前列腺特异抗原.ppt

19981998年年8 8月月1717日日 克林顿承认和莱温克林顿承认和莱温斯基有不正当关系斯基有不正当关系19981998年年1 1月月2323日，琼斯性骚扰案日，琼斯性骚扰案中证人、白宫前实习员莫妮卡中证人、白宫前实习员莫妮卡莱温斯基被指控与克林顿有染。莱温斯基被指控与克林顿有染。克林顿(美国第42任总统1993年-2000年)Nie Shengjie,Assoc.Prof Section of Forensic Biology 2010.09.20Identification of Seminal stainoutlineBiological featureObjective&procedureVisual examinationPreliminary testsConfirmatory testsIndividual identificationBiological featureTypical ejaculation2-5 milliliters of semenSperm:107/ml 108/ml3 pg DNA/sperm 480,000 ng DNA/ejaculateOnly 1 ng DNA needed for STR typing!男性生殖系统结构男性生殖系统结构内生殖器生殖腺睾丸输精管附睾、输精管、射精管、尿道附属腺体精囊腺、前列腺、尿道球腺外生殖器阴茎阴囊男性生殖器Semen 精液精液Semen精液精液Sperm cells（Spermatozoa，精子精子）Seminal plasma精浆精浆Seminal vesicle fluid精囊液精囊液 60%Prostatic fluid secretions前列腺液前列腺液 30%Epididymis 附睾附睾 5%bulbourethral glands尿道球腺液尿道球腺液 5%semen含蛋白质、各种酶及果糖等多种成分的碱性乳白含蛋白质、各种酶及果糖等多种成分的碱性乳白色胶状液体色胶状液体成分：成分：细细 胞：精子、睾丸细胞、脱落柱状上皮细胞、胞：精子、睾丸细胞、脱落柱状上皮细胞、白细胞白细胞 非细胞：前列腺卵磷脂小体、玻璃小体、精胺结非细胞：前列腺卵磷脂小体、玻璃小体、精胺结 晶、色素颗粒、脂肪球晶、色素颗粒、脂肪球弱碱性弱碱性 pH7.28.6多种蛋白质（凝多种蛋白质（凝固酶等）固酶等）含黄素含黄素高浓度酸性磷酸酶高浓度酸性磷酸酶前列腺特异抗原前列腺特异抗原精胺精胺产生精子，分泌雄性激素产生精子，分泌雄性激素促使精子成熟，贮存精子促使精子成熟，贮存精子蛋白水解酶、蛋白水解酶、纤维蛋白酶纤维蛋白酶精液的体外变化精液的体外变化乳白色半透明粘稠液体，乳白色半透明粘稠液体，有特殊气味有特殊气味凝固酶（精囊腺）凝固酶（精囊腺）胶冻状胶冻状5min中性蛋白酶、纤溶酶中性蛋白酶、纤溶酶20min稀薄半流动状稀薄半流动状精子的发生精子的发生睾丸曲细精管睾丸曲细精管Three distinct regions:Head(acrosome and nucleus with haploid DNA)Middle Piece(mitochondria)Tail(flagella;mobility)Sperm 精子精子头头尾部尾部颈颈中中主段主段末末顶体末段主段中间段 颈头尾精子侧面观顶体蛋白酶，透明质顶体蛋白酶，透明质酸酶，酸性磷酸酶酸酶，酸性磷酸酶细细胞胞核核线粒体鞘线粒体鞘Vasectomy-block spermatozoa 输精管结扎输精管结扎Still produces ejaculate with seminal vesicle fluid and prostatic fluidWill not have enough sperm for DNA typingOligospermia-low sperm count 少精症少精症May or may not have enough sperm for DNA typingAspermia-no sperm 无精症无精症Will not have enough sperm for DNA typing14Not all semen stains contain sperm受精过程中只有精子受精过程中只有精子的头部进入卵子内！的头部进入卵子内！母母 系系 遗遗 传传Seminal stain 精液斑精液斑多为淡黄色或灰白色不规则斑痕，触多为淡黄色或灰白色不规则斑痕，触多为淡黄色或灰白色不规则斑痕，触多为淡黄色或灰白色不规则斑痕，触之较硬，有时有特殊气味。之较硬，有时有特殊气味。之较硬，有时有特殊气味。之较硬，有时有特殊气味。浓厚精斑呈灰白色浆糊状，稀薄精斑浸润于布纤维间，不易察见；浓厚精斑呈灰白色浆糊状，稀薄精斑浸润于布纤维间，不易察见；在浅色布料上，精斑多呈黄白色地图状，边沿色较深在浅色布料上，精斑多呈黄白色地图状，边沿色较深精斑检验目的与要求精斑检验目的与要求预预试试验验个个体体识识别别确确证证试试验验肉肉眼眼观观察察发现可发现可疑精斑疑精斑是否精斑是否精斑种种属属试试验验是否是否人人精斑精斑个体来源个体来源紫紫外外线线照照射射Visual examination 肉眼观察简便简便无损无损非特异非特异目的：目的：发现可疑精斑，确定其位置与发现可疑精斑，确定其位置与分布，以便准确取材分布，以便准确取材Preliminary test 预试验预试验目的:筛选可疑精斑特点：方法简单，灵敏度高方法：酸性磷酸酶检验 结晶试验 其它：锌检出法，马铃薯凝集试验酸性磷酸酶（酸性磷酸酶（Acid Acid phosphatasephosphatase，APAP）特点：特点：1.1.精液中精液中含量高含量高，是其它体液、分泌液、，是其它体液、分泌液、脏器的脏器的100100倍以上；倍以上；2.2.稳定稳定，对腐败、高热有较强抵抗力；，对腐败、高热有较强抵抗力；3.3.来自前列腺来自前列腺，无精子精液也适用；，无精子精液也适用；4.4.非特异非特异：部分水果、蔬菜，避孕药：部分水果、蔬菜，避孕药磷酸苯二钠磷酸苯二钠AP萘萘 酚酚铁氰化钾铁氰化钾氨基安替比林氨基安替比林醌类醌类磷酸苯二钠试验磷酸苯二钠试验(Kind-King test)酸性磷酸酶酸性磷酸酶缓冲液：磷酸苯二钠，4-氨基安替比林，柠檬酸，氢氧化钠，氯仿 显色液：铁氰化钾，氢氧化钠，碳酸氢钠磷酸苯二钠试验磷酸苯二钠试验(Kind-King test)阳性：立即出现红色，深浅与浓度有关阳性：立即出现红色，深浅与浓度有关阴性：橙黄色（不是精斑或酶已破坏）阴性：橙黄色（不是精斑或酶已破坏）灵敏度：灵敏度：1 1：2000020000倍稀释，血液不影响倍稀释，血液不影响非特异：脏器组织或其它分泌物、排泄物（稀释非特异：脏器组织或其它分泌物、排泄物（稀释/加热）加热）碘化碘钾结晶试验碘化碘钾结晶试验（Florence crystal test）卵磷脂卵磷脂（精液）（精液）碘碘胆碱胆碱灵敏度：灵敏度：1 1：400400干扰：血液或大小便会干扰结晶生成干扰：血液或大小便会干扰结晶生成 太新鲜太新鲜/陈旧，水洗，细菌污染均可呈阴性陈旧，水洗，细菌污染均可呈阴性非特异：凡含胆碱的分泌物，昆虫非特异：凡含胆碱的分泌物，昆虫/植物汁液等植物汁液等褐色褐色结晶结晶碘碘-碘化钾试剂碘化钾试剂分解分解碘化碘钾结晶碘化碘钾结晶精斑预试验精斑预试验目的:筛选可疑精斑特点：方法简单，灵敏度高方法：仅酸性磷酸酶检验灵敏度较高 实践中可以不经过预实验，直接进行确证；实践中可以不经过预实验，直接进行确证；预实验阴性，有时也需进行确证。预实验阴性，有时也需进行确证。精斑确证试验精斑确证试验检测精液特有成分精液特有成分阳性结果可确认精斑阳性结果可确认精斑方法：精子检出法 免疫学实验（抗人精血清沉淀反应、前列腺特异抗原检测）u最简便、最可靠u具有典型而稳定的形态u典型精子（精子头）存在，即可肯定精斑u未检出精子不能否定精斑精子检出法精斑检材处理精斑检材处理上清：抗人精上清：抗人精/PSA/PSA；中和试验中和试验沉渣：涂片找精子沉渣：涂片找精子 DNA DNA染染 色色 方方 法法精精子子染染色色单染法单染法复染法复染法藻红藻红亚甲蓝亚甲蓝苏木素苏木素精子和基质染精子和基质染成相同的颜色成相同的颜色HEHE染色染色酸性品红亚甲蓝酸性品红亚甲蓝胭脂红胭脂红精子头、尾精子头、尾和基质染成和基质染成不同的颜色不同的颜色藻红染色藻红染色（头和尾均为红色）（头和尾均为红色）酸性品红亚甲蓝染色酸性品红亚甲蓝染色（头部红色，尾部蓝色）（头部红色，尾部蓝色）一个完整精子一个完整精子/几个典型精子头即可确证精斑几个典型精子头即可确证精斑精子检出时限精子检出时限活精子：阴道38h；宫颈25d；子宫、输卵管110d死精子：阴道39d；宫颈17d与被害人体位、活动情况及月经周期有关取材部位：活体阴道拭子1.52d；尸体3w （阴道后穹窿及宫颈刮片阴道后穹窿及宫颈刮片）免疫学试验免疫学试验抗人精血清抗人精血清Blank controlHuman controlSheep controlQ1Q2Q3Human antiserumagar gel diffusion test醌是对含有环己二烯二酮构造的一类化醌是对含有环己二烯二酮构造的一类化合物的总称。合物的总称。前列腺特异抗原前列腺特异抗原（prostate specific antigen，PSA）精浆蛋白，由精浆蛋白，由人类前列腺上皮细胞人类前列腺上皮细胞分泌，是分泌，是精浆特有糖蛋白，分子量精浆特有糖蛋白，分子量30 00030 000，故名，故名p30p30性质稳定性质稳定，是确证精斑的理想标记。，是确证精斑的理想标记。抗抗p30p30有高度有高度种属特异性种属特异性和前列腺和前列腺器官特异性器官特异性。灵敏、特异灵敏、特异，不受阴道液、唾液及有无精子影响。，不受阴道液、唾液及有无精子影响。加加 样样 区区反反 应应 区区吸吸 附附 区区检测线检测线鼠抗人鼠抗人p30p30质控线质控线羊抗鼠羊抗鼠IgGIgG玻璃纤维玻璃纤维免疫胶体金免疫胶体金鼠抗人鼠抗人p30p30硬质塑硬质塑料底板料底板玻璃纤维玻璃纤维胶体金胶体金p30p30抗原检测试纸条抗原检测试纸条PSAPSA试纸条试纸条精斑的个人识别精斑的个人识别传统的遗传标记：ABO 血型、酶型、血清型等DNA多态性标记抗体凝集能力下降或消失不凝集具有相应的抗原精斑精斑ABOABO血型测定血型测定中和试验中和试验设置已知对照；设置已知对照；注意假阴性注意假阴性，抗血清必须标化！，抗血清必须标化！精斑浸液精斑浸液(可溶性抗原可溶性抗原)抗抗A A抗抗B B抗抗H H3030分分钟钟A-cellB-cellO-cell凝集凝集不凝集不凝集不凝集不凝集无无A A原理：可溶性血型抗原与相应抗体结合，原理：可溶性血型抗原与相应抗体结合，使其凝集红细胞能力下降或消失使其凝集红细胞能力下降或消失有有B B有有H HB精斑精斑DNADNA分析分析精子精子DNADNA提取提取 精子细胞核膜是富含二硫键的精子细胞核膜是富含二硫键的交联蛋白交联蛋白组成的网组成的网状结构，必须在状结构，必须在DTTDTT等试剂作用下使等试剂作用下使S-SS-S还原还原成成SHSH，核蛋白才能被，核蛋白才能被SDSSDS、蛋白酶、蛋白酶K K分解，释放分解，释放出出DNADNAY-STRY-STR在性犯罪案件中的意义在性犯罪案件中的意义 不受女性成分干扰不受女性成分干扰 轮奸案轮奸案 父系遗传，可利用家系排查父系遗传，可利用家系排查案例1李某某，女性，20岁，被杀害在户外，尸检提取阴道内、外拭子。结果PSA试剂条检测均为阴性。问题：怀疑性侵犯的案件，尸体上如何提取精斑？答案：该案件法医又行尸体解剖，在死者会厌处取擦拭物送检，结果PSA试剂条检测阳性。Sexual assault:where to find seminal stain?现场现场 纸巾、被褥、毛巾、地面纸巾、被褥、毛巾、地面受害人：受害人：阴道拭子（后穹窿）阴道拭子（后穹窿）宫颈刮片宫颈刮片会阴会阴大腿内侧大腿内侧腹壁腹壁臀部，直肠臀部，直肠口腔（会厌）口腔（会厌）内裤及衣物内裤及衣物紫外辅助光源！紫外辅助光源！Sexual assaultCollection of other biological evidence分点提取，阴凉干燥，纸袋包装！分点提取，阴凉干燥，纸袋包装！Control samples Victim，spouse，suspectSaliva stain 唾液斑唾液斑Trace tissue 指甲缝微量组织指甲缝微量组织 案例2某年某月某日，某市一四岁女孩被强奸。由于阴道严重损伤，大量出血，回家后女孩的母亲将其粘有大量血迹的裤子换下放入一大盆内放水浸泡准备清洗 问题：检材已被大量稀释，如何获取精子？答案：精子在水中不会裂解，多次离心取沉渣答案：精子在水中不会裂解，多次离心取沉渣案例3杨某某，女性，杨某某，女性，1414岁，父母到派出所报称该女孩岁，父母到派出所报称该女孩已失踪已失踪3 3周。后派出所组织人员到后山上进行搜索，周。后派出所组织人员到后山上进行搜索，在一山洞发现一高度腐败尸体。在一山洞发现一高度腐败尸体。问题：高腐尸体如何提取精斑？问题：高腐尸体如何提取精斑？答案：尸体阴道内的精子数目多且保存时间长，答案：尸体阴道内的精子数目多且保存时间长，检出率的高低与阴道提取部位有关（检出率的高低与阴道提取部位有关（宫颈刮片和宫颈刮片和阴道后穹隆部拭子较高阴道后穹隆部拭子较高）。在本案中，虽尸体已）。在本案中，虽尸体已高度腐败但仍能对阴道拭子精子高度腐败但仍能对阴道拭子精子DNADNA进行分析，最进行分析，最终锁定犯罪嫌疑人。终锁定犯罪嫌疑人。案例42004年8月某一女子夜间在自家被强奸。现场提取嫌疑人擦拭过的卫生纸一份和受害人内裤一条。PSA结果阳性，但多次检验均无DNA分型。问题1：性犯罪案件中出现此种情况该如何考虑？问题2：是否可以进行DNA检验？如何做？答案：犯罪嫌疑人供称因计划生育曾做过输精管结扎术。（无精子精斑不可二步消化提取无精子精斑不可二步消化提取DNADNA）附睾附睾输精管输精管睾丸睾丸尿道外口尿道外口前列腺尿道前列腺尿道尿道球腺尿道球腺前列腺前列腺精囊精囊