咳嗽动物模型国内外研究进展.pdf

2023 年 9 月第 33 卷 第 9 期中国比较医学杂志CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINESeptember,2023Vol.33 No.9罗景舒,马建岭,罗敬月,等.咳嗽动物模型国内外研究进展 J.中国比较医学杂志,2023,33(9):99-112.Luo JS,Ma JL,Luo JY,et al.Research progress in animal models of cough J.Chin J Comp Med,2023,33(9):99-112.doi:10.3969/j.issn.1671-7856.2023.09.012基金项目 北 京 市 自 然 科 学 基 金(7192115,7184224);国 家 自 然 科 学 基 金(81373588);东 方 医 院“1166”人 才 培 养 项 目(040204001001002012);北京中医药大学科研基金(2017-JYB-JS-102,2018-JYBZZ-JS144)。作者简介罗景舒(1998),女,硕士研究生,研究方向:呼吸系统疾病中医药防治。E-mail:ljsrabbit 通信作者马建岭(1982),男,主任医师,博士,硕士生导师,研究方向:慢性咳嗽的中西医诊疗。E-mail:ponymjl 咳嗽动物模型国内外研究进展罗景舒1,马建岭2,罗敬月3,史利卿2,温绍惠2,李扭扭2,王丽云2(1.北京中医药大学第二临床医学院,北京 100078;2.北京中医药大学东方医院呼吸热病科,北京 100078;3.首都医科大学附属北京胸科医院中医科,北京 101149)【摘要】咳嗽为临床上常见症状,近年胸部影像无明显异常的慢性咳嗽发病率升高,其病因复杂,误诊误治率高,受到重视。目前研究认为咳嗽高敏感性是其重要的临床与病理生理学特征,与瞬时受体电位通路激活、气道炎症、神经通路及咳嗽中枢的易化等相关,然而其机制复杂,仍需深入研究。咳嗽机制的研究对于新药物的开发、临床疗效的提高、社会经济负担减轻等方面有着重要意义。而咳嗽动物模型对于咳嗽实验研究开展以及其机制阐明具有至关重要的作用,目前咳嗽动物模型分为单纯咳嗽模型和疾病咳嗽模型,但因为咳嗽发病机制复杂,病因较多,尚无统一的咳嗽模型制备标准,且仍处于不断的补充与完善之中。针对咳嗽动物模型建立的机制方法和研究进展,通过查阅和整理近年来国内外的相关文献,从模型动物的选择、单纯及疾病咳嗽动物模型的建立和应用等方面综合概述该类模型的研究现状,并进行比较评价,对当前咳嗽模型制备中的问题进行了思考与阐述,以期为实验研究中制备咳嗽动物模型、深入研究咳嗽的发病机制、治疗方法等提供参考。【关键词】咳嗽;发病机制;动物模型;咳嗽反射;咳嗽敏感性增高【中图分类号】R-33 【文献标识码】A 【文章编号】1671-7856(2023)09-0099-14Research progress in animal models of cough LUO Jingshu1,MA Jianling2,LUO Jingyue3,SHI Liqing2,WEN Shaohui2,LI Niuniu2,WANG Liyun2(1.the Second Clinical School of Medicine,Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100078,China.2.Department of Respiratory,Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100078.3.Traditional Chinese Medicine Department,Beijing Chest Hospital Affiliated to Capital Medical University,Beijing 101149)【Abstract】Cough is a common clinical symptom.The incidence of chronic cough without significant abnormalities on chest radiography has recently increased,and its complex etiology and high rates of misdiagnosis and mismanagement have received attention.Cough hypersensitivity has been identified as an important clinical and pathophysiological feature,associated with transient receptor potential pathway activation,airway inflammation,neural pathways,and cough-center facilitation;however,the mechanisms are complex and further detailed studies are needed.Information on cough mechanisms has important implications for the development of new drugs,improvements in clinical efficacy,and the reduction of socioeconomic burdens.Animal models of cough are crucial for experimental research and elucidating the mechanisms responsible for cough.Animal models of cough are currently divided into simple cough models and disease cough models;however,its complex pathogenesis and multiple causes mean that there is no unified standard for preparing cough models,and these continue to be modified and improved.The current review discusses the mechanisms,methods and research progress of animal cough models,and comprehensively summarizes the research statuses of these models from the perspectives of animal selection,establishment,and the application of simple and disease cough models,by reviewing the recent relevant global literature.We present a comparative evaluation and reflect and elaborate on the current problems in preparing cough models,to provide references for the preparation of animal models for experimental research and for in-depth research on the pathogenesis and treatment strategies of cough.【Keywords】cough;pathogenesis;animal model;cough reflex;increased cough sensitivityConflicts of Interest:The authors declare no conflict of interest.咳嗽是呼吸门诊常见就诊原因,其中慢性咳嗽占比约 1/31,逐渐受到重视,1998 年美国胸科医师协会制定了第一部咳嗽机制专家共识,此后咳嗽神经生理学相关指南及诊断和治疗指南多次更新,国内于 2021 年更新了最新版指南咳嗽的诊断与治疗指南。尽管咳嗽相关研究在逐步完善,由于其病因复杂,故临床误诊误治率较高,且长期、反复的咳嗽对患者的身心、医疗经济负担及社会保障等方面均造成影响1。而咳嗽机制研究对临床疗效的提高、新药的研制、减少社会经济保障负担等方面具有重要意义。关于发病机制研究,人体试验目前只有针对死亡患者短期内捐献遗体迷走神经及气道平滑肌的相关研究2,其仍具有相对复杂、标本较少、取材及时限短等局限性,因此动物实验研究为主要途径。可靠且可重复的动物模型是研究疾病病因、发病机制、治疗方法及开发新药的基础,选择合适的实验动物以及造模方法对咳嗽相关研究也具有重要意义。随着认识的不断深入,实验技术的推进,咳嗽动物模型造模方法亦在不断改进,另外基于国内外咳嗽指南不断发布,咳嗽分类及相关病种亦有较大变化,相关疾病模型有较多探讨,检索发现专项咳嗽动物模型文献亟待更新。本团队咳嗽专项临床及实验研究 20 年,笔者导师近期于英国帝国理工大学国立心肺研究所对咳嗽机制方面进行了专项实验研究,相关成果于国际会议学术交流3-4,对各种咳嗽模型的制备有较为深入的研究,并参与国内最新版指南制定,结合既往经验,现对咳嗽动物实验相关动物模型研究新进展进行整理比较及总结,以期为相关研究提供参考(表 1、表 2)。1 模型动物的选择 目前豚鼠、大小鼠、犬、猫、猪等动物常用,不同动物咳嗽反射的形式相异,其调节咳嗽反射的方式有所不同,对激发咳嗽的因素和反应也各有不同,因此为了适应不同研究目的及要求,应选用合理的模型动物。啮齿类小型动物如大小鼠、豚鼠,繁殖快,数量大,饲养繁殖及药物成本低,更易操作及进行大批量研究。大小鼠的咳嗽反射与人类差异较大,且不敏感,但小鼠转基因型模型完备,可用新技术较多,既往认为小鼠气道可能缺乏咳嗽反射所需部分神经突触及通路,难以区分咳嗽反射和呼气反射,然而近年来有研究表明可通过 Buxco 公司的全身体积描记系统(whole body plethysmography,WBP)识别小鼠咳嗽反射5,故用小鼠进行咳嗽研究也更普遍。而大鼠需要麻醉,抑制中枢,难于产生咳嗽,且其咳嗽反射来源于喉不是支气管束,并不是咳嗽模型的理想动物。犬、猫、猪等大型动物的实验操作较为容易,可用于研究药物的进一步筛选。犬适用于观察镇咳药物的作用时间,猫在受机械或化学刺激后易诱发咳嗽,但该类动物成本高,故由于经济和来源上的考虑,上述动物多用于确定药物初筛后的镇咳疗效。豚鼠免疫系统发达,对于化学刺激十分敏感,大多雾化引咳药易引起咳嗽,其咳嗽反射与人类相似;与清醒状态下的动物相比,麻醉动物和人之间的咳嗽反应性存在不同,而豚鼠可在清醒、不限制活动的状态下进行研究;体外研究提示机械刺激豚鼠迷走神经引起的去极化过程与人类亦较为相似;另外豚鼠还有占地小、脾气温顺、无攻击性的特点,其咳嗽监测也有成熟的软件,因此豚鼠作为咳嗽模型动物最为理想,是近年来咳嗽新药药理研究、咳嗽反射及相关研究最常用的动物6-7。2 单纯咳嗽模型 人类咳嗽的病理生理改变包括无明显的肺部炎症,以及对外界环境的刺激表现为咳嗽敏感性的提高,理想的咳嗽动物模型应具备上述特点6。单纯咳嗽模型是指直接通过刺激物刺激而制备的咳嗽模型,此类模型常被用于研究咳嗽反射的发生机制和咳嗽新药的研发等。咳嗽由一系列神001中国比较医学杂志 2023 年 9 月第 33 卷第 9 期 Chin J Comp Med,September 2023,Vol.33,No.9 表 1 单纯咳嗽动物模型比较Table 1 Comparison of animal models of simple cough造模方法Methods具体分类Sorts优点Advantages缺点Disadvantages适宜研究类型Suitable study types机械刺激法Mechanical Stimulation直接操作Direct operation简便易行Easy to use需麻醉,不能保证刺激强度一致,难以定量比较Requires anesthesia,does not guarantee consistent stimulus intensity,difficult to compare quantitatively改良仪器Improved instrumentation较为复杂More complex需麻醉,可以控制强度,定量比较Requires anesthesia,can control intensity,comparison quantitatively咳嗽反射机制Cough reflex mechanism化学刺激法Chemical stimulation 氨水引咳法Ammonia induced cough method柠檬酸引咳法Citric acid cough inducing method辣椒素引咳法Capsaicin cough inducing methodAITC 引咳法AITC cough inducing method试剂用量少,较易操作Low dosage of reagents,easier to handle对肺部有损伤,咳嗽反应性差异较大Damage to the lungs and wide variation in cough responsiveness雾化吸入Nebulized inhalation较为便捷More convenient真正药物吸入量难以控制,刺激局部,引起咳嗽混淆动作Amount of real drug inhalation is difficult to control,irritating the local area and causing confusing coughing movements局部给药Topical drug delivery较少引起混淆动作;控制咳嗽刺激物作用部位;确保咳嗽刺激物用量的准确性Less likely to cause confusion;control the site of action of the cough stimulant;ensure the accuracy of the cough stimulant dosage耗费时间久、需要麻醉、操作技术复杂、动物死亡率相对偏高Time consuming,requires anesthesia,complex operation techniques,and relatively high animal mortality具体分类及优缺点同柠檬酸引咳法The specific classification and advantages and disadvantages are the same as citric acid induced cough method/诱咳效力弱于辣椒素Weaker cough inducing effect than capsaicin初步筛选镇咳药物Initial screening of cough suppressants咳嗽反射机制、药物干预及新药开发等研究,可 激 活 C 纤 维 上 的TRPV1 受体和 A 传入纤维末端Research on cough reflex mechanisms,pharmacological interventions and new drug development activates TRPV1 receptors on C-fibers and A afferent fiber ends咳嗽反射机制、药物干预及新药开发等研究,可 激 活 C 纤 维 上 的TRPV1 受体Studies on cough reflex mechanisms,pharmacological interventions and new drug development that activate TRPV1 receptors on C-fibers咳嗽反射机制,可特异性激活迷走 C 纤维上的 TRPA1 受体Cough reflex mechanism that specifically activates TRPA1 receptors on vagal C fibers电刺激法Electrical stimulation method/刺激频率和强度可以精确定量比较Stimulation frequency and intensity can be compared precisely and quantitatively需麻醉,动物损伤大,操作复杂Requires anesthesia,animal damage,complex operation分析药物是中枢镇咳还是末梢止咳Analysis of whether the drug is a central or peripheral cough suppressant101中国比较医学杂志 2023 年 9 月第 33 卷第 9 期 Chin J Comp Med,September 2023,Vol.33,No.9表 2 疾病咳嗽动物模型比较Table 2 Comparison of animal models of disease cough疾病Diseases造模方法Methods模型特点Features存在问题Problems感染后咳嗽Post-infectious cough呼吸道合胞病毒感染法Respiratory syncytial virus infection method模拟亚急性病程,气道炎症和气道高反应性Simulates a subacute course with airway inflammation and airway hyperresponsiveness/脂多糖感染法Lipopolysaccharide infection method具有咳嗽敏感性增高、呼吸道黏膜损伤、气道炎症、氧化应激的特点Characterized by increased cough sensitivity,respiratory mucosal damage,airway inflammation,and oxidative stress气管内滴注操作较为复杂,小 鼠 死 亡 率 高Intratracheal drip is more complex and has high mortality in mice上述两种方法联合烟熏Above two methods combined with fuming增强气道高反应性及咳嗽高敏感性Enhanced airway hyperresponsiveness and cough hypersensitivity/变应性咳嗽Atopic cough卵蛋白致敏引咳法Ovalbumin sensitization method to induce cough干咳(支气管扩张剂处理有效)、无喘息、全气道嗜酸粒细胞炎症、气道反应性轻度升高Dry cough(effective with bronchodilator treatment),no wheezing,whole airway eosinophilic inflammation,mildly elevated airway responsiveness与我国临床变应性咳嗽诊断标准不同Different diagnostic criteria from our clinical allergic cough卵蛋白致敏联合环磷酰胺加强免疫抑制Enhanced immunosuppression by ovalbumin sensitization combined with cyclophosphamide气道收缩反应随乙酰甲胆碱浓度增高而平缓上升Airway constriction response rises gently with increasing acetylcholine concentration动物死亡率较高、咳嗽反应均一性较差Higher animal mortality and poorer uniformity of cough response咳嗽变异性哮喘Cough variant asthma卵蛋白致敏引咳法Ovalbumin sensitization method to induce cough干咳(支气管扩张剂处理有效)、无喘息、组织病理示全气道嗜酸粒细胞炎症、气道反应性轻度升高Dry cough(effective with bronchodilator treatment),no wheezing,histopathology shows total airway eosinophilic inflammation,mildly elevated airway reactivity/卵蛋白致敏联合烟熏Ovalbumin sensitization combined with fumigation咳嗽敏感性增高、气道阻力平缓上升、肺组织嗜酸性粒细胞浸润增多;更符合 CVA 气道高反应性较典型哮喘略低的重要特征Increased cough sensitivity,gentle rise in airway resistance,and increased eosinophil infiltration of lung tissue;more consistent with the important features of CVA airway hyperresponsiveness being slightly lower than typical asthma/上气道咳嗽综合征Upper airway cough syndrome膨胀海绵填塞鼻腔联合香烟雾化Expansion sponge stuffing of the nasal cavity combined with cigarette nebulization避开致敏,将鼻窦疾病与气道炎症等因素结合起来Avoiding sensitization and combining sinus disease with airway inflammation and other factors病因复杂,单一造模不能完全模拟该病Etiology is complex and a single modeling cannot fully simulate the disease嗜酸粒细胞性支气管炎Eosinophilic bronchitis多粘菌素 B 刺激Polymyxin B stimulation气管及支气管粘膜有大量嗜酸性粒细胞浸润、肺泡结构及气道反应性正常、咳嗽敏感性增高Massive eosinophil infiltration in tracheal and bronchial mucosa,normal alveolar structure and airway responsiveness,increased cough sensitivity多粘菌素 B 仅是肥大细胞、嗜碱性粒细胞释放组胺的刺激剂,并不是公认的抗原刺激剂Polymyxin B is only a stimulator of histamine release from mast cells and basophils and is not a recognized antigenic stimulant201中国比较医学杂志 2023 年 9 月第 33 卷第 9 期 Chin J Comp Med,September 2023,Vol.33,No.9续表2疾病Diseases造模方法Methods模型特点Features存在问题Problems卵蛋白激发Ovalbumin stimulation具有慢性咳嗽、气道嗜酸性粒细胞浸润、对类固醇治疗有反应、无气道高反应性的基本特征Essential features of chronic cough,airway eosinophil infiltration,response to steroid therapy,and absence of airway hyperresponsiveness/胃食管反流性咳嗽Gastroesophageal reflux-related chronic cough手术造模Surgical moulding/手 术 复 杂,术 后 死 亡率高Complex surgery and high postoperative mortality反复食管滴注盐酸Repeated esophageal drips of hydrochloric acid食管下段与食管炎模型类似,气管、支气管组织有炎症细胞浸润,可引起豚鼠气道神经源性炎症Lower esophagus is similar to the esophagitis model with inflammatory cell infiltration in tracheal and bronchial tissues,which can cause neurogenic inflammation in the guinea pig airway/其 他 咳 嗽 高 敏 综合征Cough hypersensitivity syndrome空气污染物暴露Air pollutant exposure咳嗽敏感性增高,非过敏性嗜酸性炎症Increased cough sensitivity,non-allergic eosinophilic inflammation/香烟烟雾诱导Cigarette smoke induction咳嗽敏感度增加,非特异性呼吸道炎症Increased cough sensitivity,non-specific respiratory inflammation/经反射所构成,受刺激后,迷走神经传导信号至位于延髓的咳嗽中枢,中枢整合后再下传至相应的运动神经,进而引发。与咳嗽反射密切相关的气道传入神经为 A 纤维(有髓鞘)和 C 纤维(无髓鞘),其末梢突触分别主要感受机械刺激及化学刺激。根据以上神经反射机制,单纯咳嗽模型的制备主要有机械刺激、化学刺激、电刺激、抗原致敏引咳等方法。2.1 机械刺激法 机械刺激法是指通过刺激有髓鞘的迷走 A 传入纤维引起单纯咳嗽,基本操作方法如下:将细长状纤维如聚乙烯管、兔胡须等置入动物喉部或者气道内,反复操作 2 3 次,可导致其剧烈、快速的咳嗽;或者用异物直接放入气管套管内操作来引发咳嗽。Poliacek 等8使用软聚乙烯导管机械刺激麻醉猫的胸腔内气道,导管在气管内周期性来回移动68 次,持续 10 s,以引起反复咳嗽,该法所有刺激都由一名实验者进行,以尽量保证刺激强度的可比性。机械刺激法简便易行,但需在麻醉状态下进行,尽管由同一名实验者进行,仍不能保证刺激强度一致,难以定量比较。Varechova 等9和 Foucaud 等10使用改良仪器来进行气管机械刺激引咳,具体如下:在麻醉兔气管切开后,置入硅橡胶半刚性导管,穿过气管导管的侧端口直至引发咳嗽(一般距离导管出口 3 4 cm)。该导管由一个小型电机驱动,该电机旋转导管(每秒 60 个周期)并在短时间(刺激时间设置为150 ms)内将其尖端摩擦到气道粘膜上,而来自发动机的电信号可以作为准确识别刺激时间过程的标记。此种方法虽然较上述方法稍繁琐,但是可以控制强度,从而能够定量比较。2.2 化学刺激法 化学刺激法是指采用化学物质(咳嗽刺激剂)刺激呼吸系统引起咳嗽,该法快速简便易行、对样本伤害小、引咳时可保证样本处于清醒状态,因此常用,其药物多选用氨水、柠檬酸、辣椒素、异硫氰酸烯丙酯(allylisothiocyanate,AITC)等。氨水引咳法是常用的化学刺激法,多采用小鼠进行造模。梁婷等11采用氨水诱咳造模法如下:以雄性 ICR 小鼠为例,在倒扣烧杯(500 mL)中放入一个棉球,并将300 L 25%的氨水滴入该棉球中,待1 min 饱和后再将小鼠放入该烧杯中 45 s,取出后置于另一烧杯中,对小鼠咳嗽情况进行记录,观察典型咳嗽动作(腹肌收缩,有咳声),记录咳嗽潜伏期(从取出开始到第 1 次咳嗽的时间)及 5 min 内咳嗽次数。结果显示模型小鼠咳嗽次数增加,咳嗽潜伏期缩短,提示造模成功。氨水引咳法中,氨水体积浓度常在 13%25%之间,建议在开展正式实验前进行咳嗽敏感性筛选的预实验以确定适合的激动301中国比较医学杂志 2023 年 9 月第 33 卷第 9 期 Chin J Comp Med,September 2023,Vol.33,No.9剂浓度。使用倒扣烧杯进行氨水引咳为常用的简便诱咳方法之一,但是烧杯容量、氨水用量、饱和时间等尚无统一标准,且氨水挥发量受温度、时间影响。而多功能诱咳引喘仪可以控制药物定时、定量、定浓度,保持物质原有性质,相较于使用烧杯进行氨水诱咳法更易定量控制,故近年来应用较多12。氨水诱咳用量小,较易操作,但吸入氨水对肺部有损伤,且氨水诱发小鼠咳嗽反应性差异较大,故氨水诱咳制备模型多用于初步筛选镇咳药物。近 年 来 瞬 时 受 体 电 位(transient receptor potential,TRP)家族在咳嗽发生机制中的作用逐渐受到关注。TRP 通道属于非选择性的阳离子通道蛋白,受环境温度、pH、化学物质、渗透压等刺激后,细胞内外阳离子通透性变化,进而调节细胞功能。气道中分布众多感觉神经元上皮,其可表达多种TRP 家族成员,被各种外源或内源性物质激活后,产生各种神经肽,继而出现局部组织血管扩张和通透性增加、炎性细胞渗出、黏膜出血水肿等神经源性炎症现象,导致咳嗽13-15。在 TRP 家族中,瞬时感受器电位香草酸受体 1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)和 瞬 时 受 体 电 位 锚 蛋 白 1(transient receptor potential ankyrin 1,TRPA1)近年来研究较为深入,TRPV1 为非选择性阳离子通道,首先被证实可介导豚鼠咳嗽反射,而 TRPA1 为非选择性钙离子通道,与 TRPV1 相类似,二者均广泛分布于感觉神经元细胞,因此其激动剂多用于诱咳及评价咳嗽敏感性。常用激动剂包括柠檬酸、辣椒素、AITC 等6,16。柠檬酸通过刺激 C 纤维上的 TRPV1 受体和 A传入纤维末端致咳,造模动物多选择豚鼠或小鼠,其咳嗽模型主要用于咳嗽反射机制、药物干预及新药开发等研究,给药途径主要包括雾化吸入和局部注射。张童洋子等17采用雾化吸入造模具体操作如下:将豚鼠置于双室体描箱中,头部和躯体分别在体描箱的头室和体室内,超声雾化器与体描箱的头室相连,清醒豚鼠每天雾化吸入 0.4 mol/L 柠檬酸 2 次,每次持续 3 min,共 15 d。造模结束后对模型豚鼠进行咳嗽反应性检测,计算从吸入激发溶液到停止吸入后 1 min,共 3 min 内豚鼠出现的咳嗽次数。结果显示模型组豚鼠激发后咳嗽次数增加,咳嗽反应性增强,提示造模成功。柠檬酸常用浓度为0.05 0.80 mol/L,雾化时间可根据具体情况及预实验结果适当延长,有学者认为,较长时间(3 周)的柠檬酸反复刺激,可以更好的模拟人体慢性咳嗽的疾病过程18。局部注射参照 Tanaka 等19采用的方法,具体操作如下:腹腔注射麻醉豚鼠后,分离气管,将聚乙烯导管(内径 0.4 mm,长 13 cm)插入气管至第 5-6 气管软骨,将导管尖端放置在喉下,距离喉部约 10 mm 处固定(导管用线固定于第 6 气管软骨),导管另一端从背部皮下引出,注射 0.4 mol/L 柠檬酸 20 L(注射 10 次,每次间隔 30 s)以制备豚鼠模型,模型豚鼠咳嗽次数增加,造模成功。柠檬酸雾化造模较为便捷,但是动物真正药物吸入量难以控制,且通过雾化给药常对局部造成刺激,引起咳嗽之外的混淆动作,由于 TRPV1 受体分布于全身,柠檬酸雾化易引起豚鼠全身颤抖,故需要探索出提高气道利用率的方法。相较于此,局部给药有以下优势:(1)制备过程中较少引起打喷嚏等混淆动作,有利于确定咳嗽症状;(2)可改变内置导管所在处进而来控制咳嗽刺激物刺激的部位;(3)可以确保咳嗽刺激物用量的可比性和准确性。但是局部给药仍存在耗费时间久、需要麻醉、操作技术复杂、动物死亡率相对偏高的特点,因此临床上雾化造模更为常用。辣椒素通过刺激 C 纤维上的 TRPV1 受体来引发咳嗽,造模动物以豚鼠或小鼠为主。辣椒素的研究用途与柠檬酸类似,多用于研究咳嗽反射机制、药物开发等,其给药途径与柠檬酸类似。以雾化为例,采用豚鼠造模具体操作如下:将 Hartley 豚鼠置于透明塑料广口瓶中,用超声雾化器将动物暴露于辣椒素水溶液(0.2 mmol/L)中 15 s,然后记录咳嗽次数和咳嗽潜伏期,共 3 min,造模成功入选标准为:10 s咳嗽次数50 s(3 min 内)和 10 s咳嗽潜伏期10 次,并能重复发生的豚鼠。赖克方6利用上述造模方法复制的豚鼠 AC 模型,在激发后 72 h,具有干咳(支气管扩张剂处理有效)、无喘息、组织病理示全气道嗜酸粒细胞炎症、气道反应性轻度升高的特点,据此得出该模型可以模拟人类 CVA 模型。然而 AC 患者中心气道粘膜活检可见嗜酸性粒细胞浸润,无外周气道嗜酸性粒细胞浸润,后者是 EB 的特征。该模型对支气管扩张剂反应性好、出现全气道嗜酸性炎症及气道反应性轻度升高,与我国临床 AC 诊断标准有较大出入,需进一步完善。为了减轻过度致敏状态,多使用环磷酰胺注射加强免疫抑制或减少 OVA 用量,王谦等38比较环磷酰胺+高剂量 OVA 及低剂量 OVA 两种主动免疫过程,分析咳嗽频次及气道激发情况,发现后者气道收缩反应更为强烈,乙酰甲胆碱浓度阈值较低,更偏向于哮喘模型,而前者随着乙酰甲胆碱浓度增高而平缓上升,可很好的模拟咳嗽敏感性增高状态,可以得出,加入免疫抑制剂的模型较单纯减少主动免疫 OVA 剂量模型更优,但仍存在豚鼠死亡率较高、咳嗽反应均一性较差等问题,之后研究可以考虑在加用免疫抑制剂的同时控制 OVA 用量,以期降低豚鼠死亡率,建立更符合临床 AC 特征的动物模型。3.3 咳嗽变异性哮喘模型(CVA)CVA 是一种以咳嗽为主要表现的特殊类型哮喘,不伴有明显喘息胸闷等典型哮喘症状,气道炎症主要以嗜酸性粒细胞为主,具有气道高反应性,是慢性咳嗽最常见病因,约占 1/3。CVA 的发病原因与遗传因素和环境理化因素相关,接触各种过敏原对于本病的发生有一定的促进作用。与典型哮喘相似,其发病机制与气道高反应性、神经机制、多种细胞参与的气 道 慢 性 炎 症 和 免 疫 球 蛋 白 E(immunoglobulin E,IgE)介导的变态反应有关。但是 CVA 的咳嗽敏感性较高、气道反应性较典型哮喘低、喘鸣阈值较哮喘高,是其有别于典型哮喘的机制特点6。常用动物包括豚鼠、小鼠、大鼠。既往 CVA 的造模方法多参考 AC 造模37。吕天宜等39在前人基础上,用 OVA 联合烟熏建立相似度更高的豚鼠 CVA