焦磷酸测序.ppt

基因基因测序序 对对DNA分子的核苷酸排列分子的核苷酸排列顺顺序的序的测测定，也就是定，也就是测测定定组组成成DNA分子的分子的A、T、G、C的排列的排列顺顺序序。A-T-T-C-A-C-G-G-T-A-CA-T-T-C-A-C-G-G-T-A-C2.焦磷酸焦磷酸测序步序步骤一一PCRPCR二二焦磷酸焦磷酸测序序3.4.PCR 聚合聚合酶酶链链式反式反应应 亦称之亦称之为DNA扩增，增，是是DNA复制的体外模复制的体外模拟5.普通普通PCR实时荧光定量光定量PCR6.PCR反反应的基本步的基本步骤 高温高温变性性 低温退火低温退火 适温延伸适温延伸l 具有特异性具有特异性强强、灵敏度高、操、灵敏度高、操作作简简便、省便、省时时等特点等特点7.一、一、PCR反反应应的条件的条件1、一定的、一定的缓缓冲溶液；冲溶液；2、DNA模板；模板；3、分、分别别与两条模板与两条模板链链相相结结合的两种引物；合的两种引物；4、四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸：4种种dNTP混合物混合物；5、耐、耐热热的的DNA聚合聚合酶酶；6、控制温度（控制温度（PCR重要条件）重要条件）。8.二、二、DNA变变性和复性性和复性 在在80-100的温度范的温度范围围内，内，DNA的的双螺旋双螺旋结结构将解体，双构将解体，双链链分开，分开，这这个个过过程称程称为为变变性性；当温度；当温度缓缓慢降低后，慢降低后，两条彼此分离的两条彼此分离的DNA链链又会重新又会重新结结合合成双成双链链，这这个个过过程称程称为为复性复性。9.三、复制方向（三、复制方向（53）1、DNA分子的分子的3端与端与5端：端：-OH端端为为3;磷酸基磷酸基团团的末端的末端为为5。2、DNA分子由两条反向平行的脱氧核分子由两条反向平行的脱氧核苷酸苷酸链链根据碱基互根据碱基互补补配配对对原原则则形成形成氢键氢键连连接而成。接而成。10.1 1、DNA聚合聚合酶酶催化催化2 2、DNA的延伸方向的延伸方向:5-311.四、引物四、引物问题问题1、两种引物两种引物：DNA或或RNA，长长度度15-30bp，常用常用为为20bp左右。左右。2、原因原因：DNA聚合聚合酶酶不能从不能从头头开始合成开始合成DNA，只能从，只能从3端延伸端延伸DNA链链。12.五、五、PCR过过程程变变性性 复性复性延伸延伸1、变变性：当温度上升到性：当温度上升到90 以上以上时时，双，双链链DNA解解为单链为单链。13.2、复性：温度下降到、复性：温度下降到50 左右，两种引物左右，两种引物通通过过碱基互碱基互补补配配对对与两条与两条单链单链DNA结结合合14.3、延伸：温度上升到、延伸：温度上升到72左右，溶液中的左右，溶液中的四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在在DNA聚合聚合酶酶的作用下，根据碱基互的作用下，根据碱基互补补配配对对原原则则合成新合成新的的DNA链链。15.4、循循环环特点：特点：上一次循上一次循环环的的产产物物为为下一循下一循环环的模板的模板 结结果果单链单链中有最初母中有最初母链链的只两的只两条（无引物存于两个子代条（无引物存于两个子代DNA分分子中子中），其它子代，其它子代DNA分子都分子都为为双引物分子双引物分子 处处于两引物之于两引物之间间的的DNA序列呈序列呈指数增指数增长长12N16.焦磷酸焦磷酸测序序17.18.19.峰形峰形图 峰高与峰高与结合模板的合模板的dNTPdNTP数量成正比数量成正比 原始数据会被原始数据会被软件自件自动转化化为序列信息序列信息20.21.22.