SZDB∕Z 124-2015 基于第二代测序技术的HLA高分辨分型检测标准.pdf

ICS 11.100. C 63 SZDB/Z 深 圳 市 标 准 化 指 导 性 技 术 文 件 SZDB/Z 124-2015 基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型 检测标准 2015-02 -05 发布 2015-03 -01 实施 深圳市市场监督管理局 发 布 SZDB/Z 124-2015 I 11 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 缩略语 . 1 3 术语和定义 . 1 4 检测工作程序 . 2 5 实验室工作程序 . 4 6 检测报告 . 5 7 受检者资料和样本的保存 . 5 8 质量控制 . 5 附录 A（资料性附录）基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型检测送检单 . 6 附录 B（资料性附录）基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型检测报告单 . 8 参 考 文 献 . 9 SZDB/Z 124-2015 II 前 言 本标准按照 GB/T1.12009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由深圳市卫生和人口计划生育委员会归口。 本标准负责起草单位：深圳华大基因医学有限公司、深圳华大临床检验中心。 本标准主要起草人：姜丹、陈仕平、李云、陈李鑫。 本标准为首次发布。SZDB/Z 124-2015 1 11 基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型检测标准 1 范围范围 本标准规定了基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型的检测对象、受检者资料和样本的采集、实验室工作程序、检测报告、受检者资料和样本的保存、质量控制的要求。 本标准适用于使用第二代测序技术进行 HLA 高分辨分型检测的机构，对外周血、脐血、口腔拭子或全基因组 DNA 进行基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型检测。 2 缩略语缩略语 下列缩略语适合于本标准。 bp：碱基对（base pair） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid） RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid） HLA：人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen） HTS：高通量测序（High-throughput sequencing） NGS：第二代基因测序技术（Next Generation Sequencing） PCR：聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction） Q-PCR：定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） SBT：基于基因测序的分型法（Sequencing Based Typing） SNP：单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms） SSP：特异性序列引物（Specific Squence Primer） A：腺嘌呤（Adenine） T：胸腺嘧啶（Thymine） G：鸟嘌呤（Guanine） C：胞嘧啶（Cytosine） U：尿嘧啶（Uracil） Sanger：双脱氧链终止法 3 术语和定义术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 SZDB/Z 124-2015 2 3.1 HLA 基因 人类白细胞抗原基因，其编码基因位于人类 16 号染色体短臂，长约3600KB，根据功能和产物结构的不同，分成 3 组：经典 HLA 基因、免疫功能相关基因和免疫无关基因。其中经典 HLA 基因与输血和移植急性排斥反应密切关联。因此，对于经典的 HLA 基因进行分型在临床上有重要意义。 3.2 HLA 高分辨分型 即从基因序列水平对 HLA 进行分型的技术，其结果精确到血清学水平后的亚型。HLA 高分辨分型与过去的低分辨分型相比配型速度更快，配型更精确，使得移植排斥反应更小，手术成功率和术后存活率更高。 3.3 第二代测序技术 基于第一代 sanger 测序技术、利用边合成边测序原理，通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA 序列的一种新的测序技术，在 Sanger 等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的 dNTP，当 DNA 聚合酶合成互补链时，每添加一种 dNTP 就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测 DNA 的序列信息。第二代测序技术具有通量高、成本低等特点，能一次并行对几十万到几百万条 DNA 分子进行序列测定。 3.4 碱基对 碱基对是一对相互匹配的碱基，被氢键连接起来，组成碱基对的碱基包括A、T、G、C、U；是形成DNA、RNA单体以及编码遗传信息的化学结构。 3.5 覆盖深度值 用来衡量来源于特定染色体的 DNA 量的值。如 16 号染色体上的覆盖深度值为样本定位到 16 号染色体的 DNA 分子数目与人类基因组上的 16 号染色体上的有效片段数的比值。 4 检测工作程序检测工作程序 4.1 检测对象 临床具有造血干细胞移植、器官移植 HLA 配型需求的供患者，骨髓库、脐血库等有造血干细胞HLA 配型数据入库需求的机构的样本。 4.2 受检者资料和样本的采集、运输与保存 4.2.1 资料收集 4.2.1.1 受检者基本资料：包括受检者个人信息、送检单位信息和受检者当前临床诊断结果。 见附录 A 4.2.1.2 供患关系：亲缘或非亲缘供患关系。 4.2.1.3 检测项目：根据临床需要选择需检测位点。 4.2.1.4 受检者既往病史：包括免疫治疗史和输血史。 SZDB/Z 124-2015 3 11 4.2.2 样本采集、运输与保存 4.2.2.1 外周血样本 4.2.2.1.1 抽血前，除必须服用的药物外不得服用其他药物 （例如化疗药物），以避免或减轻因白细胞的数量较少影响实验结果。 4.2.2.1.2 严格按照无菌操作常规，用静脉穿刺术抽取患者外周血 4mL （2mL/管 2 管） 注入于 EDTA（乙二胺四乙酸）或枸橼酸钠抗凝管中，并缓慢翻转抗凝管让血液与抗凝剂混合。 注：若受检者为血液病患者，且白细胞计数0.5 109/L，至少采集外周血 8mL，无凝血、溶血及污染现象；外周血采集须在输血至少 10 天后方可进行。 4.2.2.1.3 在采血管上粘贴唯一编号标签。 4.2.2.1.4 外周血样本在常温下运输保存不超过 7 天，28条件下保存不超过 15 天， -20可长期储存。样本保存管应完好，无裂管、开盖等泄漏或样本外溢情况。 4.2.2.2 口腔拭子 4.2.2.2.1 当外周血样本检测出现异常或无法解释的结果时，建议将外周血与口腔拭子一并采样检测。对骨髓移植受检者或近期有输血史的受检者，因外周血及其提取的 DNA 样本均可能存在不同程度的干扰，故推荐采集口腔拭子样本对此类受检者进行检测。 4.2.2.2.2 口腔拭子采集前半小时请勿进食、吸烟或嚼口香糖，采样之前先用清水漱口。 4.2.2.2.3 采集时一手持采样拭子/消毒棉签伸入左上部口腔，在口腔侧壁与牙龈交汇处旋转擦拭约15 次后取出采样拭子/消毒棉签。同样的方法在左下、右上、右下颊粘膜处各采集 1 根，清洁通风处风干，每人至少采集 4 根。采集过程中避免用手触及棉签头，以免造成样本污染；勿用力过猛划破内颊粘到血迹，棉签头如有轻微血迹应重新采样。 4.2.2.2.4 将风干后的拭子/棉签装进一次性清洁密封袋，置于洁净容器中，添加干燥剂后密封包装，并于外容器壁上粘贴唯一编号标签。 注：干燥剂不可接触拭子/棉签。 4.2.2.2.5 口腔拭子样本置于常温下运输保存不超过 3 天。 4.2.2.2.6 置于 28条件下可保存 15 天，干燥的拭子长期储存则需置于-20冻存。 4.2.2.3 DNA 样本 4.2.2.3.1 样本质量要求：DNA 总量应10g，浓度50ng/L，OD260/280 值在 1.7-1.9 之间。 4.2.2.3.2 样本包装：保存于 1.5mL EP 管，用封口膜密封，于管壁上粘贴唯一编号标签。保存管应完好，无裂管、开盖等泄漏或样本外溢情况。 注：提取过程应无污染，DNA 储存液成分中不应含有 SDS(十二烷基硫酸钠)等活性剂成份。 4.2.2.3.3 样本运输及保存：采用冰袋或干冰进行低温（低于4）运输，运输时间不超过 7 天。样本在 28存放 15 天，-20可长期保存。 4.2.2.4 脐带血样本 4.2.2.4.1 脐带血样本的采集、运输与保存参见 4.2.2.1 外周血样本的采集、运输和保存。 SZDB/Z 124-2015 4 4.2.2.4.2 脐带血样本量不得低于 1.5mL。 4.2.2.5 其他样本 滤纸样本应保证含有等同于 75L 血样的样本量，一般视为 2-6 斑点/样本。 5 实验室工作程序实验室工作程序 5.1 样本接收 5.1.1 接收样本时核对样本编号及送检单。 5.1.2 检查待检样本状态，根据 4.2.2 要求，对符合要求的样本，接收并登记；对不符合要求的样本，拒收、登记并通知重新采样。 5.2 DNA 提取 5.2.1 使用 DNA 提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作，提取样本中游离的人类全基因组 DNA。 5.2.2 提取过程中，设置阴性对照和重复对照。 5.2.3 提取后的 DNA 置于-20条件下保存 6 个月，或-70长期保存，避免反复冻融。 5.2.4 DNA 浓度要求：DNA 量4g，浓度20ng/L，OD260/280 值在 1.7-1.9 之间。 5.3 目的片段 PCR 扩增 5.3.1 HLA-A、B、C 位点扩增 1-7 号外显子，DRB1 位点扩增 2 号外显子，DQB1 扩增 2-3 号外显子。 5.3.2 PCR 扩增后利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物条带。条带应该明亮清晰，片段大小正确。 5.3.3 PCR 产物混合：按照 A、 B、 C、 DRB1、 DQB1 位点所需数据量将合格的 PCR 扩增产物混合。产物混合后进行 Q-PCR 定量检测，符合要求即为合格。 5.4 文库构建与 DNA 测序 5.4.1 用超声波将 PCR 产物打断成大小均一的片段， 再将 DNA 片段修复成平末端；通过 3 端加碱基“A”使得 DNA 片段与 5 端带有“T”碱基的特殊接头连接，并对连接产物进行纯化。 5.4.2 使用 Agilent 2100 电泳检测文库的片段大小及产量，使用 Q-PCR 仪检测文库产量；根据Q-PCR 结果，对样本进行等物质的量混合。 5.4.3 混合后的文库与光学透明玻璃芯片上的接头杂交，使用第二代高通量测序仪进行 DNA 测序，获得样本碱基序列信息。 5.5 数据分析 HLA 型别数据库采用国际 IMGT/HLA 数据库，通过对测序获得的小片段核酸片段数据进行过滤、组装和比对，获得 HLA 唯一型别。 SZDB/Z 124-2015 5 11 5.6 实验室要求 5.6.1 基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型检测实验室应符合临床基因扩增检验实验室的硬件要求，原则上分为四个单独的工作区域：试剂储存和准备区、样本制备区、扩增区、扩增产物分析区，进入各工作区域应严格遵循从试剂储存和准备区、样本制备区、扩增区至扩增产物分析区的单一方向顺序，避免交叉污染。 5.6.2 数据分析对硬件的要求应满足：数据分析有不低于 32G 的内存（12CPU）节点。 6 检测报告检测报告 6.1 检测报告包含受检者基本信息和送检单位信息。 6.2 检测报告内容包含 HLA-A、B、C、DQB1、DRB1 五位点 4 位数字高分辨型别。 6.3 检测报告注明实验检测方法，并告知结果仅供临床参考。基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型检测标准报告单参见附录 B。 7 受检者受检者资料和样本的保存资料和样本的保存 7.1 受检者资料包括送检单、实验数据记录和实验检测结果，均保存 5 年以上，另有规定的除外。 7.2 受检者样本包括外周血、脐带血和 DNA 样本，可按要求保存期限在 3 年以上。 8 质量控制质量控制 8.1 相关人员应接受生物安全、检测技术等专业培训，持证上岗。 8.2 配备必要的基础设施和适宜的检测环境，对设施和环境进行监控。 8.3 设立阴性和重复对照，确保每次检测的质量。如阴性对照与预期结果不相符时，进行原因分析并采取纠正措施，形成书面记录。 8.4 数据分析结果中各位点纯合子采用其他方法，如双脱氧链终止测序法(Sanger法)或特异性序列引物法（SSP 法），进行方法学复核。 SZDB/Z 124-2015 6 *送检信息送检信息 *送检医师 *送检医师联系方式 *采样日期 *送检单位名称 *检测检测项目项目 HLA 高分5位点（A、B、C、DRB1、DQB1） HLA 高分 A B C DRB1 DQB1 HLA 其他 *姓名 性别 1.男 2.女 *民族 电话 *临床诊断 * 供受者 1.受者 2.供者 亲缘关系 *送检样本类型 关联的受者姓名（注：仅限只有供者样本的情况） 贴条码处 1.外周血 2.口腔试子 3.脐血 4.DNA 5.其他（需注明） 附 录 A （资料性附录） 基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型检测送检单 基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型检测送检单见表 A.1。 表 A.1 基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型检测送检单 基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型检测送检单 SZDB/Z 124-2015 7 本样本用途已由样本提供方告知患者或供者，并已得到患者或供者同意。 1.请如实清楚地填写所需信息： a. *项为必填项；b. *项表示当所送样本仅为供者样本时，须填写相关患者的姓名；c. 对于骨髓库或脐血库样本，请填写入库编号；d. 请在处打“” 。 2.血样、DNA 样本须在 7 天内送达；口腔拭子须在 3 天内送达。 *检测结果发送至检测结果发送至 姓名 传真 地址 * *检测机构检测机构人员填写人员填写 样本接收日期 接 收 人 备 注（对不符合接收标准的样本的描述） 既往史既往史 1. 免疫治疗史 是 否 最近一次免疫治疗日期 放疗 化疗 其他 2. 有无输血 有 无 3. 首次移植 是 否 最近移植日期 表 A.1（续） 基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型检测送检单SZDB/Z 124-2015 8 附录B （资料性附录） 基于第二代测序技术的HLA高分辨分型检测报告单 基于第二代测序技术的 HLA 高分辨分型检测报告单见表 B.1。 表B.1 基于第二代测序技术的HLA高分辨分型检测报告单 报告单编号： 送检医院： 受检者 ID： 送检医师： 送检日期： 样本编号 姓名 性别 年龄 诊断 关系 ABO/RH 样本编号 HLA-A* HLA-B* HLA-C* HLA-DRB1* HLA-DQB1* 注：注： 检测者： 审核者： 报告日期： 注：实验方法为 PCR-SBT-NGS，结果仅供临床参考。 SZDB/Z 124-2015 9 参 考 文 献 1 U. Shankarkumar. The Human Leukocyte Antigen (HLA) System. Int J Hum Genet, 4(2): 91-103 (2004) 2 G. Bentley, R. Higuchi, B. Hoglund. High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing. Tissue Antigens,2009,3403 3 Chunlin Wang. et al. High-throughput, high-fidelity HLA genotyping with deep sequencing 4 C. L. Holcomb. et al. A multi-site study using high-resolution HLA genotyping by next generation sequencing. Tissue Antigens. 77, 206217(2011) 5 Steven G.E.Marsh. Peter Parham.Linda D.Barber HLA factsbook _