程11，同时在肿瘤相关毛细血管形成及转移灶的形成的过程中也起到了至关重要的作用12。另一方面，在肿瘤细胞转移的阶段，肿瘤细胞能诱导PLT活化促使其释放ADP、凝血酶和TXA2 PLT活化介质，进一步使肿瘤细胞加速转移13。2 PLT输注在肝癌患者治疗中的应用肝癌患者通常合并有脾功能亢进，因此过分亢进的脾功能会破坏大量PLT，因此肝癌患者在外科手术治疗前及术后都会合并PLT缺乏，同时在后期放化疗过程中使用的靶向药物对巨核细胞及骨髓功能产生强烈的抑制作用14，致使骨髓造血微环境受损，PLT数量进一步减少15。因此，输注PLT是针对临床肝癌患者不可缺少的的治疗方案之一16。但在诸多研究中指出，PLT与肿瘤细胞的增殖转移等多个过程有着密切的联系，输注PLT虽然能够能预防肿瘤患者的出血倾向，但是也有着促使肿瘤细胞增殖的副作用17。3 PLT制品保存时间和数量对肿瘤细胞的影响PLT在储存期间，PLT经历不同程度的生物化学、结构和功能的变化，通常称为储存损伤18。PMP的释放还会使得磷脂酰丝氨酸和p-选择素的暴露增加、免疫调节介质的积累、代谢分解增强和止血作用减少等负面影响，这一系列的因素都可能给患者造成不良转归和预后19。而PMP中的粘附受体-纤维蛋白原受体 GPba，即CD41（PLT表面糖蛋白）、PDGF等 是 造 成 肿 瘤 增 殖 和 转 移 的 重 要 生 物 学 因子20。在本研究结果中发现，人肝癌细胞Huh-7在与PLT共培养后，其增殖和侵袭能力明显增强。在孔板中加入相同数量的PLT来模拟肝癌患者输注PLT，该结果发现，加入陈旧PLT后的Huh-7细胞在划痕实验中48 h汇合度更高，Transwell实验中侵袭到半透膜上面的细胞更多，从而证明陈旧性PLT刺激Huh-7细胞增殖和侵袭能力比新鲜PLT的能力更强，因此临床在为肿瘤患者进行PLT输注时，应该尽量选择存储天数在3 d之内的PLT；同时我们的研究还发现，当PLT同样为新鲜PLT时，数量越少，肿瘤细胞表现出的增殖和侵袭能力更弱，但也明显高于不加PLT的对照组，差异存在统计学意义（P0.05），由此可说明PLT输注数量越多，其刺激肿瘤细胞增殖的能力越强，出现这个情况的原因可能是因为PLT数量越多，其分泌的PMP等刺激肿瘤细胞增殖和侵袭的物质含量越多，从而能够刺激肿瘤细胞增殖和侵袭能力增加。综上所述，在肿瘤外科患者术后治疗过程中，虽然PLT输注是必不可少的治疗方案之一，但是应严格把控PLT输注的指征，为防止肿瘤细胞的进一步转移和扩散，应尽量不输或者少输PLT，在出现PLT输注指征时，应该尽量选择存储天数少的PLT进行输注。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参 考 文 献 J Clin Transfus Lab Med,August.2023,Vol 25,No.44601 罗婧菱,李浩辰,杨磊.肝癌患者血小板输注无效的原因及干预策略研究进展J.浙江医学,2022,44(9):1009-1012.2 FERR-ANIORTE A,ALENTORN-GELI E,CUSC X,et al.Treatment of aneurysmal bone cyst with endoscopic resection and bone 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