红景天苷对慢性低氧后冻伤大鼠血管内皮细胞的保护作用.pdf

红景天苷对慢性低氧后冻伤大鼠血管内皮细胞的保护作用王洪瑾，李毅，冯艳萍，张科伟，彭毛东智（青海大学附属医院烧伤整形科，西宁 ）【摘要】目的：研究红景天苷对慢性低氧后冻伤大鼠血管内皮细胞的保护作用。方法：健康雄性 大鼠，随机分为 组（）：假伤组，模型组，模型 红景天苷组。各组大鼠置于复合低压舱内，设置舱内压力为 ，温度为 。大鼠在此条件下低氧暴露 ，期间模型 红景天苷组大鼠每日灌服 红景天苷。大鼠从低压舱中取出后，除了假伤组以外，均使用冷冻过的铁片紧贴大鼠背部 ，辅以低温进行冻伤造模。造模后 采集血液及皮肤组织进行试验。观察冻伤区域组织与血管内皮细胞结构变化；检测血管内皮细胞微粒 水平；检测血管内皮细胞损伤标示物 、水平与 分泌情况；检测 、及 表达水平。结果：红景天苷有效减轻冻伤区域皮肤塌陷现象。改善皮下组织坏死及炎性细胞浸润情况。减少血管内皮细胞自噬。与模型组（）相比，模型 红景天苷组（）显著增强 表达（）。并且 含量（）也显著高于模型组（）（），含量（）低于模型组（）（），、含量无明显差异。红景天苷显著降低冻伤大鼠血管内皮细胞 、及 蛋白表达（）。结论：红景天苷可减轻血管内皮细胞损伤，减少血管内皮细胞自噬，促进血管内皮细胞再生。红景天苷基于 通路对慢性低氧后冻伤大鼠血管内皮细胞具有良好的保护作用而降低冻伤组织的损伤。【关键词】红景天苷；冻伤；大鼠；血管内皮细胞；【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）【】，（，）【】：，：，（），（）（），（）（）（），（）（）（），（）：，【】；，（）【基金项目】国家自然科学基金项目（）；青海省科学技术协会中青年托举工程项目（）；青海大学附属医院中青年科研基金项目（）【收稿日期】【修回日期】【通讯作者】：；：冻伤是由于组织暴露在低于零度的温度下足够长的时间时，受影响的组织中形成冰晶，从而导致组织的急性冻结。冻伤损伤临床表现主要为损伤皮肤部分的感觉丧失、变色发绀，可能出现水泡和水肿。冻伤根据损伤性质分为冻结性冻伤和非冻结性冻伤两类，根据损害程度分为 度，包括损伤表皮层的 度冻伤，损伤真皮层的 度冻伤，损伤全皮层的 度冻伤 。冻伤的治疗主要根据 诊疗原则，首先需要提高身体的核心温度进行复温。使用抗血栓剂或外用芦荟胶预防血管内的血栓形成。若已经形成血栓，需要通过静脉或动脉内途径使用溶栓剂对受影响的部位进行保守治疗。冻伤的后遗症包括疼痛、不耐寒和骨骺畸形，需要保持长期随访进行评估，观察是否出现软骨损伤或骨吸收的情况 。冻伤常常发生在高原地区等经常暴露在极度寒冷天气的人群中。高海拔造成的低气压、低温及低氧的状态，会引起机体血液粘稠度增加，形成微循环内血栓，最后造成组织缺血性损伤 。轻者出现皮肤损伤，重者需截肢或并发肺水肿、脑水肿死亡。此时冻伤患者的血液微循环恢复速度远低于普通冻伤 。对于轻伤者，除保暖措施外，消炎，改善微循环都是基本治疗原则。对于重伤者，会采用全身使用抗生素、扩张血管及镇痛等治疗方法。但是无论是表面复温还是用药等均不能达到理想的治疗效果，且用药有较多的副作用 ，。因此，寻找能够预防和保护慢性低氧后冻伤的靶向治疗方法极为重要。低压低氧的环境造成机体缺氧或损伤的过程中，血管内皮细胞是首先及最易损伤的部位，常发生功能紊乱 。通路主要参与细胞增殖、分化及迁移等生理过程 。研究发现，一些抗缺氧药物可能通过激活 通路，有效减轻多种组织细胞的缺氧损伤 。红景天素有“高原人参”美称，其活性成分红景天苷具有保护血管，改善微循环的作用 。冻伤引起的微循环损伤同样会损伤调节血管张力的血管内皮细胞，红景天苷保护血管内皮细胞的具体机制还未得到充分研究。因此，本文将探讨红景天苷对慢性低氧后冻伤大鼠血管内皮细胞的保护作用。材料与方法 实验动物 级健康雄性 大鼠 只，体质量（），周龄。购于成都达硕生物科技有限公司，生产许可证号：（川）。适应性喂养一周后用于实验。所有的实验程序都得到青海大学附属医院科研伦理委员会的批准和同意（编号：）。主要试剂和仪器红景天苷 纯度 ，购于北京百灵威科技有限公司。检测试剂盒、检测试剂盒、检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；大鼠细胞间黏附分子 检测试剂盒，大鼠一氧化氮（）检测试剂盒，均购自深圳子科生物科技有限公司；透射电子显微镜：，日本电子（）；徕卡组织处理机：，徕卡；玻璃制刀机：，徕 卡；超 薄 切 片 机：，徕 卡；型酶标仪，美谷分子仪器有限公司；垂直电泳仪：上海天能科技有限公司；分析型流式细胞仪：，。分组及给药 只 大鼠分为 组，每组 只。假伤组和模型组在低压舱喂养过程中不做处理；模型 红景天苷组每只大鼠在低压低氧暴露期间，每天灌服给药 。组大鼠从复合低压舱中取出后，假伤组不再做冻伤处理，模型组和模型 红景天苷组 大鼠进行冻伤处理，处理方法如 所示。慢性低氧后冻伤模型建立冻伤模型建立方法参照焦明克 。具体如下：大鼠置于大型复合低压舱，设置压力为 ，温度为 ，湿度为 ，期间动物自由饮食。各组大鼠低压低氧暴露 ，然后将大鼠取出固定。用 的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，于背部两侧进行脱毛处理，形成一块区域的裸露皮肤。直径 的铁片浸入 纯化水和 无水乙醇混合的 的低温恒温槽内进行冷冻，而后将铁片取出，紧贴于大鼠背部脱毛处冷冻 ，移除铁片。造模后 采集各组大鼠的血液，并处死部分大鼠采集冻伤区域皮肤组织用于后续研究。采集标本经腹主动脉采血，离心得到血浆置于 保存备用；取冷冻区组织块，一部分标本用中国应用生理学杂志，（）于 染色，一部分标本经戊二醛锇酸双固定，乙醇，丙酮系列脱水，包埋。先切厚片定位，再切超薄片，经醋酸铀，柠檬酸铅复染，供电镜观察。红景天苷对大鼠冻伤皮肤外观表现的影响观察大鼠在移除冻伤因素 后，各组大鼠冻伤区域皮肤组织形态变化。红景天苷对血管内皮细胞结构的影响大鼠于复合低压舱给药 又给予冻伤处理后 后处死，剥离冻伤区组织，进行 染色，用于观察冻区组织血管内皮细胞病理学变化，并进行透射电镜观察冻区组织血管内皮细胞超微结构的变化。红景天苷对血管内皮细胞功能的影响流式细胞术检测血管内皮细胞微颗粒（，）水平，参照 等的实验方法 。检测血管内皮细胞损伤标志物，包括细胞间黏附分子 （，）、可溶性血管内皮细胞蛋白 受体（，）、血管性血友病因子（，）、内皮素 （，）和 含量。红景天苷对 、及 表达的影响检测血管内皮细胞 、及 蛋白表达水平。统计学处理采用 软件进行作图与统计，单组之间用 方法进行比较，多组之间比较用 ，多组两两比较用 法。结果 红景天苷对慢性低氧后冻伤大鼠皮肤形态的影响如图 所示，假伤组大鼠皮肤红润，皮肤表面无任何损伤，无变色，无肿胀。在移除冻伤因素 后，模型组冻伤区域皮肤组织呈现粉红色，与旁边正常皮肤组织形成鲜明色差，冻伤区域皮肤肿胀现象明显。模型 红景天苷组冻伤区域皮肤组织呈现粉白色，与旁边正常皮肤组织有一定色差，冻伤区域皮肤肿胀现象不明显，与模型组大鼠形成鲜明对比。红景天苷对慢性低氧后冻伤大鼠皮肤血管内皮细胞结构的影响 假伤组、模型组与模型 红景天苷组冻伤区域组织 染色结果假伤组大鼠皮肤组织表皮、真皮及皮下组织分层较为明显。表皮组织主要由复层鳞状上皮组成，角化明显，排列较为松散。真皮内致密胶原纤维交错排列，可见毛囊、皮脂腺等皮肤附属器，未见明显变性坏死。皮下脂肪及肌肉组织排列较为整齐。模型组大鼠皮肤表皮、真皮及皮下组织大面积坏死。表皮复层鳞状上皮坏死缺失，真皮内胶原纤维溶解，基本形态结构模糊，皮下肌肉组织坏死及伴纤维组织增生，局部区域可见少量炎细胞浸润。模型组 红景天苷组大鼠的皮肤组织表皮、真皮及皮下组织结构为完整；局部表皮及真皮轻微坏死，真皮内胶原排列较为松散（图 ）。（）假伤组、模型组与模型组 红景天苷冻伤区域组织透射电镜观察假伤组细胞核，线粒体，粗面内质网完整，有线粒体肿胀现象；模型组有明显自噬现象和线粒体肿胀现象；模型组 红景天苷组除线粒体肿胀外无其他异常，逆转了模型组中出现的自噬现象（图 ）。红景天苷对慢性低氧后冻伤大鼠血管内皮细胞功能的影响 流式细胞术检测 水平流式细胞术检测各组血浆中表面抗原表达 的 ，（）水平，结果显示模型组 表达水平相比于假伤组显著降低（），模型 红景天苷组与模型组相比，的表达水平显著上调（，图 ）。组之中，模型 红景天苷的 的表达水平最高（），显著高于模型组（）（）。血管内皮细胞损伤标志物与 表达结果显示在假伤组、模型组与模型 红景天苷组中，假伤组与模型组相比，模型组 表达显著上调（）；而模型组与模型 红景天苷组相比，模型 红景天苷组 表达显著下调（）；假伤组与模型 红景天苷组在 表达无明显差异（）。、与 在假伤组、模型组与模型 红景天苷组的表达互相之间没有明显差异（，表 ）。在 表达水平方面，模型组对比假伤组表达显著下调（），模型 红景天苷组对比模型组 表达显著提高（，表 ）。（珋 ，）（）（）（）（）（）：；：；：；：，；，红景天苷对慢性低氧后冻伤大鼠 通路的作用检测 通路相关蛋白表达水平，模型组相较于假伤组，、及 蛋白表达水平均显著升高（，图 ，表 ）；模型 红景天苷组相较于模型组，所有蛋白表达水平均显著下降（）。，（珋 ，）；讨论高原冻伤是最常见的冻伤 ，主要原因是低压低氧低温的环境造成机体缺氧和寒冷，导致血细胞体积、粘度和小血管堵塞增加 。低压低氧条件造成机体缺氧或损伤的过程中，血管内皮是首先及最易损伤的部位。在冻融过程中血管内皮细胞遭受严重损伤，而血管内皮细胞损伤后分泌的花生四烯酸中国应用生理学杂志，（）等代谢产物又会进一步损伤血管内皮细胞，使冻伤愈加严重 。因此，治疗慢性低压低氧后冻伤的主要原则在于改善血管内皮细胞损伤。目前市面上应对低氧、低压及低温的中成药物主要为红景天系列产品。从红景天中提取的红景天苷具有显著的抗炎活性与舒张血管，改善微循环的效果 ，但是其药理机制尚不完全清楚。本研究通过大型复合低压舱模拟低压低氧的环境，同时辅以低温对 大鼠进行冻伤造模，探讨红景天苷对血管内皮细胞的保护作用。结果显示，红景天苷能明显消除冻伤带来的表皮与真皮组织坏死和纤维组织增生现象，并有效抑制血管内皮细胞自噬，红景天苷预防慢性低氧后冻伤的效果显著。当血管内皮细胞激活或凋亡时，一种直径在 的无核微小囊泡状物质由血管内皮细胞从表面释放，即血管内皮细胞微粒（）。具有促进血管内皮细胞增殖，推进血管内皮细胞新陈代谢的作用 。本研究发现红景天苷能显著逆转冻伤导致的 显著降低现象。红景天苷在提高 水平的同时促进血管内皮细胞的再生，保证血管内皮细胞的完整性。此外，常见的血管内皮 细 胞 损 伤 标 示 物 还 有 细 胞 间 黏 附 分 子（）、可 溶 性 血 管 内 皮 细 胞 蛋 白 受 体（）、血管性血友病因子（）和内皮素（）。是血管内皮细胞损伤中最灵敏的标示物，流式细胞结果显示，红景天苷的治疗使冻伤大鼠 表达显著下降。一氧化氮（）同样由血管内皮细胞分泌，用于激活血管平滑肌内的鸟苷酸环化酶，增高 浓度并引起血管舒张 。在冻伤后，的表达显著降低，而红景天苷治疗后明显升高 的含量。上述结果表明红景天苷对血管内皮细胞的保护作用，并具有一定的舒血管作用，这对慢性低氧后冻伤的恢复至关重要。低氧诱导因子是介导机体低氧反应的重要转录因子，研究显示 ，低氧诱导因子 （）调控的信号途径及蛋白表达是造成血管通透性增加的潜在因素。低氧刺激下的 能够增强 基因表达和蛋白合成增加 。血管内皮生长因子（）高度特异性地作用于血管内皮细胞，可以调节新生血管的生长，诱导血管内皮细胞增殖、迁移 。研究发现，在一氧化氮长期抑制的大鼠模型中，若 持续增高，可能导致血管形成和血管通透性增加，最后导致动脉粥样硬化的发生 。在本研究中，红景天苷的治疗可以显著降低慢性低氧后冻伤模型大鼠皮肤组织中 和 的表达量，说明红景天苷逆转了慢性低氧后冻伤大鼠的血管内皮细胞损伤、血管通透性增加及新生血管生成等变化。通路广泛参与细胞增殖、分化和血管生成等多种过程 。等 研究发现，信号通路参与血管生成，且 通路与 之间有着密切联系 。等 研究提示亚油酸通过激活 通路促进炎症反应，导致血管内皮细胞的损伤。在本研究中，红景天苷治疗作用下，及 蛋白表达均显著下降，红景天苷抑制血管生成，保护血管内皮细胞，预防冻伤的作用可能与 信号通路有关。随着对冻伤认识的深入及诊断水平的提高，冻伤药物的治疗研究取得很大进展，但是有许多新型药物仍处于动物实验阶段，且大多为外用剂型。在针对较重和较顽固的病例时，则更应选择内服方药进行预防和治疗。尤其是在选择治疗高原冻伤的药物时，预防和保护作用则更需重视。除了要具备温通散寒且补阳活血的特点以外，还需要具备保护内皮细胞，改善微循环损伤的作用。综上所述，红景天苷不仅能在一定程度上抑制慢性低氧后冻伤导致的皮肤组织病理损伤，抑制血管内皮细胞的损伤，促进血管内皮细胞的再生，还具有较好的舒血管作用。红景天苷药物的开发对于慢性低氧后冻伤的预防及治疗有十分重要的意义。【参考文献】周淑蓉，查选平，林妹，等应用 诊疗原则护理南方官兵赴北部寒区驻训冻伤的效果研究 海军医学杂志，（）：，：，（）：，（）：焦明克，楼林，胡稢，等普通冻伤与高原冻伤血液微循环恢复的差异 解放军医学杂志，（）：，（）：，（）：，（）黄钊高原低氧低温复合作用对大鼠血管内皮细胞的损伤及其防治作用的研究 天津体育学院，（）：梁俊清，徐海波，陈小娟，等通心络通过 信号通路改善血管内皮细胞缺氧损伤 中国病理生理杂志，（）：孙安琪，颜天华，巨修练红景天苷药理作用及分子机制的研究进展 时珍国医国药，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：张涵，陈海琪，赖世龙，等红景天苷对实验性高血压大鼠血管功能的影响 中国中医基础医学杂志，（）：王雪颖，王世坤，田铧，等炎性环境下内皮微粒介导单核细胞促内皮细胞增殖的作用 解剖学报，（）：于治利，关立克一氧化氮与血管内皮细胞功能障碍 吉林医学，（）：，：，（）：，（）：张黎，邱彦，芮耀诚，等缺氧对血管内皮生长因子诱导主动脉内皮细胞通透性增加的调控研究 药学实践杂志，（）：，（）：孙改霞，郭亚雄，杜会博，等失血性休克后的肠淋巴液提高血管通透性的作用 中国病理生理杂志，（）：，（）：，（）：，（）：中国应用生理学杂志，（）