DB33∕T 2246-2020 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT－PCR检测方法(浙江省).pdf

lCS 65. 020. 20 B 44 DB33 川、d江省山巳ETE, 万标准DB33/T 2246-2020 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法Real-time PCR detection technique for Japanese encephalitis virus 2020 -03 -03发布2020 - 04 -03实施浙江省市场监督管理局发布本标准按照GB!T1. 1-2009的规定编写。本标准由浙江省农业农村厅提出。目IJ1=1 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位:浙江省动物疫病预防控制中心。DB33/T 2246-2020 本标准主要起草人:谢荣辉、张传亮、吴费立在、徐辉、刘霞、周吉、柴娟、虞一聪、王雅婷、周彩琴、赵灵燕、刘爱军、吴雪军。DB33/T 2246-2020 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法1 范围本标准规定了猪流行性乙型脑炎病毒Capaneseencephalitis virus, EV)荧光定量RT-PCR检测的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。本标准适用于猪流行性乙型脑炎病毒核酸的检测。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1 猪流行性乙型脑炎由猪流行性乙型脑炎病毒引起的一种急性传染病。猪的主要临床症状表现为高热、流产、死胎和公猪罩丸炎。3 实验条件3. 1 仪器3. 1. 1 高速冷冻离心机。3.1.2 荧光定量PCR仪。3.1.3 生物安全柜。3.1.4 组织研磨仪。3.1.5 微量移液器。3.1.6冰箱。3.1.7 涡旋混匀器。3.1.8 高压灭菌器。3. 2 试齐IJ除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RN/.酶污染的容器分装。3.2.1 Trizol:核糖核酸CRibonucleicacid, RNA)提取试剂。3.2.2 氯仿4C预冷。3. 2. 3 异丙醇4C预冷。3.2.4 焦炭酸二乙醋CDiethylpyrocarbonate，DEPC)水:取DEPC100L，加超纯水至100此，室温过夜，121 C高压灭菌15min，分装，冻存备用。3.2.5 75%乙醇:用75mL无水乙醇，加DEPC水至100此，泪匀，-20 C预冷。DB33/T 2246-2020 3.2.6 商品化的一步法实时荧光RT-PCR反应试剂:One Step Prime ScripFM RT-PCR Ki t(Perfect Real Time, TAKARA)，含有2xOneStep RT-PCR Buffer m、ExTaq HS (5 U/L)、PrimeScriptRT Enzyme Mix II和无RNA酶的水。3.2.7 O. 01mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液CPhosphatebuffered saline，PBS)取NaP04.12H2 0 2.饨，KCl 0.2g, KH2P040.2g, NaCl饵，溶于800mL去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH调节至7.4，然后加去离子水定容至1L，高温灭菌30min，室温保存。3.2.8 引物和探针，其序列如下:上游引物5-GGCTCTTATCACGTTCTTCAAGTTT-3，下游引物5TGCTTTCCATCGGCCYAAAA-3，探针5-FAM-AGCATTAGCCCCGACCAAGGCG-TAMRA-3o3.2.9 阳性对照:猪乙型脑炎活疫苗CSA14-14-2株)。4 操作步骤4.1 样品采集4. 1. 1 脑组织:选择代表性病症的病死猪，应无菌采集脑组织，将采集到的脑组织装入到无菌离心管中并编号，冷藏送检或20oc以下保存备用。4.1.2 全血:用无菌注射器耳静脉采集猪血，将采集到的猪血装入到无菌离心管中并编号，冷藏送检。若不能及时送检的全血，应分离血清置于20oc以下保存备用。4. 2 样品处理4.2.1 取待检脑组织适量装入到无菌离心管中，按1:10体积加入PBS，置于组织研磨仪中充分研磨。将研磨后的样品，反复冻融3次，10000 r/min离JL.5 min，取上清11安至无菌离心管中，编号待检。4. 2. 2 取全血3500r/min离心5min，取血清至无菌离心管中，编号待检。4.3 RNA :HUJI. 4.3.1 按下列步骤完成RNA提取，也可采用商品化的病毒RNA提取试剂盒。4. 3. 2 取n个灭菌的1.imL离心管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，对每个离心管进行编号。4. 3. 3 每管加入750LTrizd，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各250ul，震荡数次，静置5 mino再加入200L预冷的氯仿，震荡混匀，静置5min，于4oC 12 000 r/min离心15mino 4.3.4 取与本标准5.3. 2中相同数量的灭茵1.5ml离心管，并对每个离心管进行编号。取本标准5.3. 3 中离心后的上清液(注意不吸出中间层)转移至相应的管中，加入等体积异丙醇，混匀，-20 oC静置30 min。4.3.5 于40 C 12 000 r/min离心15mi口，弃上洁，缓缓加入1mL 75%乙醇，颠倒洗涤沉淀及管壁。于40 C 12 000 r/min离心10min，弃上洁，室温条件下干燥后，加入30IJ L DEPC处理水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，以4000r/min离心10s冰上保存备用O提取的RNA应在2h内进行荧光RT-PCR扩增，若需长期保存，需置于700 C 冰箱保存。4.4 荧光定量RT-PCR反应4.4.1 反应体系组成设立阳性对照、阴性对照，反应体系(20L)由表1中物质组成。2 DB33/T 2246-2020 表1反应体系配制表Y剂用量/L2XOne St巳pRT -PCR Buffer III 10 Ex Taq HS (5 U/U o. 4 PrimeScript RT Enzyme Mix n O. 4 上游引物00阳ol/UO. 4 下游引物00 flmol/U O. 4 探针(10mol/L)O. 4 样品RNA4 RNase Free dH20 4 ,Et 立E三旦L 20 4.4.2 反应条件反转录42oC 15 min;预变性94oC 2 min;扩增94oC 10 s, 60 oC 40 s, 45个循环，60 oC时设置采集荧光。4.4.3 荧光素的设定Report Dye设定为F脯，Quencher Dye设定为noneo5 结果判定5. 1 结果分析条件设定直接读取检测结果。闹值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阔值钱刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。5. 2 质控标准阳性对照的Ct值应三30并出现典型的扩增曲线，阴性对照无Ct值且无典型扩增由线，二者同时成立可判定试验成立，否则试验无效。5.3 结果描述及判定5.3.1 阴性判定无Ct值，且无典型扩增由线，判为阴性。5.3.2 阳性判定Ct直到5，且出现典型扩增曲线，判为阳性。5.3.3 可疑判定Ct值35，且出现典型扩增由线的样品，需重复检测:重复检测结果Ct值三38且出现典型扩增曲线的判为样品阳性，否则判为阴性。3