DB21∕T 3253—2020 小反刍兽疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法(辽宁省).pdf

DB21宁省地方标准DB21/T3253一2020反当兽疫病毒实时荧光RT一PCR检测方法.220小ICsB41辽De v e l o p m e n tt h em e t h o do fr e a l一t i m ef l u o r e s c e n tRT一PCRf o rd e t e c t i o no fPPRV2020一04一30发布2020一05一30实施辽宁省市 场监督 管理局发布DB21/T3253一2020目、，生幽目叮舀.1范围.”2规范性引用文件.3缩略语.4原理.5仪器和器材.6试剂和引物.7操作步骤.8试验成立条件与结果判定9检测过程中防治交叉污染的措施10废弃物处理.IIDB21/T3253一2020士一口一Rl J本标准按照GB/ T1.1一2009给出的规则起草。本标准由动物卫生标准化技术委员会（辽宁）提出。本标准由辽宁省农业农村厅归口。本标准起草单位：辽宁省农业发展服务中心、洛阳莱普生信息科技有限公司、辽宁佰瑞生物科技有限公司。本标准主要起草人：邓文超、石霖、魏园 园、吴继阳、张皓淳、王冰、张鑫、王竹、刘金玲、董娜、高原、杨作丰、彭潇潇、姚伟、里里、陈腾、胡影。本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024一23447862;标准起草单位通讯地址：辽宁省动物及产品检疫中心（沈阳市沈河区万柳塘路105号甲），联系电话：024一24229579。DB21/T3253一2020小反自兽疫病毒实时荧光R丁一p CR检测方法范围本标准规定了小反色兽疫病毒实时荧光RT一PCR检测方法的技术要求。本标准适用于在生物安全IT级（BSL一2）以上的实验室进行小反当兽疫病毒病的诊断、监测及流行病学调查，适用于反色动物血液血清、淋巴结及口鼻棉拭子中小反当兽疫病毒核酸的RT一PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T19495.2一2004转基因产品检测实验室技术要求中华人民共和国农业部公告第302号（兽医实验室生物安全技术管理规范）农业部关于印发病死及病害动物无害化处理技术规范的通知（农医发201725号）3缩略语下列缩略语适用于本标准。PPRV：小反色兽疫病毒（PeSt ed e sPe t i t SRu m i n a n t Sv i r u s)RNA：核糖核酸（ri b o n u c1e1ca c i d)RNaSe：核糖核酸酶（ri b o n u C1e a s e)DEPC：焦炭酸二了酉旨（d1e t h y l p y r o Ca r b o n a t e)b p：碱基对（卜。、,p a i r)RT一PCR：反转录聚合酶链成反应（r e v e r s et r a n SCr i Pt i o np o l y m e r a s eCh a i nr e a Ct i o n)d NTP：脱氧核糖核营三磷酸（，二：！、x，一r1b o n u C1e o s i d et r i p h o s p h a t e)PBS：磷酸盐缓冲液（p h oSp h d t0b u厂，二So l u ti o n)TAE：三轻甲基氨基甲烷一乙酸电泳缓加；反（T一15a Cet a t e-EDTAb u f f e r)4原理本方法针对小反当兽疫病毒高度保守区域设计特异性引物刁训又针六反应体系中含小反当兽疫病毒基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCP过枉中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。5仪器和器材5.2台式冷冻离心机（离心范围O一20000r/m i n)冰箱：4士1，一20士1，一80士1DB21/T3253一20205.3全自动荧光定量PCR仪（ABI700O、ABI7300、ABI7500、ABI7900、BIO一Ra dCFX384To u c h、BIO一Ra dCFX96To u c h等）5.4离心管：15m L、1.5m L和0.2m L。5.5微量可调移液器：100一1000p L,20一200p L,10一100p L,5一50p L,2一20p L,0.5一10p L,0.2一2p L。6试剂和引物6.1RNA抽提试剂：Tr i Zo l外观为淡粉色，于4一SOC保存。6.2氯仿：一20预冷。6.3异丙醇：一20预冷。6.4DEPC水：去离子水中加入0.1 %DEPC,37作用1h或室温过夜，121士1C高压灭菌15m i n。6.575乙醇：用无水乙醇和DEPC水配制，一20预冷。6.6阳性对照：PPRV细胞培养物。6.7阴性对照：灭菌水。68Pr i m eSc r i p t TMo n eSt e pRT一PCRk i tVe r.2试剂盒。6.9PBS：磷酸盐缓冲液（0.02m o l/Lp H7.2）。6.10引物：用于RT一PCR反应的引物浓度为20pm o l/L。注：本标准中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用 的试剂等级均为不含RNA或RNa s e的分析纯或生化试剂；所有试剂均用无RNA酶污染的无菌的容器分装。7操作步骤7.1采样与样品的前处理7.1.1口鼻棉拭子样品采样时要将拭子深入口腔、鼻腔来回刮3一5伙，取：腔、鼻腔分泌液，将拭子放入有1.Om LPBS的离心管中备用。7.1.2血液或血清样品采用静脉采血方法，使用无菌注射器抽取羊只血液样品置于离心管中待杜或者静置后取上清待检。7.1.3淋巴结样品取少量样品（2一39）于研钵或匀浆器中研磨，加10m LPBS混匀，然后将研磨匀浆转入无菌离心管中，4，300Or/m i n离心10m i n取上清液转入无菌的1.5m L离心管中，编号待检。7.1.4存放与运输2DB21/T3253一2020采集或处理的样品在2一8条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置一80C冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6一8h之内运送到实验室检测。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。7.2荧光R丁一p CR检测7.2.1RNA提取RNA的提取可采用手动提取或者使用商品化试剂盒提取，但是注意提取时设立阳性对照、阴性对照。7.2.1.1手动提取RNA的操作步骤7.2.1.1.1将750pLTr i ZOI加入1.s m L灭菌离心管中，然后加入250p L待检样品，颠倒混匀后室温静置3一5m i n o7.2.1.1.27.2.1.1.2再加入250p L氯仿，混匀器上振荡混合155（或用手反复颠倒混匀）,4下1300Or/m i n离心15m i n。7.1.1.1.3小心吸取450p L上清液转移至装有500p L异丙醇的1.s m L灭菌离心管中，颠倒混匀。一ZOo C室温静置15m i n,4o C1300Or/m i n离心10m i n。7.1.1.1.4弃上清液，加入1m L75的DEPC乙醇，4OC下1300Or/m i n离心10m i n。重复洗涤2次。7.1.1.1.5400Or/m i n离心105，用微量移液器小心将残余液体吸干，室温干燥3一10m i n。7.1.1.1.6干燥后用20pLDEPC水溶解管壁上的RNA，冰上保存备用；若需长期保存应放置一70C冰箱。7.2.1.2试剂盒提取RNA严格按照合法的商品化RNA提取试剂盒说明书进行操作。7.2.2反应体系的配钊反应体系的成分：去离子水下，加1，上游引物PPRVF0.s u l，下游引物PPRVR0.s u l，探针PPRVP(1Ou m o l/L)0.s u l,ZXq PCR儿i:月t e r M,x12.s u l,Ta q聚合酶0.s u l，反转录酶0.s u l，加入PCR反应管后震荡离心混匀。7.2.3加样7.2.3.1打开PCR反应管盖，加入PCR反应液20以L，刀口夕、样平今汉5以L，阳性对照和阴性对照也各加5p L，记录加样顺序。7.2.3.2盖好PCR管盖，将PCR反应液与样本模板振荡混匀后，4OC,ZOG。二i n，离心105。7.2.3.3将PCR反应管转移到PCR区进行上机。7.2.4PCR过程7.2.4.1开机预热并检验仪器性能。7.2.4.2取样本准备区准备好的PCR反应管，放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序。DB21/T3253一20207.2.4.3按表1设置仪器扩增相关参数，进行PCR扩增表1仪器扩增相关参数体系信号采集反应体系设为25p L小反当兽疫病毒一FAM通道采集荧光信号。阶段条件循环数只dj土j土。只月任nInm15nmSC口j土gJL口乙U反转录预变性50C:反应条件95OC:95OC:55C:（此阶段结束时采集荧光信号）8试验成立条件与结果判定8.1试验成立条件阳性对照：Ct值蒸30，有明显指数增长，呈典型的S型曲线。阴性对照：Ct值43或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无明显指数增长期和平台期。试验成立，参考图如下：户1飞1！1i f i，二a t i o!1P1o t000.000750.000口一匡500.000司250.000户l之丈之二户亡：；户l汉从幻训匀！二亡奋二匀，8.2结果判定阳性：样本检测结果Ct值毛40，有明显指数增长，表明样本中栓恻出该病毒核酸；阴性：样本检测结果Ct值43或无Ct值，表明样本中未检测出该病毒核峻；可疑：样本检测结果Ct值在40一43范围，判定为可疑；此时应对样本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在40一43范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。结果分析后应保存当前的分析结果，记录好闽值和基线。9检测过程中防止交叉污染的措施DB21/T3253一2020按照GB/T19495.2一2004的规定执行。10废弃物处理按照农业部关于印发病死及病害动物无害化处理技术规范的通知（农医发201725号）规定执