基于AMPK_mTOR通路介导的自噬探讨温补固肾方对糖尿病肾纤维化的影响.pdf

2023 年 10 月第 40 卷第 10 期Vol.40，No.10，Oct.2023中医药信息（Information on Traditional Chinese Medicine）http：/ 驻马店 463000；2.郑州市中心医院，河南 郑州 450001）【摘要】目的：探究温补固肾方调控AMPK/mTOR通路介导的自噬途径对糖尿病肾纤维化的保护机制。方法：雄性SPF级SD大鼠100只，除对照组20只外，均采用腹腔注射链脲佐菌素（60 mg/kg）构建糖尿病肾病模型。其中60只大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病组、达格列净组（1.0 mg/kg）、温补固肾方低、中、高剂量组（0.92、1.84、3.68 g/kg），每组各10只。给予相应药物灌胃12 周后，检测各组大鼠肾功能生化指标；HE和PAS染色观察肾组织病理形态变化；免疫组化法检测肾组织SMA，ECadherin表达；电镜观察自噬小体形成；Western blot检测 LC3/LC3、pAMPK/AMPK 和 pmTOR/mTOR 表达。剩余40只大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病组、温补固肾方高剂量组（3.68 g/kg）、温补固肾方高剂量组+AMPK抑制剂组（20 mg/kg），每组各10只。给予相应药物12 周后，检测大鼠肾功能生化指标，电镜观察肾组织病理形态，Masson染色观察肾纤维化程度，Western blot检测LC3/LC3及AMPK/mTOR通路蛋白表达。结果：与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠肾功能损伤严重，并伴有明显的病理损伤，肾组织SMA表达增加，ECadherin表达降低（P 0.01），自噬小体数量减少（P 0.01），LC3/LC3及pAMPK/AMPK比值降低，pmTOR/mTOR比值增加（P 0.01）。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组大鼠肾功能及组织病理性损伤均有不同程度改善，SMA表达降低，ECadherin表达增加（P 0.05，P 0.01），自噬小体数量增加，LC3/LC3及 pAMPK/AMPK 比值增加，pmTOR/mTOR比值降低（P 0.05，P 0.01）。与温补固肾方高剂量组比较，AMPK抑制剂能够逆转温补固肾方糖尿病肾病大鼠的治疗作用，抑制上述相关指标变化。结论：温补固肾方能够激活AMPK/mTOR通路介导的自噬改善糖尿病大鼠肾纤维化。【关键词】糖尿病肾病；温补固肾方；纤维化；自噬；AMPK/mTOR通路【引用格式】禹静，刘续春，李振华.基于AMPK/mTOR通路介导的自噬探讨温补固肾方对糖尿病肾纤维化的影响 J.中医药信息，2023，40（10）：1421，26.YU J，LIU X C，LI Z H.Exploration of the effect of Wenbu Gushen Formula on renal fibrosis in diabetes based on AMPK/mTOR pathway mediated autophagy J.Information on TCM，2023，40（10）：1421，26.糖尿病肾病是慢性肾脏疾病以及终末期肾衰竭的主要病因，也是糖尿病重要的微血管并发症和主要的死亡病因1。既往研究发现，全球大约有 30%40%的糖尿病患者会伴随疾病的迁延和进展成为糖尿病肾病，伴有终末期肾病的患者五年生存率低于 20%2。因此，延缓或阻止糖尿病肾病进展对于改善患者生存DOI 10.19656/ki.1002-2406.20231003基金项目：河南省中医药科学研究专项课题项目（2019zY1018）第一作者简介：禹静（1987），女，主管技师，主要从事医学检验研究工作。*通信作者简介：李振华（1984），女，副主任医师，副教授，主要从事医学检验及中药药理学研究工作。142023 年 10 月第 40 卷第 10 期Vol.40，No.10，Oct.2023中医药信息（Information on Traditional Chinese Medicine）http：/ 激活后能够激活 TSC1/2蛋白，进而抑制mTOR活化，从而诱导细胞自噬形成7。因此，本研究拟通过构建糖尿病肾病大鼠模型，探究温补固肾方能否通过调控AMPK/mTOR通路介导的细胞自噬，抑制糖尿病肾纤维化，并最终改善糖肾损伤。1材料与方法1.1材料1.1.1动物SPF级雄性SD大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限 公 司，生 产 许 可 证 号：SCXK（沪）20210002，100只，体质量180210 g。大鼠适应性喂养7 d，期间正常饮食、饮水，昼夜 12 h/12 h交替光照，温度（25 2），相对湿度45%55%，动物实验经我院医学伦理委员会批准（批准号：20191002），符合3R原则。1.1.2药物与试剂温补固肾方制剂由广东一方制药有限公司提供，组方：党参 0.1 g，山茱萸 0.12 g，芡实 0.2 g，枸杞子0.1 g，覆盆子0.1 g，菟丝子 0.1 g，淫羊藿 0.1 g，益智仁 0.1 g；达格列净片（AstraZeneca Pharmaceuticals LP，规格：10 mg/片，国药准字 J20170040）；AMPK 抑制剂Compound C（美国Selleck公司，货号：S7306）；苏木素伊红（hematoxylineosin，HE）染色试剂盒、PAS染色试剂盒、Masson染色试剂盒、蛋白质浓度测定试剂盒、发光液、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗（上海碧云天生物 技 术 公 司，货 号：C0105S、T4106、T4104、P0011、P0018 FS、A0409、A0413）；免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：SP9001）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、4%多聚甲醛、2.5%戊二醛固定液（北京索莱宝科技有限公司，货号：S8050、20151211、P1126）；SMA 抗体、ECadherin 抗体、LC3 抗体、AMPK 抗体、pAMPK 抗体、mTOR 抗体、pmTOR 抗 体（英 国 Abcam 公 司，货 号：ab5694、ab76055、ab192890、ab271188、ab131357、ab134903、ab137133）。1.1.3仪器血糖仪（瑞士Roche公司，型号：卓越精采型）；多功能酶标仪（长春乐镤科技有限公司，型号：LP5117）；荧光倒置显微镜（日本/奥林巴斯 Olympus，型号：CKX53）；高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司，型号：H318KR）；凝胶成像系统（美国 BioRad伯乐公司，型号：Gel Doc XR）。1.2方法1.2.1糖尿病肾病模型构建、分组及干预SD大鼠腹腔一次性注射STZ（60 mg/kg）构建糖尿病肾病模型。判定标准：STZ注射后 3 d，血糖值均 16.7 mmol/L，且尿液蛋白呈现阳性者，被确认为模型构建成功。雄性SPF级SD大鼠100只，除对照组20只外，均采用腹腔注射链脲佐菌素（60 mg/kg）构建糖尿病肾病模型。其中60只大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病组、达格列净组（1.0 mg/kg）、温补固肾方低、中、高剂量组（0.92、1.84、3.68 g/kg），每组各10只。除对照组外，其余各组大鼠均采用STZ诱导糖尿病肾病模型。温补固肾方低剂量组剂量为 0.92 g/kg，中、高剂量组分别为低剂量组的2倍和4倍。达格列净组给予1.0 mg/kg剂量达格列净灌胃。对照组及糖尿病肾病组大鼠给予等量生理盐水灌胃。以上各组大鼠1次/d，连续灌胃12 周。剩余40只大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病组、温补固肾方高剂量组（3.68 g/kg）、温补固肾方高剂量组+AMPK 抑制剂组（20 mg/kg），每组各10只。除对照组外，其余各组大鼠均采用STZ诱导糖尿病肾病模型。温补固肾方高剂量组大鼠给予3.68 g/kg剂量灌胃。温补固肾方高剂量组+AMPK抑制剂组大鼠给予3.68 g/kg温补固肾方灌胃，同时予以腹腔注射AMPK抑制剂Compound C 20 mg/kg8。对照组及糖尿病肾病组大鼠予以腹腔注射等量生理盐水。以上各组大鼠均为1次/d，干预12周。1.2.2肾功能生化指标检测各组大鼠分别干预12周后，每组随机取6只大鼠152023 年 10 月第 40 卷第 10 期Vol.40，No.10，Oct.2023中医药信息（Information on Traditional Chinese Medicine）http：/ h、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、组织石蜡包埋、切片35 m，行HE、PAS及Masson染色，显微镜下观察心肌组织形态学变化及心肌纤维化程度。1.2.4免疫组化检测SMA和ECadherin表达每组随机取6只大鼠进行肾组织切片，经内源性过氧化物酶阻断剂阻断、抗原修复、组织封闭后，滴加SMA抗体及ECadherin抗体（1 500），孵育过夜，对应二抗孵育2 h，滴加DAB显色液，苏木素复染，于400倍显微镜下观察肾组织SMA及ECadherin着色情况，并通过 ImageJ 软件计算肾组织 SMA 及ECadherin阳性细胞数量，以胞浆或胞膜呈棕色颗粒为阳性表达。免疫组化阳性细胞表达率（%）=免疫组化阳性细胞数量/细胞总数 100%1.2.5电镜观察自噬小体及肾组织病理变化将肾组织修剪成大小为1 mm 1 mm 1 mm组织块，在1%四氧化锇中固定3 h。采用分级乙醇和丙酮梯度脱水后，将样品嵌入Spurr树脂中，并切成70 nm厚的薄片，最后采用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并用10 000倍透射电子显微镜观察自噬小体形态与数量。2.5%戊二醛固定肾组织，制备切片，电镜下观察肾组织病理形态变化。1.2.6Western blot检测肾组织LC3、pAMPK、pmTOR表达给药12周后，立即将大鼠处死，剪取大鼠肾组织并提取总蛋白，按照1 5质量与体积比加入细胞裂解液，于4 条件下裂解40 min；BCA法测定各组大鼠肾组织蛋白质浓度；蛋白上样（按照每孔上样量30 g计算得出上样体积）；凝胶电泳；湿转法转膜；5%BSA室温封闭2 h；分别加pAMPK抗体（1 1 000）、AMPK抗体（1 1 000）、pmTOR抗体（1 500）、mTOR抗体（1 1 000）、LC3抗体（1 1 000）及actin抗体（1 2000），4 孵育过夜；加对应的山羊抗兔二抗或者山羊抗鼠二抗（1 5 000），室温孵育12 h；TBST洗涤3次，每次5 min，滴加显影液，显影并拍照。通过Image J软件定量分析各组蛋白相对表达量。1.3统计学方法采用SPSS20.0统计软件进行数据分析。所有实验结果以均数 标准差（x s）表示，多组间比较采用多因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P 0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1各组大鼠肾功能情况比较与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠FBG、BUN、Scr和24 hUA均显著增加（P 0.01）。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组和达格列净组大鼠 FBG、BUN、Scr 和 24 hUA 均 显 著 降 低（P 0.05，P 0.01）。见表1。2.2各组大鼠组织病理学情况比较与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠肾小球体积增大，间质增宽，且肾小管上皮细胞出现空泡变性，可见有部分紫红色糖原沉积，呈典型的糖尿病肾损伤。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组和达格列净组大鼠肾小球体积增大，间质增宽以及肾小管上皮细胞空泡变性程度均有不同程度的减轻，且紫红色糖原沉积明显降低。见图1。2.3各组大鼠肾纤维化情况比较与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠SMA表达显著升高，ECadherin表达显著降低（P 0.01）。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组和达格列净组大鼠SMA表达显著降低，ECadherin表达显著升高（P 0.01）。见图2。2.4各组大鼠肾组织细胞自噬水平情况比较透射电镜观察各组大鼠肾组织自噬小体数量。结果显示，与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠自噬小体数表1各组大鼠肾功能生化指标比较（x s）组别对照组糖尿病肾病组达格列净组温补固肾方低剂量组温补固肾方中剂量组温补固肾方高剂量组n666666剂量/（g/kg）0.0010.921.843.68FBG/（mmol/L）5.28 0.2528.20 4.05*10.59 2.42#23.66 1.99#18.05 2.29#16.23 2.41#BUN/（mol/L）6.47 1.1626.75 4.33*8.95 1.54#17.94 4.30#16.53 1.96#12.63 2.42#Scr/（mol/L）45.07 7.05101.16 15.82*49.98 7.59#76.69 12.15#69.45 11.19#52.23 11.05#24 h-UA/mg5.49 1.3544.13 7.39*11.12 2.31#35.74 4.77#30.43 4.45#28.65 5.74#注：与对照组比较，*P 0.01；与糖尿病肾病组比较，#P 0.05，#P 0.01。162023 年 10 月第 40 卷第 10 期Vol.40，No.10，Oct.2023中医药信息（Information on Traditional Chinese Medicine）http：/ blot检测各组大鼠肾组织自噬标志性蛋白LC3表达。结果显示，与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠肾组织LC3/LC3比值显著降低（P 0.01）。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组和达格列净组大鼠肾组织 LC3/LC3比值显著增加（P 0.05或P 0.01）。见图3。图1各组大鼠肾组织病理学图（400）注：A为免疫组化检测SMA阳性表达（ICH，400）；B为免疫组化检测ECadherin阳性表达（ICH，400）。与对照组比较，*P 0.01；与糖尿病肾病组比较，#P 0.01。图2各组大鼠肾组织SMA和ECadherin表达172023 年 10 月第 40 卷第 10 期Vol.40，No.10，Oct.2023中医药信息（Information on Traditional Chinese Medicine）http：/ pAMPK/AMPK 比 值 降 低，pmTOR/mTOR 比 值 升 高（P 0.01）。与糖尿病肾病组组比较，温补固肾方各治疗组和达格列净组大鼠 pAMPK/AMPK 比值升高，pmTOR/mTOR比值降低（P 0.05或P 0.01）。见图4。注：A为透射观察自噬小体（15 000）；B为Western blot检测自噬标志性蛋白LC3表达。与对照组比较，*P 0.01；与糖尿病肾病组比较，#P 0.05，#P 0.01。图3各组大鼠自噬水平情况比较注：与对照组比较，*P 0.01；与糖尿病肾病组比较，#P 0.05，#P 0.01。图4各组大鼠肾组织AMPK/mTOR通路蛋白表达182023 年 10 月第 40 卷第 10 期Vol.40，No.10，Oct.2023中医药信息（Information on Traditional Chinese Medicine）http：/ 0.01）。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方高剂量组大鼠自噬标志性蛋白 LC3/LC3比值显著升高，pAMPK/AMPK 比值升高，pmTOR/mTOR比值降低（P 0.01）。与温补固肾方高剂量组比较，温补固肾方高剂量组+AMPK抑制剂组大鼠自噬标志性蛋白LC3/LC3比值显著降低，pAMPK/AMPK 比值降低，pmTOR/mTOR 比值升高（P 0.01）。见图5和图6。注：与对照组比较，*P 0.01；与糖尿病肾病组比较，#P 0.01；与温补固肾方高剂量组比较，P 0.01。图6AMPK抑制剂对AMPK/mTOR通路介导的细胞自噬的影响图5AMPK抑制剂对糖尿病肾病大鼠肾组织病理形态及纤维化的影响192023 年 10 月第 40 卷第 10 期Vol.40，No.10，Oct.2023中医药信息（Information on Traditional Chinese Medicine）http：/ 表达增加，ECadherin表达降低，肾组织纤维化程度明显加重。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组大鼠 FBG、BUN、Scr、24 hUA水平显著降低，肾损伤明显降低，SMA表达降低，ECadherin表达增加，表明温补固肾方具有抗糖尿病肾纤维化作用。但是，目前有关温补固肾方抗纤维化的作用机制尚不明晰。自噬是一种高度保守的溶酶体降解途径，是维持细胞内稳态的重要调节机制。既往研究发现，糖尿病肾病中持续性的高糖能够抑制自噬相关蛋白（LC3、Beclin1）表达，降低自噬水平，阻碍细胞器中积累产生的受损蛋白以及细胞毒性产物的清除，从而导致糖尿病肾病肾损伤以及肾实质细胞功能障碍9-10。激活细胞自噬可以显著抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤，改善细胞功能11。以上研究表明，自噬水平的不足可能是导致糖尿病肾病进展的重要机制。GUO等12研究发现，在STZ诱导的糖尿病肾病大鼠肾小管间质纤维化中，伴有明显的自噬抑制，提示自噬可能是糖尿病肾纤维化的重要调节机制。另外，CAO等13研究证实，激活细胞自噬能够抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞间质转化以及糖尿病肾病大鼠肾小管间质纤维化。本研究结果显示，与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠自噬小体数量明显减少，且自噬标志性蛋白LC3表达显著降低。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组大鼠自噬小体数量均显著增加，且自噬标志性蛋白LC3表达显著升高，表明温补固肾方可以通过诱导细胞自噬，抑制糖尿病大鼠肾纤维化。细胞自噬受到多种诱因和基因调控的影响，如mTOR、AMPK以及沉默信息调节剂T1等，以上信号通路与糖尿病肾病的发生、发展密切相关。高糖环境下上述信号通路的激活/抑制是诱导/抑制自噬活性的关键，能够加重/缓解糖尿病肾损伤加重14-16。AMPK和mTOR是自噬启动环节重要的调节因子，其构成的AMPK/mTOR信号通路是调控细胞自噬形成的重要通路之一17。研究发现，mTOR可以形成两种不同的复合物，即mTORC1和mTORC2。在糖尿病肾病大鼠中能够观察到mTORC1信 号 通 路 被 显 著 激 活。在 营 养 丰 富 的 条 件 下，mTORC1能够通过磷酸化ULK1和ATG13，从而抑制细胞自噬，被认为是自噬的负调节剂18。与mTOR通路相反，AMPK是自噬的正调节剂。研究发现，在糖尿病肾病动物模型中 AMPK 磷酸化水平被显著抑制。另外，AMPK能够抑制mTOR通路的活化，降低mTORC1对ULK1磷酸化的抑制作用，提高ULK1活性，从而促进自噬启动环节19。本研究结果显示，与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠 pAMPK/AMPK 比值显著降低，pmTOR/mTOR 比值显著升高。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组大鼠pAMPK/AMPK比值显著升高，pmTOR/mTOR比值显著降低。以上研究结果初步表明，温补固肾方能够通过调控AMPK/mTOR信号通路介导的细胞自噬抑制糖尿病大鼠肾纤维化。张哲等20研究发现，利拉鲁肽能够通过激活 AMPK/mTOR信号通路，增加自噬水平，从而减轻糖尿病心肌病大鼠心肌炎症和氧化应激损伤，而给予AMPK抑制剂 Compound C 可以逆转利拉鲁肽对 AMPK/mTOR 通路的作用，抑制自噬，加重糖尿病心肌病心肌炎症和氧化应激损伤。为进一步明确AMPK/mTOR信号通路介导的细胞自噬在温补固肾方治疗糖尿病肾纤维化中的作用。本实验通过对温补固肾方干预组大鼠给予AMPK抑制剂 Compound C。结果显示，AMPK抑制剂能够逆转温补固肾方对糖尿病肾纤维化的作用，主要表现为pAMPK/AMPK比值降低，pmTOR/mTOR比值升高，LC3/LC3比值降低，胶原沉积及肾损伤加重。4结论温补固肾方能够激活AMPK/mTOR通路介导的自噬改善糖尿病大鼠肾纤维化。本研究结果初步阐明了温补固肾方治疗糖尿病肾纤维化的作用及调控机制，为其治疗糖尿病肾纤维化提供了可靠的实验依据。【参考文献】1SAMSU N.Diabetic nephropathy：challenges in pathogenesis，diagnosis，and treatment J.Biomed Res Int，2021，2021：1497449.2ZHANG X X，KONG J，YUN K.Prevalence of diabetic nephropathy among patients with type 2 diabetes mellitus in China：a metaanalysis of observational studies J.J Diabetes Res，2020，2020：2315607.3ZHUANG L，GE X，HU X，et al.miR543 regulates high glucoseinduced fibrosis and autophagy in diabetic nephropathy by targeting TSPAN8 J.BMC Nephrol，2022，23（1）：89.4禹静，刘续春，李振华.基于网络药理学探究温补固肾方治疗糖尿病肾病的作用机制及实验验证J.中医药信息，2022，39（12）：2734.202023 年 10 月第 40 卷第 10 期Vol.40，No.10，Oct.2023中医药信息（Information on Traditional Chinese Medicine）http：/ J.中华内分泌代谢杂志，2022，38（11）：983990.6GLICK D，BARTH S，MACLEOD K F.Autophagy：cellular and molecular mechanisms J.J Pathol，2010，221（1）：312.7GUO H，OUYANG Y，YIN H，et al.Induction of autophagy via the ROSdependent AMPKmTOR pathway protects copperinduced spermatogenesis disorder J.Redox Biol，2022，49：102227.8张晓蕾，张凯，秦永亭，等.木犀草素调控AMPK/NLRP3轴介导的细胞焦亡对病毒性心肌炎的保护作用 J.中国病原生物学杂志，2022，17（5）：514519.9CUI J，BAI X，CHEN X.Autophagy and diabetic nephropathyJ.Adv Exp Med Biol，2020，1207：487494.10 LI X Z，JIANG H，XU L，et al.Sarsasapogenin restores podocyte autophagy in diabetic nephropathy by targeting GSK3 signaling pathway J.Biochem Pharmacol，2021，192：114675.11 WANG Y，CHANG J，WANG Z Q，et al.SIRT3 promotes the autophagy of HK2 human proximal tubular epithelial cells via the inhibition of Notch1/Hes1 signaling J.Mol Med Rep，2021，24（3）：634.12 GUO L，TAN K，LUO Q，et al.Dihydromyricetin promotes autophagy and attenuates renal interstitial fibrosis by regulating miR1555p/PTEN signaling in diabetic nephropathy J.Bosn J Basic Med Sci，2020，20（3）：372380.13 CAO T，XU R，XU Y，et al.The protective effect of Cordycepin on diabetic nephropathy through autophagy induction in vivo and in vitro J.Int Urol Nephrol，2019，51（10）：18831892.14 WANG Y，ZHANG H.Regulation of autophagy by mTOR signaling pathway J.Adv Exp Med Biol，2019，1206：6783.15 LI Y，CHEN Y.AMPK and autophagy J.Adv Exp Med Biol，2019，1206：85108.16 KIM J Y，MONDACA RUFF D，SINGH S，et al.SIRT1 and autophagy：implications in endocrine disorders J.Front Endocrinol（Lausanne），2022，13：930919.17 WANG Y，LIU Z，SHU S，et al.AMPK/mTOR signaling in autophagy regulation during cisplatininduced acute kidney injuryJ.Front Physiol，2020，11：619730.18 WANG X，GAO L，LIN H，et al.Mangiferin prevents diabetic nephropathy progression and protects podocyte function via autophagy in diabetic rat glomeruli J.Eur J Pharmacol，2018，824：170178.19 LIN M，HUA R，MA J，et al.Bisphenol A promotes autophagy in ovarian granulosa cells by inducing AMPK/mTOR/ULK1 signalling pathway J.Environ Int，2021，147：106298.20 张哲，王杏，杨林泉，等.利拉鲁肽通过调控AMPK/mTOR自噬信号减轻糖尿病大鼠心肌炎症和氧化应激损伤 J.中国药理学通报，2022，38（9）：13081314.（收稿日期：20230310）Exploration of the Effect of Wenbu Gushen Formula on Renal Fibrosis in Diabetes Based on AMPK/mTOR Pathway Mediated AutophagyYU Jing1，LIU Xuchun1，LI Zhenhua2*（1.Zhumadian Central Hospital directly affiliated to Huanghuai University，Zhumadian 463000，China；2.Zhengzhou Central Hospital，Zhengzhou 450001，China）【Abstract】Objective：To explore the protective mechanism of Wenbu Gushen Formula（WGF）in regulating AMPK/mTOR pathway mediated autophagy pathway on renal fibrosis in diabetes.Methods：100 male SPF grade SD rats were collected and were intraperitoneally injected with streptozotocin（60 mg/kg）to establish the model of diabetic nephropathy except for 20 rats in the control group.Among them，60 rats were randomly divided into control group，diabetic nephropathy group，positive control drug dagelin group（1.0 mg/kg），and low，medium and high dose groups of WGF（0.92，1.84，3.68 g/kg），with 10 rats in each group.After 12 weeks of drug treatment，biochemical indexes of renal function of rats in each group were measured.HE and PAS stainings were used to observe the pathological changes of renal tissue；immunohistochemistry was employed to detect SMA and ECadherin expressions of the renal tissue；the formation of autophagic bodies was observed by electron microscopy；Western blot was utilized to detect the expression of LC3/LC3，pAMPK/AMPK and pmTOR/mTOR.The remaining 40 rats were randomly divided into control group，diabetic nephropathy group，high dose group of WGF（3.68 g/kg），group of high dose of WGF+AMPK inhibitor（20 mg/kg），with 10 rats in each group.After 12 weeks of drug treatment，biochemical indexes of renal function were measured.The pathological morphology of renal tissue was observed through electron microscope，Masson staining was used to observe the degree of renal fibrosis，and Western blot was employed to detect the expression of LC3/LC3 and AMPK/mTOR pathway protein.Results：Compared with the control group，the rats in diabetic nephropathy group had severe renal function injury accompanied by（下转第26页）212023 年 10 月第 40 卷第 10 期Vol.40，No.10，Oct.2023中医药信息（Information on Traditional Chinese Medicine）http：/ Study on Apoptosis of Lung Cancer A549 Transplanted Tumor Cells Induced by Supplemented Decoction of Two Old IngredientsWU Guoyu，HE Lifang，KE Jianlong，XIONG Shaoquan*（Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610072，China）【Abstract】Objective：To investigate the inhibitory effect of Supplemented Decoction of Two Old Ingredients（SDTOI）on the growth of transplanted tumor of adenocarcinoma of the lung A549 and explore its mechanism.After inoculated A549 lung cancer cells，18 BALB/C nude mice were randomly divided into a control group，a highdose group of SDTOI，and a lowdose group of SDTOI，with 6 mice in each group.Normal saline，high and low doses of SDTOI were given to the mice by gavage.Several indices were observed and analyzed，which are the tumor volume，growth curve，weight，tumor inhibition rate and apoptosis rate.Furthermore，ATF4 and CHOP protein expression levels were also analyzed.Results：Compared with the control group，tumor growth slowed down，tumor volume decreased and tumor weight decreased in nude mice of highdose group of SDTOI，and a lowdose group of SDTOI，and the differences are significant（P 0.05）.Tumor inhibition rate was 21.4%in lowdose group of SDTOI and 37%in highdose group of SDTOI，with a significant difference compared to the control group（P 0.05）.The apoptosis rates of tumor body in the control group，lowdose group of SDTOI and highdose group of SDTOI were 0.23%，0.29%and 0.35%，and the apoptosis rate difference between the high dose group of SDTOI and the control group was significant（P 0.05）.The levels of ATF4 and CHOP protein expression in the two SDTOI groups were upregulated compared with those of the control group，and the differences were all significant（P 0.05）.Conclusion：Supplemented