DB37∕T 1827-2011 猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术(山东省).pdf

TCS B41 65. 020. 30 DB37 山东省Eh巳tTJ 方标准DB 37/ T 1827一-2011猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术Real-time PCR Assay for the Detection ofPorcine Circovirus Type 2 2011 - 04 -08发布2011 - 06 -01实施山东省质量技术监督局发布目IJ1=1 本标准按照GB!T1.1-2009给山的规则起草。本标准的附录A为规范性附录。本标准由山东省农业科学院提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位:山东省农业科学院畜牧兽民研究所。DB37/ T XXXX-XXXX 本标准主要起草人:王金宝、李f瓷、吴家强、H寸建r.吴晓燕、丛晓燕、乎也文|尊、杜以军。猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术1 范围;本标准规定了猪圆环病毒2型(PCV2)荧光PCR检测技术的要求。本标准适用于猪血洁和细织中猪圆环病毒2型的检测。2 材料2.1 器材2.1.1 微量移液器(最大量和为10L、20L、100L、1000L)2.1.2 20 OOOg高速冷冻离心机2.1.3 紫外分光光度il2.1.4 PCR仪2. 2 荧光定ltl:PCR仪试剂2.2.1 质粒提取试剂命2.2.2 SYBR Green 1核酸染料2. 2. 3 凝胶回收试剂盒2.2.4 蛋白酶K(见附录A.1章)2. 2. 5 10%SDS液(见附录A.2章)2. 2. 6 70%乙醇(见附录A.3章)2. 2. 7 1%琼脂糖凝胶(见附录A.4章)2.2.8 DNA Marker 2000 2. 3寻|物Y1: 5 -GCTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTT-3 , Y2: 5 -GAGTGGGCTCCAGTGCTGTTAT-3 , 3 方法3.1 质粒标准阳性模板的制备3.1.1 质粒的构建及鉴定DB37/ T XXXX-XXXX 利用普通PCR技术扩增出PCV2的ORF2基因702bp片段，凝胶回收日克隆到克隆载体。纯化质粒，并转化DH5a感受态细胞，挑选转化长出的菌落进行培养，提取质粒进行PCR鉴定。3.1.2 重组质粒浓度的测定将阳性重细质粒作20倍稀释，用紫外分光光度计测定其浓度，并计算标准品的拷贝数。3.1.3 标准品制备将重要H质粒稀释至l.0 X 1010拷贝/L后再倍比稀释，分别以10、10e、10、106、100拷贝/L5个梯度作为标准品模板，-70oC保存备用。DB37/ T XXXX-XXXX 3. 2 病毒基因细的提取对病料用蛋白酶K裂解法提取总DNA。3.2.1 病料处理:取小块病料组织T研钵中，用剪刀剪碎，加入2mLPBS缓冲液，研靡。3.2.2 取研磨液500Jl L T 1. 5mL离心管中，加入50Jl g/mL的蛋白酶K.5L，加入10%的SDS溶液25L，.55C水浴2-3h。3. 2. 3 加入200LTris饱和酌，充分混匀，10000g离心15mino3.2.4 取上清J.-一新的离心管中，加入200LTris 饱和盼和200L氯仿，10000g离心1.5mino3.2.5 取N肯于一新离心管中，加入200L氯仿，10000g离心15mino3. 2. 6 取七沽于一新离心管中，加入2倍体积的尤水乙醇，-20C静止20min，10000g离心15min，弃七洁。3. 2. 7 加入70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。3. 2. 8 加入100L灭陆超纯水溶解沉淀，-20C保存备用。3. 3 荧光定量PCR体系，详见表10表1荧光定量PCR反应体系步骤ISYBR Green T核酸染料12. 5L 步骤2寻|物y11.0L 步骤3号|物Y21.0L 步骤4DNA 2.0L 步骤5超纠水8.5L I由A、里仁立25. 0 L 荧光定量PCR程序设定每次PCR均应设一个|饲性对照，具体参数见表20表2荧光定量PCR反应程序设定温度时间步骤195C 3mi日步骤295C 10s 59C 收集信号10s 步骤395C 2min 60C 20s 95C Continue 4 结果判定i卖取检测结果。阐值设定原则以闽直线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最l句点。4. 1 标准曲线选择109、10B、10、10b、10拷贝/L5个梯度浓度的质粒作为模板，制作出动力学由线和标准由线。建立的标准曲线斜率为-3.304，轴截距为39.051，线性方程为Y二-3.394X十39.051，相关系数为O.9940 荧光定量PCR能检测出的模板最低浓度为10拷贝/L，而且不能扩增出PCV1、PPV、PRV病毒DNA，有很好的特异性。4. 2 质控标准2 DB37/ T XXXX-XXXX 4.2.1 阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。4. 2. 2 阳性对照Ct值三三3.5，并山现特定扩增曲线。否则，则此试验视为无效。4. 3 结果描述及要IJ定4.3.1阴生无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无PCV2病毒。4. 3. 2 阳性Ct值三三日，且冲!现特定扩增曲线，表明样品中存在PCV2病毒。4. 3. 3 有效原则Ct值35的样品须重做，重做结果兀Ct值者为阴性，否则为阳忡。3 A.1 蛋门酶K洛液(20mg/mL)蛋白酶KlOOmg 灭菌双蒸水5mL A.2 10%十二炕基硫酸纳(SDS溶液，pH7.2) 十二院基疏酸讷灭菌双蒸水浓盐酸灭菌双蒸水A.3 70%乙醇lOg 80mL 调pH至7.2 力日至lOOmL无水乙醉70mL 灭菌双茶水30mL A.4 1%琼脂糖;疑胶琼脂糖O .6g O. 5xTBE缓冲液60mL 附录A(规范性附录)试剂的自己申IJDB37/ T XXXX-XXXX 4