花青素-3-葡萄糖苷干预过氧化氢诱导的H9c2细胞损伤的作用机制.pdf

基基基基础础础础医医医医学学学学论论论论著著著著/研研研研究究究究花青素-3-葡萄糖苷干预过氧化氢诱导的 H9c2细胞损伤的作用机制袁晓丽1,江 莉1,黄莉莉1,胡 斌2摘要 目的:探究花青素-3-葡萄糖苷干预过氧化氢(H2O2)诱导的 H9c2 细胞损伤的作用机制。方法:将 H9c2 细胞暴露于不同浓度H2O2中 4、8、12 h 诱导细胞毒性,同时以不同浓度花青素-3-葡萄糖苷处理细胞,并设置阳性对照组(1.5 mg/mL 益气活血颗粒),采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,Hoechst 33342 染色和流式细胞术检测细胞凋亡,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹法检测细胞中解偶联蛋白 2(UCP2)表达,二氢乙锭(DHE)染色检测活性氧(ROS)含量,蛋白免疫印迹法检测 B 淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bax)及切割后半胱天冬酶 3(Cleaved Caspase-3)的表达。结果:600mol/L 的 H2O2处理 4 h 为最佳造模条件,50.00mol/L 为花青素-3-葡萄糖苷最适药物干预浓度。与对照组比较,H2O2组细胞凋亡率、Bax/Bcl-2 及 Cleaved Caspase-3表达明显升高,UCP2 mRNA 及蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P0.05);与 H2O2组比较,H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组和 H2O2+益气活血颗粒组细胞凋亡率、Bax/Bcl-2 及 Cleaved Caspase-3 表达明显降低,UCP2 mRNA 及蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义(P0.05)。shRNA-3 可明显降低细胞中 UCP2 蛋白表达,与 H2O2组比较,H2O2+shRNA-3 组 UCP2、Bcl-2 蛋白表达明显降低,Bax、Cleaved Caspase-3 蛋白表达及 ROS 含量明显升高,差异均有统计学意义(P0.05);与 H2O2+shRNA-3 组比较,花青素-3-葡萄糖苷处理后 UCP2、Bcl-2 蛋白表达明显升高,Bax、Cleaved Caspase-3 蛋白表达 ROS 含量明显降低,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:花青素-3-葡萄糖苷对 H2O2诱导的 H9c2 细胞凋亡有显著的保护作用,其机制可能与上调 UCP2 表达,从而降低 Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3 表达,清除 ROS 有关。关键词 H9c2 心肌细胞;氧化损伤;花青素-3-葡萄糖苷;细胞凋亡;活性氧;实验研究d o i:1 0.1 2 1 0 2/j.i s s n.1 6 7 2-1 3 4 9.2 0 2 3.1 7.0 0 8 P Pr ro ot te ec ct ti iv ve e E Ef ff fe ec ct t o of f A An nt th ho oc cy ya an ni in n-3 3-g gl lu uc co os si id de e i in n H H9 9c c2 2 C Ce el ll ls s I In nj ju ur ry y I In nd du uc ce ed d b by y H Hy yd dr ro og ge en n P Pe er ro ox xi id de eY YU UA AN N X Xi ia ao ol li i,J JI IA AN NG G L Li i,H HU UA AN NG G L Li il li i,H HU U B Bi in nMianyang Central Hospital,Mianyang 621000,Sichuan,ChinaC Co or rr re es sp po on nd di in ng g A Au ut th ho or r HUANG Lili,E-mail:A Ab bs st tr ra ac ct t O Ob bj je ec ct ti iv ve e:To explore the mechanism of anthocyanin-3-glucoside in H9c2 cells injury induced by hydrogen peroxide(H2O2).MMe et th ho od ds s:H9c2 cells were exposed to different concentrations of H2O2for 4,8,and 12 h to induce cytotoxicity.At the same time,theywere treated with different concentrations of anthocyanin-3-glucoside.Positive control group(1.5 mg/mL Yiqi Huoxue Granules)wasset up.The survival rate of cells was detected by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT).Apoptosis was detected by Hoechst 33342 stainingand flow cytometry.The expression of uncoupling protein 2(UCP2)in cells was detected by real-time fluorescent quantitative PCR andWestern blot.The contents of reactive oxygen species(ROS)were detected by dihydroethidium(DHE)staining.The expressions of B-celllymphoma-2(Bcl-2),Bcl-2 associated X protein(Bax),and cleaved cysteine aspartase-3(Cleaved Caspase-3)were detected by WesternBlot.R Re es su ul lt ts s:600mol/L H2O2treatment for 4 h was the best modeling condition,and 50mol/L anthocyanin-3-glucoside was theoptimal drug intervention concentration.Compared with control group,apoptosis rate,Bax/Bcl-2,and Cleaved Caspase-3 weresignificantly increased in H2O2group,while expressions of UCP2 mRNA and protein were significantly decreased(P0.05).Comparedwith H2O2group,apoptosis rate,Bax/Bcl-2,and Cleaved Caspase-3 were significantly decreased in H2O2+anthocyanin-3-glucosidegroup and H2O2+Yiqi Huoxue granule group,while expressions of UCP2 mRNA and protein were significantly increased(P0.05).The shRNA-3 could significantly reduce the expression of UCP2 in cells.Compared with H2O2group,the expressions of UCP2 andBcl-2 were significantly decreased in H2O2+shRNA-3 group,expressions of Bax and Cleaved caspase-3,and ROS contents weresignificantly increased(P0.05).Compared with H2O2+shRNA-3 group,expressions of UCP2 and Bcl-2 were significantly increasedafter anthocyanin-3-glucoside treatment,expressions of Bax and Cleaved Caspase-3,and ROS contents were significantly decreased(P98%,武汉前衍化学科技有限公司),益气活血颗粒(弘美制药有限公司,国药准字Z20030092),噻唑蓝(MTT)粉末、RIPA 裂解液、增强型化学发 光 试 剂(ECL)盒、二 氢 乙 锭(DHE)活 性 氧(ROS)荧光探针购自上海碧云天生物科技有限公司,Hoechst 33342 荧光染料(美国 MCE),V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)细胞凋亡检测 试剂盒(美 国BD),-actin 鼠单克隆抗体、解偶联蛋白 2(UCP2)、Bcl-2、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bax)及切割后半胱天冬酶 3(Cleaved Caspase-3)兔 多 克 隆 抗 体 购 自 美 国 CellSignaling,Trizol 试剂(美国 Ambion Life Technology),逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒购自美国 Invitrogen。1.2 方法1.2.1 造模条件及给药浓度的筛选取 H9c2 细胞接种于 96 孔板,于 37的 5%CO2增湿培养箱中培养过夜,分别加入 0、100、200、300、400、500、600、700mol/L 的 H2O2处理 4、8、12 h 建立心肌细胞损伤模型,并设置对照组(加入不含 H2O2的培养基),加入 MTT 溶液 100L,继续培养 4 h,弃上清后加入 150L 二甲基亚砜溶液,37震荡 10 min,490 nm 处检测吸光度值,计算细胞存活率(试验孔吸光度值/对照组吸光度值100%)。取 H9c2 细胞接种于 96 孔板,过夜培养后,分别加入 0、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00mol/L 花青素-3-葡萄糖苷,常规培养 24 h,经 MTT 法观察细胞存活情况。1.2.2 细胞分组1)将 H9c2 细胞分为对照组、H2O2组、H2O2+益气活血颗粒组(1.5 mg/mL)及 H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组,观察花青素-3-葡萄糖苷对 H2O2诱导心肌细胞损伤的影响。2)将 H9c2 细 胞 分 为 NC 组、短 发 夹RNA(shRNA)-1 组、shRNA-2 组、shRNA-3 组,以UCP2 为靶标的 shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3 及阴性对 照 物 转 入 细 胞,shRNA-1 正 向 引 物 序 列:5-GGGATCCTGGAACGTAGTAAT-3,反 向 引 物 序 列:5-ATTACTACGTTCCAGGATCCC-3;shRNA-3 正 向引物序列:5-TGGCCTCTACGACTCTGTAAA-3,反向引物序列:5-TTTACAGAGTCGTAGAGGCCA-3;shRNA-3正向引物序列:5-TGTGGTCAAGACGAGATATAT-3,反向 引 物 序 列:5-ATATATCTCGTCTTGACCACA-3。采用实时荧光定量 PCR 检测 UCP2 mRNA 水平,筛选最优 shRNA 序列。3)将 H9c2 细胞分为对照组、H2O2组、H2O2+NC 组、H2O2+shRNA-3 组、H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组、H2O2+NC+花青素-3-葡萄糖苷组、H2O2+shRNA-3+花青素-3-葡萄糖苷组,观察 UCP2在花青素-3-葡萄糖苷影响 H2O2诱导心肌细胞损伤中的作用。1.2.3 细胞凋亡检测采用 Hoechst 33342 染色和流式细胞术检测细胞凋亡。1)Hoechst 33342 染色法:让玻片浸于细胞培养基内,取各组细胞爬片,滴加少量 Hoechst 33342 染料覆盖细胞,室温染色 5 min,吸弃 Hoechst 33342 染料,并用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗 3 次,封片后荧光显微镜下观察,凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或破碎状致密浓染。2)流式细胞术:收集各组细胞,离心后加入 PBS 洗涤细胞,分别添加膜联蛋白 V(Annexin)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染料、结合缓冲液,混匀培养 15 min,再上流式细胞仪检测细胞凋亡。1.2.4 实时荧光定量 PCR 检测 UCP2 mRNA 水平收集各组细胞,用 Trizol 试剂提取细胞中 RNA,经逆转录试剂盒合成 cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因,采用实时荧光定量 PCR 试剂盒对 UCP2 进行扩增。实时荧光定量 PCR 反应条件:95预变性 2 min,95变性 15 s,60退火 30 s,共38 个 循 环。UCP2 正 向 引 物 序 列:5-GCACTGT-CGAAGCCTACAAGAC-3,反向引物序列:5-TGGCAT-TTCGGGCAACAT-3。GAPDH 正向引物序列:5-TCAAG-AAGGTGGTGAAGCAG-3,反向引物序列:5-CCCTGT-TGCTGTAGCCAAAT-3。1.2.5 蛋白免疫印迹法检测相关蛋白表达收集各组细胞,用 RIPA 裂解液提取总蛋白,测定蛋白浓度后,制备变性蛋白样品,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分 离、转 膜 后,取 出 聚 偏 二 氟 乙 烯(PVDF)膜浸于 5%脱脂牛奶中,室温封闭 2 h,分别加入一抗-actin 鼠单克隆抗体(11 000)、Bcl-2(11 000)、Bax(11 000)、Cleaved Caspase-3(11 000)、UCP2(11 000)兔多克隆抗体,4冷藏过夜,再分别加入二抗牛抗鼠(15 000)、牛抗兔(11 000)IgG-HRP,37摇床孵育 45 min,加入 ECL 发光试剂显影。应用 Image J1.8.0 软件检测蛋白条灰度值,以-actin 为内参,计算 Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、UCP2 相对表达量。1.2.6 DHE 染色检测 ROS 含量7413中西医结合心脑血管病杂志2 0 2 3年9月第2 1卷第1 7期 将 DHE ROS 荧光探针以 5mol/L 浓度加入细胞中,37避光下培养 30 min,荧光显微镜下观察 DHE荧光情况。1.3 统计学处理应用 SPSS 17.0 软件进行统计分析。符合正态分布的定量资料以均数标准差(xs)表示,多组均数采用单因素方差分析比较,组间两两比较采用 LSD 检验。以P0.05),而 200mol/L 时细胞存活率明显降低(P0.05)。分别以 6.25100.00mol/L 浓度花青素-3-葡萄糖苷处理心肌损伤细胞,50.00mol/L 浓度的花青素-3-葡萄糖苷显示出对 600mol/L 的 H2O2处理 4 h引起的细胞毒性诱导的最高抑制作用,故选取无细胞毒性的 50mol/L 浓度为后续花青素-3-葡萄糖苷实验浓度。详见图 3。形态学观察发现,对照组中的细胞似乎具有完整的包装膜、正常的纺锤形和圆形细胞核,而相比之下,在 H2O2模型中,细胞表现出不完整的细胞膜、肿胀和退化的空泡。花青素-3-葡萄糖苷处理使细胞形态保持良好,细胞膜完整,细胞核圆整。详见图 4。图 1 造模条件筛选(与 0mol/L 比较,*P0.05)图 2 花青素-3-葡萄糖苷给药浓度筛选(与 0mol/L 比较,*P0.05)图 3 花青素-3-葡萄糖苷对 H2O2诱导H9c2 细胞毒性的影响(H2O2组与对照组比较,*P0.05;与 H2O2组比较,#P0.05,P0.01)图 4 花青素-3-葡萄糖苷对 H2O2诱导 H9c2 细胞形态的影响(红色箭头表示细胞收缩、膜破碎或细胞质中出现空泡。a 为对照组;b 为 H2O2组;c 为 H2O2+益气活血颗粒组;d 为 H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组)8413CH I N E S EJ OURNA LO FI N T E G R AT I V E ME D I C I N EONC AR D I O-C E R E B ROVA S C U L ARD I S E A S E S e p t e m b e r 2 0 2 3 V o l.2 1 N o.1 72.2 花青素-3-葡萄糖苷对 H2O2诱导的 H9c2 细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响与对照组比较,H2O2组细胞凋亡率、Bax/Bcl-2 及Cleaved Caspase-3 表 达 明 显 升 高(P0.05);与H2O2组比较,H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组和 H2O2+益气活血颗粒组细胞凋亡率、Bax/Bcl-2 及 CleavedCaspase-3 表达明显降低(P0.05)。详见图 5图 7。图 5 Hoechst 33342 染色检测 H9c2 细胞凋亡(A 为 Hoechst 33342 染色图;B 为各组 H9c2 细胞凋亡率柱状图。a 为对照组;b 为 H2O2组;c 为 H2O2+益气活血颗粒组;d 为 H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组。H2O2组与对照组比较,*P0.05;与 H2O2组比较,#P0.05)图 6 流式细胞术检测 H9c2 细胞凋亡(A 为流式细胞术检测图;B 为各组 H9c2 细胞凋亡率柱状图。a 为对照组;b 为 H2O2组;c 为 H2O2+益气活血颗粒组;d 为 H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组。H2O2组与对照组比较,*P0.05;与 H2O2组比较,#P0.05)图 7 各组 H9c2 细胞中凋亡相关蛋白表达比较(A 为各组 H9c2 细胞中凋亡相关蛋白表达条带图;B 为各组 H9c2 细胞中凋亡相关蛋白表达柱状图。a 为对照组;b 为 H2O2组;c 为 H2O2+益气活血颗粒组;d 为 H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组。H2O2组与对照组比较,*P0.05;与 H2O2组比较,#P0.05)9413中西医结合心脑血管病杂志2 0 2 3年9月第2 1卷第1 7期2.3 花青素-3-葡萄糖苷对 H2O2刺激后 H9c2 细胞线粒体 UCP2 表达的影响与对照组比较,H2O2组细胞中 UCP2 mRNA 及蛋白表达明显降低(P0.05);与 H2O2组比较,H2O2+花青 素-3-葡 萄 糖 苷 组 和 H2O2+益 气 活 血 颗 粒 组UCP2 mRNA 及蛋白表达明显升高(P0.05)。详见图 8、图 9。图 8 各组 H9c2 细胞中 UCP2 蛋白表达比较(A 为各组 H9c2 细胞中 UCP2 蛋白表达条带图;B 为各组 H9c2 细胞中 UCP2 蛋白表达柱状图。a 为对照组;b 为 H2O2组;c 为 H2O2+益气活血颗粒组;d 为 H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组。与对照组比较,*P0.05;与 H2O2组比较,#P0.05)图 9 各组 H9c2 细胞中 UCP2 mRNA 表达比较(a 为对照组;b 为 H2O2组;c 为 H2O2+益气活血颗粒组;d 为 H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组。与对照组比较,*P0.05;与 H2O2组比较,#P0.05)2.4 花青素-3-葡萄糖苷通过调节 UCP2 表达减轻心肌细胞凋亡与 NC 组比较,shRNA-2 组和 shRNA-3 组 UCP2蛋白表达明显降低(P0.05 或P0.01),以 shRNA-3组降低最为显著,以此为实验序列。与对照组比较,H2O2组和 H2O2+NC 组 UCP2、Bcl-2 蛋白表达明显降低(P0.05),Bax、Cleaved Caspase-3 蛋白表达明显升高(P0.05);与 H2O2组比较,H2O2+shRNA-3组UCP2、Bcl-2蛋白表达明显降低(P0.05),Bax、Cleaved Caspase-3 蛋白表达明显升高(P0.05);与H2O2+shRNA-3 组比较,H2O2+NC+花青素-3-葡萄糖苷组和 H2O2+shRNA-3+花青素-3-葡萄糖苷组UCP2、Bcl-2 蛋 白 表 达 明 显 升 高(P0.05),Bax、Cleaved Caspase-3 蛋白表达明显降低(P0.05)。详见图 10图 12。图 10 各组 UCP2 蛋白表达比较(A 为蛋白免疫印迹法检测 UCP2 蛋白表达;B 为各组 UCP2 蛋白表达柱状图。a 为 NC 组;b 为 shRNA-1 组;c 为 shRNA-2 组;d 为 shRNA-3 组。与 NC 组比较,*P0.05,#P0.01)0513CH I N E S EJ OURNA LO FI N T E G R AT I V E ME D I C I N EONC AR D I O-C E R E B ROVA S C U L ARD I S E A S E S e p t e m b e r 2 0 2 3 V o l.2 1 N o.1 7图 11 蛋白免疫印迹法检测 UCP2 及凋亡相关蛋白表达(a 为对照组;b 为 H2O2组;c 为 H2O2+NC 组;d 为 H2O2+shRNA-3 组;e 为 H2O2+NC+花青素-3-葡萄糖苷组;f 为 H2O2+shRNA-3+花青素-3-葡萄糖苷组)图 12 各组 UCP2 及凋亡相关蛋白表达比较(A 为各组 UCP2 蛋白表达;B 为各组 Bcl-2 蛋白表达;C 为各组 Bax 蛋白表达;D 为各组 Cleaved Caspase-3 蛋白表达。a 为对照组;b 为 H2O2组;c 为 H2O2+NC 组;d 为 H2O2+shRNA-3 组;e 为 H2O2+NC+花青素-3-葡萄糖苷组;f 为 H2O2+shRNA-3+花青素-3-葡萄糖苷组。H2O2组、H2O2+NC 组与对照组比较,*P0.05;与 H2O2组比较,#P0.05;与 H2O2+shRNA-3 组比较,P0.05)2.5 花青素-3-葡萄糖苷通过调节 UCP2 表达降低ROS 含量与对照组比较,H2O2组和 H2O2+NC 组 ROS 含量明 显 升 高(P0.05);与 H2O2组 比 较,H2O2+shRNA-3 组 ROS 含量明显升高(P0.05);与 H2O2+shRNA-3 组比较,H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组、H2O2+NC+花青素-3-葡萄糖苷组和 H2O2+shRNA-3+花青素-3-葡萄糖苷组 ROS 含量明显降低(P0.05)。详见图 13、图 14。1513中西医结合心脑血管病杂志2 0 2 3年9月第2 1卷第1 7期图 13 DHE 染色检测 ROS 含量(a 为对照组;b 为 H2O2组;c 为 H2O2+NC 组;d 为 H2O2+shRNA-3 组;e 为 H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组;f 为 H2O2+NC+花青素-3-葡萄糖苷组;g 为 H2O2+shRNA-3+花青素-3-葡萄糖苷组)图 14 各组细胞中 ROS 含量比较(a 为对照组;b 为 H2O2组;c 为 H2O2+NC 组;d 为 H2O2+shRNA-3 组;e 为 H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组;f 为 H2O2+NC+花青素-3-葡萄糖苷组;g 为 H2O2+shRNA-3+花青素-3-葡萄糖苷组。H2O2组、H2O2+NC 组与对照组比较,*P0.05;与 H2O2组比较,#P0.05;与 H2O2+shRNA-3 组比较,P0.05)3 讨 论H9c2 心肌细胞分离自大鼠,不仅其形态特征与原代心肌细胞相似,而且还保留了大鼠心肌细胞功能特征,是理想的心血管疾病模型载体 6。H2O2是一种重要的 ROS,可诱导细胞系或原代细胞的凋亡,在不同的研究中有不同的使用剂量 7-8。本研究观察不同浓度和不同作用时间的 H2O2对 H9c2 细胞存活的影响,结果显示,随着 H2O2浓度升高、作用时间延长,细胞的存活率越低,表明 H2O2对 H9c2 细胞的毒性具有时间、浓度依赖性,故选择对细胞损伤程度适中的 600mol/L 的 H2O2处理 4 h 建立心肌细胞损伤模型。对花青素-3-葡萄糖苷给药浓度的筛选结果显示,6.25100.00mol/L 浓度花青素-3-葡萄糖苷处理后细胞存活率无明显变化,而 200mol/L 浓度花青素-3-葡萄糖苷处理后细胞存活率明显降低,为避免药物本身对细胞造成的损伤,同时保证药效,故选取无细胞毒性的50.00mol/L 浓度为后续花青素-3-葡萄糖苷实验浓度。本研究结果显示,H9c2 心肌细胞暴露 于 H2O2后,细胞凋亡率升高,给药后细胞凋亡率明显降低,提示花青素-3-葡萄糖苷可抑制细胞凋亡,对心肌细胞具有保护作用。Wu 等 9研究显示,花青素-3-葡萄糖苷对紫外线诱导的原代人真皮成纤维细胞形态学改变、氧化损伤和凋亡有明显的抑制作用。Bcl-2 家族蛋白是细胞凋亡的重要调控因子,根据功能可分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白,Bax 是促凋亡蛋白,正常细胞中 Bax 以单体形式分布于细胞质,当细胞凋亡信号激活时,会改变线粒体膜电位和通透性,诱导凋亡活性物质细胞色素 C 的释放 10。Bcl-2 作为典型的抗凋亡蛋白,主要分布于线粒体外膜,可结合Bax 形成异源二聚体,阻止 Bax 的释放而发挥抗凋亡作用,同时,Bcl-2 过表达还可介导氧化应激而保护细胞 11。Caspase-3 是细胞凋亡的执行者,可直接降解结构蛋白和功能蛋白,在线粒体途径的细胞凋亡中起关键作用 12。Wei 等 13通过肾小管细胞 HK-2 的体外实验显示,花青素-3-葡萄糖苷可抑制 ROS 生成、细胞凋亡、Cleaved Caspase-3、Bax/Bcl-2,并增强线粒体释放细胞色素 C 的表达,保护汞诱导的糖尿病肾损伤。2513CH I N E S EJ OURNA LO FI N T E G R AT I V E ME D I C I N EONC AR D I O-C E R E B ROVA S C U L ARD I S E A S E S e p t e m b e r 2 0 2 3 V o l.2 1 N o.1 7本研究中,经 H2O2作用后细胞中 Bax/Bcl-2、CleavedCaspase-3 表达上升,花青素-3-葡萄糖苷处理后可逆转上述凋亡蛋白的表达,提示花青素-3-葡萄糖苷抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡,可能与下调 Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3 表达有关。解偶联蛋白家族是线粒体内膜上的转运蛋白,可减少三磷酸腺苷(ATP)和 ROS 的产生,其中 UCP2 是研究最为广泛的成员 14。细胞中 ROS 大多来自于线粒体电 子 传 递 链,其 生 成 与 质 子 跨 膜 势 能 密 切 相关 15。UCP2 可通过参与质子渗漏、降低质子势能,促进氧消耗,减少呼吸链电子传递,从而减少 ROS 的产生,保护机体的过氧化损伤 16。本研究发现,H2O2诱导后细胞中 UCP2 表达明显降低,ROS 含量明显升高;花青素-3-葡萄糖苷可通过提高 UCP2 表达,减少ROS,且这种作用可被靶向 UCP2 的 shRNA 所阻断。故推测花青素-3-葡萄糖苷的保护作用可能部分依赖于 UCP2 来抑制 H2O2诱导的 H9c2 细胞氧化应激损伤和细胞凋亡。综上 所 述,花 青 素-3-葡 萄 糖 苷 可 能 通 过 上 调UCP2 表 达,降 低 Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3 表达,清除 ROS,从而发挥抗 H2O2诱导的 H9c2 细胞氧化应激损伤和细胞凋亡,从而发挥心肌细胞保护作用。参考文献:1 SOLIMAN G A.Dietary fiber,atherosclerosis,and cardiovasculardisease J.Nutrients,2019,11(5):1155.2 STEVEN S,FRENIS K,OELZE M,et al.Vascular inflammation andoxidative stress:major triggers for 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