花椒根腐病拮抗菌W-5的鉴定及发酵条件的优化.pdf

山 东 农 业 科 学():./.收稿日期:基金项目:甘肃省青年科技基金项目()年度陇南市科技计划项目()年甘肃省高等学校创新基金项目()作者简介:田凤鸣()女甘肃陇南人讲师主要研究方向为病原微生物防治:.花椒根腐病拮抗菌 的鉴定及发酵条件的优化田凤鸣陈强何九军王国斌张晓娜(.陇南师范高等专科学校农林技术学院/陇南特色农业生物资源研究开发中心甘肃 陇南.陇南市武都区花椒服务中心甘肃 陇南)摘要:腐皮镰刀菌()是引起花椒根腐病的主要致病菌该病严重威胁着花椒产业的发展为筛选出花椒根腐病的生防菌株本研究采用土壤平板梯度稀释法和平板对峙法从花椒根系土壤中筛选出对腐皮镰刀菌具有拮抗作用的菌株通过形态特征观察结合 基因序列分析对菌株进行分类地位确定并在单因素试验基础上结合 中心组合设计的响应面法优化拮抗菌株的发酵条件 结果表明分离获得的菌株 为枯草芽孢杆菌()且该菌对腐皮镰刀菌的抑制率达到.对其他植物病原菌(禾谷镰刀菌、梅毒镰刀菌、藤仓赤霉菌、松针刺盘孢菌和层生镰刀菌)均有较高的抑菌活性说明其抑菌谱的广泛性能够分泌蛋白酶和纤维素酶且产嗜铁素能力极强能够减轻离体培养下花椒根片的发病症状响应面法优化后的菌株 的最佳发酵条件为:温度.、值.、接种量.、转速./此条件下 值达到.综之拮抗菌 对花椒根腐病防效优良具有生防潜力建立并优化的拮抗菌 的发酵条件体系可为花椒根腐病生物药剂的研制提供技术参考关键词:腐皮镰刀菌花椒根腐病拮抗菌株 发酵条件平板对峙法中图分类号:.文献标识号:文章编号:()(./.)./.花椒根腐病是一种危害性极强的土传病害严重时能造成椒树死亡 前期研究鉴定认为引起甘肃陇南武都花椒种植区根腐病的病原菌为腐皮镰刀菌()随着化学农药减量化防治的推广花椒根腐病的生物防治成为当前研究的热点也是获得一种可持续且安全有效的病害防治方案的重要选项 拮抗菌对病原菌具有高度特异性绿色环保是拮抗菌在防治植物病害中所具有的优点 农药商业化生产中越来越多的优良微生物菌种资源被开发成生防制剂且其防治效果受到好评 植物病害生物防治中芽孢杆菌显示出巨大的潜力和应用前景响应面分析法现已成为优化拮抗菌发酵培养的常用手段该方法的特点是能节约时间和减少试验次数克服了单因素试验存在的不足目前有关花椒根腐病拮抗菌的资源较少优良菌种资源更是相对匮乏已报道的对花椒根腐病具有良好拮抗作用的菌株有淡紫拟青霉()、蜡样芽孢杆菌、绿色木霉和哈茨木霉、贝莱斯芽孢杆菌 本研究于 年以引起花椒根腐病的主要致病真菌腐皮镰刀菌为指示菌采用土壤平板稀释法和平板对峙法分离获得花椒根腐病拮抗菌 继而对其进行形态学观察和分子生物学鉴定测定其抑菌活性并基于单因素试验结合 设计的响应面法对菌株 的最佳发酵条件进行优化以期为花椒根腐病拮抗生物菌剂的开发与应用提供技术参考 材料与方法.试验材料.供试菌株指示菌腐皮镰刀菌()和拮抗菌 分别从患有花椒根腐病的花椒根部组织和根系土壤中分离获得保存于陇南师范高等专科学校农林技术学院微生物实验室 用于广谱抑菌试验的病原菌(藤仓赤霉菌、禾谷镰刀菌、梅毒镰刀菌、层生镰刀菌)由江西师范大学杨慧林老师惠赠核桃炭疽病松针刺盘孢菌由甘肃农业大学硕士研究生魏彬惠赠 病原菌保存于 冰箱备用.培养基 供试培养基如下 培养基(/):马铃薯去皮切块称取.葡萄糖.琼脂.蒸馏水定容至 培养基(/):酵母提取物.胰蛋白胨.溶质溶解后 值用./调至.去离子水定容至 培养基(/):酵母浸粉.牛肉浸粉.葡萄糖.调 值至.加蒸馏水至 以上三种培养基均在.下灭菌.主要试剂和仪器胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉、葡萄糖、琼脂、氢氧化钠购自国药集团化学试剂有限公司 可见分光光度计上海仪电分析仪器有限公司产品超净工作台苏州净化设备有限公司产品气浴式摇床常州高德仪器制造有限公司产品立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂产品细菌基因组提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司产品.拮抗菌的分离、筛选及鉴定.拮抗菌 的分离 称取花椒根系土壤.放入 无菌三角瓶中加入无菌水 摇床上 /培养 静置 后取上清液并将浓度梯度稀释至 取、三个浓度梯度溶液 涂布于 第 期 田凤鸣等:花椒根腐病拮抗菌 的鉴定及发酵条件的优化 固体培养基中 培养 之后挑取单菌落编号为 并将其接种于 液体培养基中扩大培养 冰箱中保存备用.拮抗菌 的筛选 采用平板对峙法对分离出的拮抗菌 进行抑菌效果测定 以腐皮镰刀菌为指示菌用打孔器将其打成直径为 的菌饼接种于 培养基中心距离中心点 处成品字形放入无菌滤纸片取 单菌落菌液 加在滤纸片上 恒温培养 测定病原真菌菌落直径计算抑制率.拮抗菌 的分子生物学鉴定 利用形态学结合分子生物学的方法对拮抗菌 进行鉴定 将 菌株接种至 培养基上 培养 置于光学显微镜下观察其形态单菌落置于体视显微镜(放大倍数为)下观察其形态同时对其进行革兰氏染色分子鉴定采用细菌通用引物:/:进行 扩增 产物用.琼脂糖凝胶电泳检测 北京六合华大基因科技有限公司完成基因测序采用 完成测序结果的同源性分析系统发育树构建运用 .中 法完成.拮抗菌 对腐皮镰刀菌前端菌丝生长影响的观察将.中平板对峙法获得的抑菌平板置于体视显微镜()下观察拮抗菌 对病原菌腐皮镰刀菌前端菌丝生长的影响.拮抗菌 对病原真菌抑菌谱的检测以 种病原真菌(禾谷镰刀菌、梅毒镰刀菌、藤仓赤霉菌、松针刺盘孢菌和层生镰刀菌)为供试指示菌采用平板对峙法检测拮抗菌 对各病原真菌的抑制率其方法同.拮抗菌 对花椒根片的离体抑菌试验花椒根片的离体抑菌试验操作步骤参照文献进行.拮抗菌 产胞外酶的检测及嗜铁素培养基检测纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶检测培养基的配制参照文献的方法进行采用 检测平板进行拮抗菌 产嗜铁素的检测其制备参照文献的方法进行.拮抗菌 发酵条件优化.测定绘制拮抗菌 生长曲线 将拮抗菌 种子液按照 的比例接入 液体培养基中于 、/摇床上振荡培养采用可见分光光度法每间隔 测定其 值共测定 个点每个检测点设置 个重复绘制其生长曲线.单因素试验筛选最佳发酵条件前期试验已确定拮抗菌 生长的最佳培养基为以此为基础比较不同温度(、)、值(.、.、.、.、.、.、.、.、.)、接种量(、)、转速(、/)个因素对拮抗菌 生长的影响以其 峰值为指标确定最佳单因素发酵条件.响应面法确定最佳因素组合 在.试验基础上选取温度、值、转速和接种量为自变量以拮抗菌株 发酵液 为响应值进行响应面组合试验以、表示 个因素的高低水平进行四因素三水平的响应面分析 试验因素和水平见表 利用 软件进行响应面设计(表)优化拮抗菌 的最佳发酵条件 表 优化拮抗菌 发酵培养条件因素与水平的响应面设计水平:温度/:值:接种量/:转速/(/).数据处理与分析采用 对数据进行处理与分析及作图响应面结果采用 软件进行分析 结果与分析.拮抗菌 的形态特征及革兰氏染色结果分析拮抗菌 在 固体培养基中 培养 于光学显微镜和体视显微镜下观察菌落形态结果(图)显示菌落较大为乳白色且不透明边缘不规则表面粗糙且有褶皱革兰氏染色山 东 农 业 科 学 第 卷为阳性菌.平板透明圈法检测拮抗菌 产酶能力和嗜铁素检测三种胞外酶检测结果显示拮抗菌 在蛋白酶、纤维素酶检测培养基中均可产生较大的降解圈(图、)而在几丁质酶检测培养基中无降解圈产生 检测结果显示有明显的橙黄色嗜铁素的螯合圈(图):拮抗菌 菌落:体视显微镜下的单菌落():革兰氏染色结果图 拮抗菌 的形态特征及革兰氏染色结果:蛋白酶:纤维素酶:嗜铁素图 拮抗菌 产酶培养基和嗜铁素培养基的检测.拮抗菌 对腐皮镰刀菌的拮抗效果及对病原菌前端菌丝生长的影响培养 后的腐皮镰刀菌菌落直径为.(图)接种拮抗菌 的病原菌菌落直径为.(图)抑制率高达.体视显微镜下观察拮抗菌 对腐皮镰刀菌前端菌丝生长的影响结果显示未接种拮抗菌的病原菌菌丝前端呈放射状且菌丝浓密蓬松、粗细均匀(图)接种拮抗菌 的病原菌菌丝前端稀薄、扭曲成畸形失去了延伸性(图)以上结果说明拮抗菌 对花椒根腐病病原菌腐皮镰刀菌确有抑制作用且效果良好:腐皮镰刀菌菌落:对腐皮镰刀菌的抑制效果:正常腐皮镰刀菌菌丝前端形态:对腐皮镰刀菌前端菌丝的影响图 菌株 对腐皮镰刀菌的拮抗效果及对病原菌前端菌丝生长的影响.拮抗菌 对病原真菌抑菌谱的检测结果分析为进一步检测拮抗菌 对其他植物病原菌的抑菌活性采用平板对峙法检测其对 种病原真菌的抑菌效果结果显示拮抗菌 对藤仓赤霉菌的抑制率为.(图)对禾谷镰刀 第 期 田凤鸣等:花椒根腐病拮抗菌 的鉴定及发酵条件的优化菌的抑制率为.(图)对梅毒镰刀菌的抑制率为.(图)对松针刺盘孢菌的抑制率为.(图)对层生镰刀菌的抑制率为.(图)表明拮抗菌株 有较为广泛的抑菌活性具有一定的开发潜力:藤仓赤霉菌:对藤仓赤霉菌的拮抗效果:禾谷镰刀菌:对禾谷镰刀菌的拮抗效果:梅毒镰刀菌:对梅毒镰刀菌的拮抗效果:松针刺盘孢菌:拮抗菌 对松针刺盘孢菌的拮抗效果:层生镰刀菌:对层生镰刀菌的拮抗效果图 拮抗菌 对病原真菌的广谱抑菌效果.拮抗菌 离体拮抗结果分析为再次验证拮抗菌 对花椒根腐病病原菌的抑制效果进行了花椒根片的离体拮抗试验结果表明:花椒根片在接种无菌水培养 后依然保持原有色泽无异味产生根皮与木质部不发生分离根片周围也无液体产生(图)培养 后接种腐皮镰刀菌的花椒根片则开始变软发黑逐渐产生病症且病原菌菌丝缠绕在花椒根片周围产生的液体使滤纸变色根皮和木质部发生分离同时有臭味产生且病症与大田中典型花椒根腐病的病症相同(图)而接种拮抗菌 和病原菌的花椒根片发病症状与图 相比发病症状减轻根片颜色较浅且未出现变软现象根皮和根片未发生完全分离(图)说明离体状态下拮抗菌 对花椒根腐病病原菌仍有良好的拮抗效果与.中的结果一致:有无菌水的花椒根片:有腐皮镰刀菌的花椒根片:和腐皮镰刀菌共存的花椒根片图 拮抗菌 对花椒根片的离体拮抗作用.拮抗菌 的分子生物学鉴定和系统发育树构建采用通用引物对拮抗菌 进行分子生物学鉴定结果显示:扩增有效片段的大小为 对得到的测序结果进行 比对选取数据库中与拮抗菌 相近的 个菌株进行系统发育树构建发现菌株 与.的亲缘关系最近同属于枯草芽孢杆菌属结合其形山 东 农 业 科 学 第 卷图 基于 基因构建的拮抗菌 系统发育树态特征初步确定拮抗菌 为枯草芽孢杆菌(图).响应面法优化拮抗菌 发酵条件的参数.拮抗菌 生长曲线绘制与分析 菌株 生长曲线(图)显示接种 之间其生长速率较快 之间生长进入稳定期 后生长速率逐渐降低故将拮抗菌 的最佳生长周期确定为 .拮抗菌 单因素试验结果分析图 为 值、温度、接种量、转速 个发酵因素对拮抗菌株 生长的影响结果 值在.之间菌株生长呈现先快后慢的状态值在.之间菌株生长良好表明弱碱性条件下其依然具有一定的生长能力即具有一定的耐碱性 值为.时其 达到峰值因此确定图 拮抗菌 生长曲线图 不同发酵因素对拮抗菌株 生长的影响 第 期 田凤鸣等:花椒根腐病拮抗菌 的鉴定及发酵条件的优化该菌株生长的最佳 值为.温度对菌株生长影响的结果显示:之间菌株均可生长 为该菌的最佳生长温度 接种量在之间该菌生长良好接种量为 时其达到峰值因此确定 为该菌的最佳接菌量 摇床上转速在 /之间菌株生长量呈现先升后降的状态/时其 达到峰值因此确定 /为最佳转速.响应面法优化发酵条件结果分析 响应面法试验设计和结果见表 通过响应面法获得的方差分析结果(表)来研究各因素对拮抗菌 发酵培养的影响得出的回归模型为:.由该回归方程分析及方差分析结果可知回归模型极显著说明该模型对响应值拟合良好除、项未达到显著水平外一次项 对拮抗菌 的 具有显著水平其余一次项、二次项、交互项(、和)对拮抗菌 的都达到极显著水平说明其 的变化复杂各试验因素对响应值不是简单的线性关系说 表 响应面法设计方案和结果编号:温度/:值:接种量/:转速/(/)值.表 响应面试验回归方程方差分析方差来源平方和自由度均方 值 值显著性模型.温度.值.接种量.转速.残差.失拟项.纯误差.总回归.决定系数().注:表示差异极显著(.)表示差异显著(.说明试验点均能用该模型描述 拮抗菌发酵培养工艺模型决定系数为 .说明模型的相关性很好并能较好地进行响应值的变化分析确定最佳发酵条件 经拟合检验后校正系数 .两者非常接近说明拮抗菌发酵培养响应面二次回归拟合度很好 信噪比 .说明该模型的试验设计可靠可信度较高预测较为准确 值分析结果显示对拮抗菌 发酵的影响程度:转速接种量温度 值响应曲面坡度的陡峭与平缓能够直接反映 个因素对 的影响即可以直观地反映出 值、温度、接种量、转速对拮抗菌 发酵培养的影响 图 显示 个因素之间的各个响应曲面均为凸型曲面且开口朝下代表响应值有着极高值而且曲面坡度都比较陡峭说明其因子之间交互作用复杂 各因素之间的交互作用对拮抗菌 发酵培养的影响程度由大到小的顺序为:其中除、项外其余交互因素对拮抗菌 值的影响均达到极显著水平综合以上试验结果可将拮抗菌 发酵培养的最佳条件确定为:温度.、值.、接种量.、转速./优化后的 值达到.考虑到生产实际情况及操作的便利性将该菌的最佳发酵条件修正为:温度、接种量.、值.、转速 /图 菌株 发酵中不同因素对 值影响的响应面图 讨论与结论芽孢杆菌(.)是自然界广泛存在的重要生物防治微生物资源植物病害防治中枯草芽孢杆菌(.)被广泛应用 据报道筛选出的枯草芽孢杆菌对玉米圆斑病、烟草白粉病、水稻稻瘟病、西瓜枯萎病等植物病害均表现出良好的抑菌效果本试验从花椒根系土壤中分离获得一株对花椒根腐病病原菌腐皮镰刀菌具有良好抑制效果的拮抗细菌编号 形态学结合分子生物学鉴定其为枯草芽孢杆菌 研究表明拮抗菌 对腐皮镰刀菌的抑制率可达.体视显微镜下观察其对腐皮镰刀菌前端菌丝生长起到抑制作用结合花椒根片的离体试验结果说明 对供试 种病原菌(禾谷镰刀菌、梅毒镰刀菌、藤仓赤霉菌、松针刺盘孢菌和层生镰刀菌)均具有良好的抑菌效果证实其具有广泛的抑菌活性可以作为生防菌的优良菌种资源开发利用 拮抗菌 胞外酶和产嗜铁素能力检测结果说明该菌 第 期 田凤鸣等:花椒根腐病拮抗菌 的鉴定及发酵条件的优化能够很好地分泌蛋白酶和纤维素酶且产嗜铁素的能力极强 生防菌的生防作用是通过生防菌产生胞外酶来降解病原菌的细胞壁而实现的微生物产生的嗜铁素能够与病原微生物竞争铁营养从而达到阻碍病原菌生长即实现生物防治的效果 以上试验结果表明枯草芽孢杆菌 在花椒根腐病的防治方面具有良好的开发与应用前景采用响应面法优化拮抗菌发酵条件能更好地挖掘其拮抗作用优化后的发酵体系不但能够提高菌株活菌量而且能使菌株产生更多的抑菌代谢产物从而提高生防效果 本研究以 值作为菌株 的考量指标采用 设计并结合响应面法分析优化菌株的发酵条件得出:在综合考虑前期试验结果的基础上确定温度.、值.、接种量.、转速./为该菌的最佳发酵参数在此条件下其 值可达.这验证了响应面法对发酵条件优化的可行性 优化后的发酵体系不但提高此菌的有效活菌数而且从操作方面可降低发酵成本可为菌株 开发为微生物菌剂用于花椒根腐病的绿色防治提供一定的理论参考参 考 文 献:田凤鸣陈强王瀚等.陇南花椒根腐病病原菌的分离鉴定及生物学特性的研究.东北农业科学():.王超郭坚华席运官等.拮抗细菌在植物病害生物防治中应用的研究进展.江苏农业科学():.陈羽娇余朝阁.芽孢杆菌在植物病害防治中的应用及研究进展.农机使用与维修():.赵立春廖夏云唐梅等.响应面法优化救必应提取纯化工艺及其治疗肝炎的研究.吉林农业大学学报():.赵岩岩李帅陈晓平.响应面法优化浸提大蒜抑制大肠杆菌成分工艺.吉林农业大学学报():.杨桂霞许晓娟程志强等.响应面法优化蓝莓果渣可溶性膳食纤维提取工艺.吉林农业大学学报():.张好好洪波李宗亮等.响应面法优化金丝小枣枣渣中多糖提取工艺.吉林农业大学学报():.张荣胜梁雪杰刘永锋等.解淀粉芽胞杆菌 生物发酵工艺优化.中国生物防治学报():.郭志斌王曦茁汪来发等.淡紫拟青霉对花椒根腐病菌拮抗作用的初步研究/中国植物病理学会.中国植物病理学会 年学术年会论文集.北京:中国农业科学技术出版社:.李姝江朱天辉谯天敏等.花椒根腐病生防芽孢杆菌的筛选鉴定及定殖和防治效果.西北农林科技大学学报(自然科学版)():.田凤鸣陈强何九军等.两种木霉对陇南花椒根腐病病原菌的拮抗作用研究.宁夏师范学院学报():.田凤鸣陈强何九军等.一株花椒根腐病拮抗菌的分离鉴定及全基因组序列分析.微生物学通报():.朱海云马瑜柯杨等.猕猴桃溃疡病菌拮抗菌的筛选、鉴定及其对植物病原真菌的抗性.生物技术通报():.东秀珠蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社.:.():.郝金辉包慧芳王宁等.库尔勒香梨黑斑病菌拮抗菌筛选及其抑菌机理.微生物学通报():.梁建根.产嗜铁素菌株 的鉴定及其产嗜铁素能力的检测.浙江农业科学():.黄海婵裘娟萍.枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究进展.浙江农业科学():.郭春兰于春生张雨竹等.玉米圆斑病拮抗菌芽孢杆菌 的鉴定及抑菌研究.玉米科学():.蔡永占王瑞宝白涛等.株枯草芽孢杆菌对烟草白粉病的防效.中国农学通报():.祖雪周瑚朱华珺等.枯草芽孢杆菌 的分离鉴定及对水稻稻瘟病的防病效果.生物技术通报():.孙正祥龙欣钰孟祥佳等.枯草芽孢杆菌 的分离鉴定及对西瓜枯萎病的生防作用.长江大学学报(自然科学版)():.李英张公亮毕景然等.蜂房哈夫尼菌胞外蛋白酶的特性.大连工业大学学报():.赵荣艳张利霞郝雨.两株嗜铁细菌对几种病原菌的抑制作用及对小麦种子萌发的影响.中国植保导刊():.黄慧婧高香辉陈舒等.一株番茄青枯病菌拮抗细菌的筛选、发酵条件优化及田间小区防效.微生物学通报():.山 东 农 业 科 学 第 卷