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酶酶的分子修饰的分子修饰Enzyme modification1.1.酶分子修饰的概念酶分子修饰的概念 通过主链的通过主链的“切割切割”、“剪接剪接”和侧链基团的和侧链基团的“化化学修饰学修饰”,以改变其结构、性质及生物活性等以改变其结构、性质及生物活性等.这种应用这种应用化学方法对酶分子施行种种化学方法对酶分子施行种种“手术手术”的技术的技术 1.酶的分子修饰概述酶的分子修饰概述 或或在在体体外外将将酶酶分分子子通通过过人人工工的的方方法法与与一一些些化化学学基基团团(物物质质)，特特别别是是具具有有生生物物相相容容性性的的物物质质，进进行行共共价价连连接接，从从而而改改变酶的结构和性质。变酶的结构和性质。酶分子修饰的概念酶分子修饰的概念生物体中存在的酶分子修饰生物体中存在的酶分子修饰 v酶原激活酶原激活 v共价修饰共价修饰Proteolytic Zymogen Activation.酶原激活酶原激活 酶酶分分子子中中的的某某些些基基团团在在其其他他酶酶的的催催化化下下，可可共共价价结结合合或或脱脱去去，引引起起酶酶分分子子构构象象改改变变而而调调节节其其活活性性，此此类类酶酶称称为为共共价价修修饰饰调调节酶。节酶。共价修饰共价修饰酶的共价修饰方式酶的共价修饰方式 磷酸化磷酸化/去磷酸化；去磷酸化；乙酰化乙酰化/去乙酰化；去乙酰化；腺苷酰化腺苷酰化/去腺苷酰化；去腺苷酰化；尿苷酰化尿苷酰化/去尿苷酰化；去尿苷酰化；甲基化甲基化/去甲基化；去甲基化；氧化氧化(SS)/(SS)/还原还原(2SH)(2SH)。磷酸化磷酸化/去磷酸化是是高等动植物酶化学修饰的主要形式去磷酸化是是高等动植物酶化学修饰的主要形式细菌主要是核苷酰化形式。细菌主要是核苷酰化形式。1.2.酶分子修饰的目的酶分子修饰的目的 基础酶学的研究和疾病治疗基础酶学的研究和疾病治疗 医疗用酶的要求医疗用酶的要求稳定性高稳定性高 纯度高纯度高 无免疫原性无免疫原性基础酶学研究上基础酶学研究上 (1)探测酶活性必需氨基酸的性质和数目。探测酶活性必需氨基酸的性质和数目。(2)探测酶蛋白的结构变化与运动。探测酶蛋白的结构变化与运动。(3)测定酶蛋白部分区域的构象状态。测定酶蛋白部分区域的构象状态。(4)探索酶的作用机理和催化反应历程。探索酶的作用机理和催化反应历程。(5)探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态。探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态。(6)研究酶的固定化技术。研究酶的固定化技术。人为地改变天然酶的一些性质人为地改变天然酶的一些性质,创造天然酶所不具备的某些优良特性创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性甚至创造出新的活性,来扩大酶的应用领域。来扩大酶的应用领域。提高酶活性提高酶活性;增强在不良环境增强在不良环境(非生理条件非生理条件)中的稳定性中的稳定性;针对异体反应针对异体反应,降低生物识别能力降低生物识别能力,降低免疫原性降低免疫原性.Low solubilityPoor stabilityOral delivery of proteins impossible because they are destroyed by the digestive systemInjected proteins are quickly removed by renal excretion酶应用研究上的目的酶应用研究上的目的2.酶分子的修饰方法酶分子的修饰方法2.1.2.1.酶辅因子的置换修饰酶辅因子的置换修饰2.2.2.2.大分子结合修饰大分子结合修饰2.3.2.3.小分子修饰小分子修饰2.4.2.4.分子内交联分子内交联2.5.2.5.分子间交联分子间交联 2.6.2.6.氨基酸的置换修饰氨基酸的置换修饰2.7.2.7.肽链的有限水解肽链的有限水解2.8.2.8.物理修饰物理修饰2.1.酶辅因子的置换修饰酶辅因子的置换修饰 通过改变酶分子中的辅因子，使酶的特性和功能通过改变酶分子中的辅因子，使酶的特性和功能发生改变，主要是金属离子的置换，因此该方法又称发生改变，主要是金属离子的置换，因此该方法又称为离子置换法。为离子置换法。主要是二价离子的置换修饰主要是二价离子的置换修饰置换修饰过程置换修饰过程酶液中酶液中加入加入EDTA透析或超滤透析或超滤加入金属离子加入金属离子置换修饰酶置换修饰酶等价同荷置换等价同荷置换置换修饰的要点置换修饰的要点举例举例 蛋白酶（蛋白酶（Zn2）蛋白酶（蛋白酶（Ca2），），活力提高活力提高 -淀粉酶淀粉酶（杂离子型）（杂离子型）Ca2型，活力增加，型，活力增加，稳定性增加稳定性增加2.2.大分子结合修饰大分子结合修饰 v大分子的非共价修饰大分子的非共价修饰v大分子的共价修饰大分子的共价修饰v大分子的非共价修饰大分子的非共价修饰非非蛋白质修饰物蛋白质修饰物 多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺 如聚乙二醇、右旋糖苷等如聚乙二醇、右旋糖苷等能能与与酶酶非非共共价价地地相相互互作作用用而而有有效效地地保保护护酶酶，既既能能通通过过氢氢键键固固定定在在酶酶分分子子表表面面，也也能能通通氢氢键键有有效效地地与与外外部水相连，通过调节酶的微环境，保护酶的活力。部水相连，通过调节酶的微环境，保护酶的活力。有有些些来来自自嗜嗜热热菌菌的的酶酶具具有有较较高高稳稳定定性性，其其原原因因正正是是由于保护性大分子由于保护性大分子(如肽和聚胺如肽和聚胺)发挥作用的结果。发挥作用的结果。酶酶的的多多聚聚体体或或酶酶聚聚合合体体的的活活力力和和稳稳定定性性比比单单体体高高就就是是这个原因。这个原因。用用抗抗体体来来稳稳定定酶酶。有有些些抗抗体体能能在在蛋蛋白白质质开开始始伸伸展展的的部部位或被蛋白酶水解的部位起作用，因而起到稳定作用。位或被蛋白酶水解的部位起作用，因而起到稳定作用。蛋白质类修饰物蛋白质类修饰物 -淀淀粉粉酶酶与与其其抗抗体体的的复复合合物物在在70半半衰衰期期为为16h，而天然酶仅为而天然酶仅为5min。抗抗体体保保护护的的酶酶还还有有抗抗氧氧化化酶酶、抗抗有有机机溶溶剂剂、抗抗低低pH、抗自溶、抗蛋白酶等作用。抗自溶、抗蛋白酶等作用。Taqase举例举例ANNEALING 37C-65CEXTENSION 72C25-35 CYCLESDENATURATION 93C-95C DENATURATION 93C-95C 优点：优点：抗体制备简单抗体制备简单 任任何何一一种种酶酶都都有有它它相相对对应应的的抗抗体体，制制备备亦亦较较简简单、迅速。所以，用抗体稳定酶的方法较普遍。单、迅速。所以，用抗体稳定酶的方法较普遍。缺点：缺点：制备抗体花费较多，解决的办法是用微生物来生产。最制备抗体花费较多，解决的办法是用微生物来生产。最近报告表明，已经成功地由大肠杆菌生产具有完整功能近报告表明，已经成功地由大肠杆菌生产具有完整功能的重组抗体片段，而且用同一种微生物既能生产目的蛋的重组抗体片段，而且用同一种微生物既能生产目的蛋白又生产其抗体的可能性。白又生产其抗体的可能性。在医学上要解决酶在医学上要解决酶抗体复合物在体内的抗原性。目前抗体复合物在体内的抗原性。目前采用降低抗体分子的大小制造嵌合抗体采用降低抗体分子的大小制造嵌合抗体 v大分子的共价修饰大分子的共价修饰用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层 聚聚乙乙二二醇醇修修饰饰超超氧氧物物歧歧化化酶酶(SOD)，不不仅仅可可以以降降低低或或消消除除酶酶的的抗抗原原性性，而而且且提提高高了了抗抗蛋蛋白白酶酶的的能能力力，延延长长了了酶酶在体内的半衰期，从而提高了酶药效。在体内的半衰期，从而提高了酶药效。日日本本学学者者将将聚聚乙乙二二醇醇连连到到脂脂肪肪酶酶、胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶上上所所得得产产物物溶溶于于有有机机溶溶剂剂，在在有有机机溶溶剂剂存存在在下下能能够够有有效效地地起起作用。作用。嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶在在水水介介质质中中通通常常催催化化肽肽链链断断裂裂，但但用用聚聚乙乙二二醇醇共共价价修修饰饰后后，其其催催化化活活性性显显著著改改变变，在在有有机机溶溶剂剂中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。PEG:HO-CH2-CH2-(OCH2CH2)nCH2CH2-OHNH2-PrtPEG binds 2-3 water molecules per repeat unitPEG/water shield can reduce activity of protein,but generally the increased circulation time makes up for this重组白介素（重组白介素（rIL-2）用大分子用大分子PEG修饰后，半衰期修饰后，半衰期延长延长10倍倍腺苷脱氨酶（腺苷脱氨酶（ADA）用于治疗联合免疫缺陷用于治疗联合免疫缺陷 PEG修饰的修饰的ADA在体内的半衰期从数分钟延长到在体内的半衰期从数分钟延长到24小小 时，免疫原性降低时，免疫原性降低 1990年美国食品和药品管理局（年美国食品和药品管理局（FDA）批准用于联合批准用于联合免疫缺陷的治疗免疫缺陷的治疗天冬酰胺酶（天冬酰胺酶（ASP）用于白血病的治疗用于白血病的治疗PEG修饰后半衰期从修饰后半衰期从24小时增加到小时增加到357小时小时FDA1994年批准用于急性淋巴细胞性白血病治疗年批准用于急性淋巴细胞性白血病治疗IFN-2aPEG修饰后疗效增加修饰后疗效增加FDA已批准正式生产，如已批准正式生产，如Roche公司的公司的PEGASYSTMPeg-Interferon-2aPegasys(Roche)Hepatitis C(2000)IFN-2bPEG修饰后半衰期延长修饰后半衰期延长5倍倍Schering-Plough公司的公司的Peg-IntronPeg-Interferon-2bPEG-Intron A(Schering)Hepatitis C(2001)Protein-Polymer BioconjugatesInterferon-2a(IFN-2a)Conjugated IFN-2aCommercially availableActivated PEGDisadvantages of IFN treatmenth Side effects commonh Expensiveh Effective in only minority of chronic HBV infection patientsPegylated IFN Pegylation=the addition of an inert polyethylene glycol(PEG)to a protein molecule increasing its molecular weight without affecting its therapeutic activity2 main effects of pegylation of IFNallonger lasting therapeutic effectlreducing immunogenicity potentialPeg interferon alfa-2aPegylationPegylation agent agent+40 40 kiloDaltonskiloDaltons (2 x 20)(2 x 20)(n(nIFNIFN19 19 kiloDaltonskiloDaltons=potential=potential reactive sitereactive sitePeg-IFN -2a blood levels do not fluctuateTime(hours)02468101214024487296120 144Interferon(U/mL)Tues Wed Thur Fri Sat SunMonPeriods oftime whenIFN is not incirculation40 kDabranched peginterferonalfa-2a(ng/mL)051015202530024487296 120 144 168Time(hours)after injectionTue WedThu Fri Sat SunMon粒细胞集落刺激因子（粒细胞集落刺激因子（G-CSF）用于治疗中性粒细胞减少症用于治疗中性粒细胞减少症美国美国Amgen公司研制的公司研制的PEG修饰长效修饰长效G-CSF，是在重组人是在重组人G-CSF的的N端端Met残基上共价结合了残基上共价结合了20kD的的PEG，于于2002年年1月获月获FDA批准批准酶酶半衰期半衰期天然天然SOD6min右旋糖苷右旋糖苷SOD7hrFicoll（低（低分子量）分子量）SOD14hrFicoll（高分子量）高分子量）SOD24hrPEGSOD35hr天然天然SOD与修饰与修饰SOD在血浆中的半衰期在血浆中的半衰期Characterization of the PEGylated proteins.(A)SDS PAGE characterization of PEGylated human PAH,MOLECULAR THERAPY Vol.9,No.1,January 2004，124129Lysozyme Poly(PEGMA)NHS Conjugation+DMSO/NEt314.421.531.045.066.2kDaLysozyme(reference)Bioconjugate5-7 polymeric chains attachedProteinMarkers15%Crosslinked GelSDS-PAGELysozyme Poly(PEGMA)NHS ConjugationColumn:BioSep SEC-S3000Flow rate:0.5 mL/minMobile Phase:0.1%TFA(v/v)solution in H20/MeCN(69/31)UV detection 215 nm2.3.小分子修饰小分子修饰主要用于侧链基团的修饰主要用于侧链基团的修饰羧基的修饰羧基的修饰 碳二亚胺碳二亚胺o 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBS）与与Lys反应在反应在420nm和和367nm能产生特定的光吸收能产生特定的光吸收o 磷酸吡哆醛（磷酸吡哆醛（PLP）Lys的专一性修饰剂，的专一性修饰剂，325nm有最大吸收，可用于定量有最大吸收，可用于定量氨基的修饰氨基的修饰 主要对主要对 Lys的的 氨基氨基chemical crosslinking of side chainsArg胍基的修饰胍基的修饰 丁二酮丁二酮、1,2-环己二酮环己二酮、苯乙二醛等具有两个临位羰、苯乙二醛等具有两个临位羰基的试剂基的试剂巯基的修饰巯基的修饰 主要是烷基化试剂和还原剂主要是烷基化试剂和还原剂 碘乙酸碘乙酸 马来酰亚胺马来酰亚胺 对氯汞苯甲酸对氯汞苯甲酸 DTT 巯基乙醇巯基乙醇Conjugationto cysteineresiduesHis咪唑的修饰咪唑的修饰 焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯Trp吲哚基的修饰吲哚基的修饰 Trp一般位于分子内部一般位于分子内部，反应性差反应性差 N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 4-硝基苯硫氯硝基苯硫氯2.4.分子内交联分子内交联胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶上上羧羧基基经经碳碳二二亚亚胺胺活活化化后后，可可与与一一系系列列二二胺胺作作用用。结结果果发发现现，用用1,4二二氨氨基基丁丁烷烷交联该酶，可得到稳定性有所改善的酶制剂交联该酶，可得到稳定性有所改善的酶制剂酶酶分子内部两个侧链基团反应，分子内部两个侧链基团反应，增加酶分子表面交联键增加酶分子表面交联键的数目是稳定酶的方法之一。的数目是稳定酶的方法之一。Clain 和和NaviaNavia首次证实了利用交联酶晶体首次证实了利用交联酶晶体(Crosslinked enzyme crystal,CLEC)技术提高了嗜热菌技术提高了嗜热菌蛋白酶的生物活性蛋白酶的生物活性,增加了其热稳定性。增加了其热稳定性。枯草杆菌蛋白酶经预处理枯草杆菌蛋白酶经预处理,冻干形成交联酶晶体冻干形成交联酶晶体,在有机在有机溶剂和水溶液中的稳定性大大增加溶剂和水溶液中的稳定性大大增加,活力可提高活力可提高13倍倍利用葡聚糖二乙醛将青霉素酰化酶进行交联利用葡聚糖二乙醛将青霉素酰化酶进行交联,使其在使其在55下的半衰期提高下的半衰期提高9倍倍,而保持不变而保持不变 2.5.分子间交联分子间交联 用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂化酶。用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂化酶。例如用戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。例如用戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。这种杂化酶的优点是，胰凝乳蛋白这种杂化酶的优点是，胰凝乳蛋白酶的自溶作用降低。酶的自溶作用降低。2.6.氨基酸的置换修饰氨基酸的置换修饰化学方法化学方法 难度大，很少有使用难度大，很少有使用Mutagenesis:Why Mutate?Native proteins are not well suited for industrial applicationNative proteins are not optimized for medicinal purposesIncrease the efficiency of enzyme-catalyzed reactionsEliminate the need for cofactor in enzymatic reactionChange substrate binding site to increase specificityChange the thermal toleranceChange the pH stabilityIncrease proteins resistance to proteases(purification)Signal sequences secretionrare codon changes工程二硫键工程二硫键 增加蛋白质内部疏水性增加蛋白质内部疏水性酶表面亲水化酶表面亲水化抗氧化失活抗氧化失活Asn脱酰胺失活脱酰胺失活定点突变技术（定点突变技术（site-directed mutagenesis)1990年年Goodson将将干扰素的干扰素的Thr3替换为替换为Cys3，并，并通过通过PEG修饰，水溶性增加，半衰期延长修饰，水溶性增加，半衰期延长(工程二硫键工程二硫键)噬菌体噬菌体T4溶菌酶溶菌酶Ile3突变为突变为Cys3，使与使与Cys97形成二硫键，形成二硫键，催化活性不变，但热稳定性显著提高催化活性不变，但热稳定性显著提高(工程二硫键工程二硫键)xylanase(工程二硫键工程二硫键)used to treat wood pulp in paper production needs to function at high tempGlu49位于色氨酸合成酶的疏水核心部分。如位于色氨酸合成酶的疏水核心部分。如Ala取代，取代，稳定性增加稳定性增加(增加蛋白质内部疏水性增加蛋白质内部疏水性)Three-Dimensional Structure of T4 LysozymeLocation of new disulfide bonds in T4 lysozymeIntroduction of disulfide bonds must be formed in the context of a structure.Only a limited number of locations in a protein can accept two cysteine residues in an orientation that can accept the S-S bond without generating conformational strain(software now exists which can help in this choice).In principle,the larger the loop the greater the reduction in the entropy of the unfolded state.Lys取代葡萄糖脱氢酶的取代葡萄糖脱氢酶的Ser231，突变体在突变体在55 的半衰期比天然酶高的半衰期比天然酶高8倍，活力相当倍，活力相当(酶表面亲水化酶表面亲水化)枯草杆菌蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶的Cys取代取代Met222催化速度增加催化速度增加2倍；用倍；用Ala、Ser 或或Leu取代取代Met222，酶可以抵抗高达酶可以抵抗高达1mol/L H2O2的氧化失活的氧化失活 (抗氧化失活抗氧化失活)三糖磷酸异构酶的三糖磷酸异构酶的Asn144用用Thr取代，取代，Asn78用用Ile取代，突变酶在取代，突变酶在100 的稳定性比天然酶高的稳定性比天然酶高2倍；枯草杆菌倍；枯草杆菌-淀粉酶淀粉酶Asn190用用Ala取代，取代，在在80 的半衰期增加的半衰期增加6倍倍(Asn脱酰胺失活脱酰胺失活)PCR定点突变定点突变(PCR mutagenesis)Introduces sequence changes into(cloned)DNA fragments;Overlap extension method requires 2 mutagenic primers and 2 others;Amplify a 5 fragment and a 3 fragment that overlap and each have the mutation;Use these products in another reaction to produce the full-length mutated DNA.PCR mutagenesis-overlap extensionSP6 primerforward mutagenic primerreverse mutagenic primerT7 primerXxxxTwo separate 1st PCRsremove primers,denature and re-anneal2nd PCR“If a biochemist wishes to improve on a behaviour that is already optimized by natural selection,mutants are unlikely to yield enzymes with improved performances”S.Benner(1989)Chem.Rev.89,789-8062.7.肽链的有限水解与肽链的延伸肽链的有限水解与肽链的延伸生物体内：酶原激活生物体内：酶原激活主要是降低免疫原性主要是降低免疫原性用用木瓜蛋白酶水解亮氨酸氨肽酶，木瓜蛋白酶水解亮氨酸氨肽酶，2/3被除去，但活力被除去，但活力不变不变烯醇化酶在水解掉烯醇化酶在水解掉150个氨基酸后，活力仍可保持个氨基酸后，活力仍可保持 肽链的延伸肽链的延伸PhusioniProof2.8.物理修饰物理修饰通过物理方法改变酶的空间构象通过物理方法改变酶的空间构象羧肽酶经高压处理后，底物特异性发生改变，有利羧肽酶经高压处理后，底物特异性发生改变，有利于合成反应于合成反应纤维素酶高压处理后，最适温度降低，但活力提高纤维素酶高压处理后，最适温度降低，但活力提高补充材料补充材料Esterification of phenyl-ethanol with lauric acidhr+HOCOC11H23conversint(hours)1002040powderW/OTwo-phases transgalactosilationROHGal-OROrganic phaseOrganic phase:-galactosidaseGluAqueous phaseAqueous phaseGal-1,4-Glu(lactose)Two-phases transgalactosilationnChemical modifications(in vitro engineering)nOne of the first way and a re-emerged method for altering protein properties.nPolyethylene glycol(PEG)modification of protein surface amino groups reduces immunoreactivity,prolongs clearance times,improve biostability,increase the solubility and activity of enzymes in organic solvents.n(DeSantis,G.and Jones,J.B.(1999)“Chemical modification of enzymes for enhanced functionality”,Current Opinion in Biotechnology,10(4):324-330)Some chemical modifications that may stabilize proteinsPolyethylene glycol(PEG)modification of proteinsCyanuric chloridep-nitrophenyl chloroformate